Laboratorieskala Produktion och rening av en terapeutisk antikropp

Summary

Detta protokoll beskriver framställningen av en terapeutisk antikropp i ett däggdjursexpressionssystem. De metoder som beskrivs bland annat framställning av vektor-DNA, stabil transfektion och serumfritt anpassning av en human embryonal njure 293-cellinje, som inrättades av storskaliga kulturer och rening med hjälp av affinitetskromatografi.

Introduction

Framgången av terapeutiska antikroppar fortsätter att driva stora investeringar i utveckling av antikroppsläkemedel som en våg av nästa generations läkemedel börjar. Marknaden antikroppen förväntas vara omformas genom antikroppsfragment ^1, antikropp-läkemedel-konjugat ^2, bispecifika antikroppar ³ och manipulerade antikroppar med fördelaktiga egenskaper ^4. En annan klass vinner farmaceutiskt intresse är biosimilars. Jämförbara biologiska antikroppar är "mycket lika" replikera produkter av en terapeutisk antikropp som redan har erhållit godkännande. En föreslagen biologiskt likartat måste vara jämförbar med upphovsantikroppen med avseende på dess struktur, funktion, djur toxicitet, klinisk säkerhet och effektivitet, farmakokinetik (PK), farmakodynamik (PD) och immunogenicitet ^{5, 6.}

Godkännande rates av biologiskt likartade antikroppar har varit långsamma på grund av de strikta begränsningar på den slutliga produktens kvalitet. De exakta tillverkningsprocesser såsom specifik cellinjer och odlingsbetingelser genom att de sista processtegen kan förbli äganderätt. Vad mera är, tillverkning av antikroppar innebär i sig en viss variation som kan lägga till utmaningen att producera en mycket liknande produkt. En omfattande fysikalisk-kemiska och biofysikalisk karaktärisering och jämförelser är ganska svårt, men ett antal studier som visar egenskaperna hos biosimilar antikroppar växer fram i litteraturen ^{7, 8, 9.}

Generering av en terapeutisk antikropp börjar med transfektion av däggdjursvärdceller med en vektor som bär generna för respektive antikropp. Vektordesign, cellinje och odlingsbetingelser är nyckelfaktorer för att ställa in frittpression systemet.

DNA-sekvenser av antikroppar kan hämtas från Läkemedels Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) eller forskningspublikationer inklusive patent. Till exempel är sekvensen av trastuzumab tillgängliga via Drug Bank (DB ID: DB00072). Aminosyrasekvensen av de variabla regionerna kan undergå gen design och optimering för syntes i de önskade värdarten. Det är viktigt för ett jämförbart biologiskt antikropp att ingen modifiering sker till aminosyrasekvensen. När syntetiserats kan antikroppsgener subklonas in i lämplig vektor val.

Humana IgG-antikroppar består av två identiska tunga kedjor och två identiska lätta kedjor. Hårt reglerad expression av båda kedjorna är viktigt för optimal produktion av heterologt IgG protein i däggdjursceller ^10. Inträ- såväl som mellan kedjor disulfidbindningar måste formas och ett antal post-translationella modifieringar måste vara iintroducerats under biosyntesen protein. Ett antal vektorer finns tillgängliga som har utformats speciellt för att uttrycka antikroppsgener (se tabell of Materials). Dessa antikroppsspecifika vektorer uttrycker vanligtvis de konstanta regionerna för både tunga och lätta kedjor så att endast de variabla regionerna av varje kedja kräver kloning.

Transfektion av celler med två oberoende konstruktioner (co-transfektion) är det vanligaste tillvägagångssättet för att leverera tung och lätt kedja-kodande gener. Det vill säga, varje gen driven av sin egen promotor och transkriberades som separata antikroppskedjor innan de monteras i det endoplasmatiska retiklet. Å andra sidan, multi-cistronic vektorer har interna ribosominträdesställe (IRES) element som ingår som tillåter uttryck av multipla gener som ett enda mRNA-transkript med översättning tillåtet från interna regioner av mRNA ^11. I detta fall är de tunga och lätta kedjan som kodar för gener kopplade i en Arrangement att uppnå sam-expression av båda antikroppskedjorna ^{10, 12.}

Medan övergående transfekterade celler ger tillräckligt med protein för att utföra ett begränsat antal experiment, kan stabilt transfekterade cellinjer som har genomgått val för genom integration ger högre avkastning. Högre proteinmängder möjliggöra metodutveckling avseende in vitro karakterisering och kan ge en indikation på antikropps kvalitet med hänsyn till tillämpningar nedströms såsom klonal cellinje och bly val kandidat.

Målet med denna artikel är att beskriva den stabilt uttryck och rening av en terapeutisk antikropp som produceras i en däggdjursexpressionssystem. I själva verket kan denna metod tillämpas på uttrycket av ett biologiskt likartat antikropp. Metoden kan användas för den första karakterisering av antikroppar innan man fortsätter vidare till den kritiska, om än tidskrävande steps för identifiering av en önskvärd klon för större skala tillverkning. Dessutom kan denna metod användas för att uttrycka andra proteiner och inte bara antikroppar.

Den följande detaljerade protokoll beskriver expressionen av terapeutisk antikropp trastuzumab. Denna består av framställning av vektor-DNA följt av stabil transfektion i HEK-293-cellinjen och rening av antikropp-proteinet genom en automatiserad kromatografisk metod.

Protocol

OBS: En lämplig däggdjursexpressionsvektor måste användas för detta protokoll. Här används en enda konstruktion innehållande två expressionskassetter som används (dvs. tung och lätt kedja expression drivs av separata promotorer). Trastuzumab tunga och lätta kedjor har tidigare klonats in i vektorn. Denna vektor var en gåva från Andrew Beavil, som erhållits genom en icke-vinstdrivande plasmid förvaret ^13.

1. Återkravet och skala upp Vector DNA

OBS: Vektor-DNA togs emot som en mjuk agar stab kultur i Escherichia coli XL-1 Blue-stammen; Vektorn bär hygromycinresistens.

1. Sätt en steril ympning hugg eller slinga i den mjuka agar av hugg kulturen sedan spruta på en Luria Bertani (LB) agarplatta framställd med 75 mikrogram / ml hygromycin för isolerade kolonier. Inkubera plattan vid 37 ° C under 18-24 h.
2. Inokulera en enda koloni i 5 ml Terrific Broth (TB) innehållande 75 | ig / ml hygromycin. Incubate kulturen vid 37 ° C under 18-24 h med 225 rpm skakning.
3. Använda övernattskultur för att framställa ett glycerolförråd av vektor-DNA genom att försiktigt blanda 800 | il av kultur med 200 ^ il 80% glycerol i en cryovial och frys vid -80 ° C.
   1. Tillsätt 100 | il av övernattskultur till 100 ml TB innehållande 75 ^ g / ml hygromycin i en bafflad skakkolv (dvs. 1/1000 utspädning). Inkubera kulturen vid 37 ° C under 18-24 h med 225 rpm skakning.
4. Efter odling över natten, extrahera och rena DNA enligt tillverkarens anvisningar midi / maxi förberedande kit med följande undantag; under det slutliga steget, eluerar eller återsuspendera DNA med vatten (pH 7,0-8,5).
5. Kontrollera koncentrationen och renheten hos DNA genom absorbansmätningar vid 260 och 280 nm sedan lagra DNA vid -20 ° C.
   OBS: Valfri (rekommenderas): Sekvens DNA med vektorspecifika primers för att bekräfta identiteten.

2. Stabil transfektion av HEK-293-celler

1. Växa och behålla HEK-293-celler (suspensionsceller) enligt standardprotokoll i serumfria media kompletterade med 0,1% icke-joniskt ytaktivt medel i Erlenmeyer-kolvar. Bibehålla åtmin 2 x 10 ⁵ celler / ml och subkultur var fjärde dag. Odlingsceller vid 37 ° C med 5% _CO2 och 120 rpm rotation.
   OBS: Celler borde ha varit i odling för inte mindre än fyra dagar och inte mer än 4 veckor före transfektion. HEK-293-celler odlas som monoskikt i seruminnehållande media kan även användas för detta förfarande.
2. På dagen före transfektion, utsädes HEK-293-celler vid 3 x 10 ⁵ celler / ml i brunnar på en 12-brunnars platta i 2 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum ( FBS). På dagen för transfektion, kontrollera att cellerna har nått 80-90% konfluens
3. Späd DNA och polyetylenimin (PEI) separat i transfektion media sedan blanda ihop.
   1. Späd 1,25 mikrogram vektor-DNA per brunn (15 mikrogram för 12 brunnar) i 300 pl transfektion media. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
   2. Späd 2,5 | il av 1 mg / ml PEI-lösning (30 pl för 12 brunnar, dvs 1: 2-förhållande av DNA till PEI) i 300 | j, l transfektion media. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
   3. Lägg utspädd DNA till utspädd PEI, blanda försiktigt och inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
4. Tillsätt 50 pl av DNA / PEI blandningen droppvis till varje brunn i plattan. Vagga plattan försiktigt för att fördela transfektionsblandningen placera sedan plattan vid 37 ° C, 5% _CO2 under 24 timmar.
5. Tillsätt 50 | ig / ml hygromycin B per brunn och retur plattan till 37 ° C, 5% _CO2 under 10 dagar.
   OBS: Vid dag 10, kommer un-transfekterade celler har dött och lösgöras från ytan av plattan, medan stabilt transfekterade celler kommer att vara livskraftig och fastsatt vid plattan.
6. Byt ut media i brunnar med1/4 volym serumfria medier och 3/4 volym DMEM kompletterat med 10% FBS (dvs. 0,5 ml serumfritt medium + 1,5 ml DMEM = 7,5% slutlig serumkoncentration) och inkubera under 4 dagar.
7. Byt ut media i brunnar med 1/2 volym serumfritt medium och 1/2 volym DMEM kompletterat med 10% FBS (dvs. en ml serumfritt medium + 1 ml DMEM = 5% slutlig serumkoncentration) och inkubera i 4 dagar.
8. Byt ut media i brunnar med 3/4 volym serumfritt medium och 1/4 volym DMEM kompletterat med 10% FBS (dvs 1,5 ml serumfritt medium + 0,5 ml DMEM = 2,5% slutlig serumkoncentrationen) och inkubera i 4 dagar.
9. Ersätta media i brunnarna med 2 ml serumfritt medium som kompletterats med 0,1% icke-joniskt ytaktivt medel (dvs. 0% slutlig serumkoncentration) och inkubera under 4 dagar.
   OBS: Bibehåll 50 | ig / ml hygromycin B selektivt tryck på celler under serumfria anpassning. Celler anpassade till serumfria medier lossnar från ytan av brunnarna och kan kluster in suspension. Se steg 2,1 för odlingsbetingelser med ytterligare tillägg på 50 mikrogram / ml hygromycin B.
10. Med hjälp av en pipett försiktigt blanda suspensionsodlingar i 12-brunnar och pool celler i ett separat rör.
    1. Med användning av en hemocytometer, enumerate poolade celler och utsäde i 30 ml serumfritt medium i en Erlenmeyer-kolv vid 2 x 10 ⁵ celler / ml. Odlingsceller vid 37 ° C med 5% _CO2 och 120 rpm rotation. Subkultur och expandera var fjärde dag.
11. Fortsätter att expandera kultur storlek krävs celldensitet för att erhålla 10 flaskor med 1 x 10 ⁷ celler / flaska för frysförvaring i flytande kväve. Frysa cellerna i serumfria media innehållande 10% dimetylsulfoxid (DMSO).
    OBS: Konditionerade media som innehåller antikropp kan skördas vid varje subkultur för att bekräfta proteinproduktion eller används för att optimera reningsbetingelser. Att skörda konditionerat medium och underhålla celler för subkultur, centrifugera kulturen på300 xg under 5 minuter och filtrera-sterilisera supernatanten genom ett 0,22 pm filter. Filtrerade supernatanten kan hållas vid 4 ° C under 1-2 veckor eller -20 ° C under en längre tid.

3. Storskalig antikroppsproduktion från Batch växa över Culture

OBS: Antikroppsproduktion kan följas på från steg 2,11 där befintliga celler expanderas till önskad celltäthet baserad på sats växa över odlingsvolymen att ställas in. Annars, celler som har upptinats från kryokonservering börjar i detta skede en gång expanderas till en lämplig celldensitet och volym. Olika odlingstillskott kan användas för att optimera antikroppsproduktionen; användningen av trypton att öka antikropps avkastning demonstreras i detta protokoll.

1. Utsädes celler vid 2 x 10 ⁵ celler / ml i 100 ml serumfritt medium i två Erlenmeyer-kolvar (att jämföra utbytena antikropps från un-kompletteras och närings kompletterade odlingar). Odling vid 37 ° C, 5% _CO2
2. Efter 24 timmar, tillsätt trypton till en slutlig koncentration av 0,5% till näringstillskott kultur. Utjämna volym un-kompletterat kultur med serumfritt medium.
3. Från dag 8, utföra cellräkningar av kulturerna dagligen med en hemocytometer för att övervaka cellernas livskraft. Skörda odlingssupernatanterna gång cellviabilitet är mindre än 80%.
   1. Skörd supernatanten genom centrifugering av odlingarna vid 3000 x g under 15 minuter och filtrera-sterilisera supernatanten (innehållande antikropp) genom ett 0,22 pm filter. Förvara supernatanterna vid 4 ° C (kortvarig) eller frysa vid -20 ° C (på lång sikt).

4. Antikropp Rening genom affinitetskromatografi med användning av ett automatiserat Snabb Protein Liquid Chromatography (FPLC) System

OBSERVERA: Följande förfarande kan i allmänhet appliceras på de flesta automatiserade system. Rening kan utföras vid rumstemperatur eller vid 4 ° C (om FPLC-system hålls i ett svalt rum).En serie av scouting tester kan utföras för att identifiera de optimala reningsbetingelser inklusive lämplig kolumn matris, bindningsbuffert, elueringsbuffert och pH för att säkerställa maximal återhämtning av renad antikropp från konditionerat medium (se avsnittet Resultat). De optimala förhållandena är beroende av antikroppen eller proteinet att renas. Reningar utfördes på ett automatiserat FPLC-system. Reningar utfördes vid rumstemperatur med användning av en 5 ml Protein A-kolonn.

1. Förbered följande buffertar med hjälp av ultrarent vatten och anpassa sig till den rekommenderade pH sedan filtrera genom ett filter av 0,22 pm.
   1. Förbereda ett L av fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) pH 7,4 (bindningsbuffert) genom att blanda följande: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na ₂ HPO ₄ och 0,001 M KH ₂ PO _4. Justera pH om nödvändigt före filtrering bufferten.
   2. Bereda 500 ml av 0,1 M glycin-HCl pH 2,7 (elueringsbuffert). Justera pH före filtrering av den buffer.
   3. Förbered 50 ml av 1 M Tris pH 9,0 (neutralisering buffert).
2. Se till att alla systemeffekt och kommunikationsförbindelser med datorn görs. Enheter ska synas i programmet "System Control" modul. Se till att UV-cell är satt till 280 nm våglängd. Valfritt: Kalibrera pH-mätare om den är ansluten och användas.
3. Doppa inlopps rör av A, B och provtagningspumpen i ultrarent vatten för att tvätta systemet. Rensa pumparna med en spruta om det finns luft i slangen eller misstanke om luft i systemet. Tvätta systemet med vatten genom manuell drift via systemstyrenheten eller via en automatiserad metod. Observera att trycket, konduktivitet, UV280 spårning och pH vara konsekvent och att tryckgränsen för kolumnen inte överskrids enligt tillverkarens specifikation.
   OBS: Avvikelser kan indikera luft eller blockering i systemet som bör åtgärdas innan du fortsätter.
4. I systemstyrenheten modulen, starta flöde vid enml / min manuellt via pump A i endera lasten (förbiprovslinga) eller injicera (genom öglan prov) position för att börja att ansluta kolonnen. Koppla systemet rör vid kolumnposition inloppet och ta bort proppen ansluten till kolonnens inlopp.
   1. Låt vattnet rinna ur systemet slangen droppvis på toppen av kolonnen sedan bifoga systemslangen till kolonnen. Att ha kolonninloppet och inloppsanslutningen överfyllda med vattendroppar ger en förbindelse fri från luftbubblor.
5. Fäst kolumnen utlopp vid nedströms utloppet och kontrollera alla kopplingar är ordentligt fastsatta. Med kolonnen nu anslutna till systemet, inte överskrida gränsvärdena för maximal gräns tryck och flöde som anges i kolumn specifikationer.
6. Tvätta kolonnen med 5 kolonnvolymer (CV) vatten. Om det är nödvändigt, fortsätta kolumn diskningen tills UV280 spårning har stabiliserats.
7. Sänk inloppsrören i A i bindningsbuffert, B i elueringsbuffert och provtagningspumpen i bindningsbuffert to jämvikt systemet rätt buffertar. Fyll inloppsrören med buffert med användning PumpWash genom manuell påverkan.
8. I "Method Editor-modulen av programvaran, använda metoden guiden för att installera en affinitetskromatografi metod för den kolumn som är avsedd att användas.
   OBS: Automatiserad FPLC system kommer med metoder förfyllda med de rekommenderade inställningarna (dvs. flödeshastighets och tryck limit) och köra steg baserat på kolonnen (tillverkare, matris och storlek) ut för rening.
   1. Använd följande körnings steg för protein A affinitetskromatografi:
      1. Jämvikt systemet med 5 CV av bindningsbuffert och samla genomflöde i avfallsbehållare.
      2. Belastningsprov på kolonnen (volym som skall lastas anges manuellt i metoden) och samla genomflöde i en separat behållare.
      3. Tvättsystem med 5 CV av bindningsbuffert och samla genomflöde i en separat behållare.
      4. Eluera kolonnen med 5 CV isocratic fraktionering med användning elueringsbuffert och samla renat prov antikropp såsom fraktioner genom fraktionsuppsamlare.
      5. Jämvikt systemet med 5 CV av bindningsbuffert och samla genomflöde i avfallsbehållare.
9. När metoden har varit installationen anger volymen av konditionerade media som skall appliceras på kolonnen och spara metoden.
   OBS: Den angivna volymen i metoden bör vara 5-10 ml mindre än den faktiska volymen för att undvika införande av luft under provkörningen. Den angivna volym som används i detta protokoll är 90-120 ml.
10. Dränka provet pumpslangen in i kärlet som innehåller det konditionerade mediet.
11. Förbered en separat behållare för att samla in provgenomflödet via den angivna utloppsröret.
    OBS: Det är viktigt att samla genomflödet när det gäller ett fel uppstår under körningen eller bindningskapaciteten hos kolonnen överskrids kräver genomflöde som ska appliceras på nytt till kolonnen eller renings repeated.
12. Förbered uppsamlingsrör i fraktionssamlaren. Tillsätt 100 pl av neutralisering buffert per 1 ml fraktion volym. FPLC-systemet kommer automatiskt att eluera fraktioner in i uppsamlingsrören.
13. I "System Control" modul av programvaran, öppna metoden som ska köras.
    OBS: Metoden run initieras i en serie sidor som bland annat ska kontrollera variabler av metoden, fraktionssamlaren installation och definierar resultat filnamn och lagringsplats.
14. Klicka på START för att starta körningen. Körningen kan övervakas i "System Control" modul.
15. Vid slutförandet av renings sikt kontrollera den resulterande kromatogrammet i "Utvärdering" modul i systemprogramvaran.
16. Kombinera alla proteininnehållande fraktionerna in i ett separat rör, buffertbyte och koncentrera i PBS med användning av en centrifugal-filteranordning med 30 kDa molekylvikt avskuren. Utför centrifugeringssteg enligt tillverkarensinstruktioner.
17. Mät antikroppskoncentration med hjälp av bicinkoninsyra analys (BCA) i enlighet med tillverkarens instruktioner.
18. Om en annan reningskörning skall utföras, prime provet pumpslangen i bindningsbuffert och upprepa steg från 4,9 till 4,14.
19. Vid slutförandet av reningskörningar, sänk inloppsrör av A, B och provtagningspumpen i ultrarent vatten och tvätta systemet och kolumn som utförs i steg 3.
20. Dränka A, B och provtagningspumpen rör i 20% etanol och upprepa tvättprocedur för lagring av systemet och kolumn.
21. Koppla kolonnen från nedströms utloppet och ersätta kolumn propp, sedan koppla kolonnen vid inloppet och ersätta proppen, anslut slangen till systemet. Lagra kolonnen vid 4 ° C.

Representative Results

Stabil produktion av trastuzumab genom transfekterade HEK-293-celler bekräftades med användning bio-skikt interferometri (BLI) som presenteras i figur 1. En IgG standardkurva genererades genom att mäta bindningshastigheten mellan en IgG-antikropp standard och protein A biosensor (Figur 1A). Den råa supernatanten Provet likartad mätning, då dess koncentration interpoleras från standardkurvan (Figur 1B). Supernatanten Koncentrationen mättes vara ungefär 25 | ig / ml (prov från 50 ml insamlats på subkultur) två veckor efter serumfritt anpassning och före inrättande celler för växa över satskulturer.

Supernatant vid varje subkultur efter serumfritt anpassning slogs samman och användes för att optimera reningsbetingelser; scouting av bindnings- och elueringsbuffertar utfördes såsom visas i Figur 2 figur 2A baserat på UV280 signal. När Protein A-kolonn i jämvikt, innebär en ökning av UV280 signalprovladdning; Ökningen beror på att supernatant genomströmnings passera genom kolonnen (innehållande obundna proteiner som absorberar UV-ljus vid denna våglängd), medan antikroppar har fångats av kolonnen. När provet har lästs in återgår UV280 signalen till baslinjen som eventuella återstående obundna proteiner tvättas bort. Eluering sker som pH minskar till det optimala pH-värdet för att frigöra antikropparna fångas upp av kolonnen, som avbildas av en ökning av UV280 signal med eluerade antikroppar fraktionerade ut av fraktionssamlaren. Under hela provkörningen bör ledningsförmåga ändras beroende på saltkoncentrationen i buffertarna medan systemtrycket förblir relativt konstant. Optimal eluering, pH och buffert Oscoutade först (Figur 2B); konstaterades att antikropp eleras mer effektivt från kolonnen vid lägre pH med användning av antingen 0,1 M glycin-HCl eller citronsyra. Dock under pH 2,7 fanns det ingen ytterligare förbättring av elueringsprofilen. Dessutom verkade elueringsbetingelser toppar med 0,1 M glycin-HCl mindre breddas i jämförelse med 0,1 M citronsyra vid liknande pH (Figur 2B). Därefter tillsattes 0,1 M glycin-HCl pH 2,7 buffert som användes för att optimera bindningsbuffertbetingelser (Figur 2A). Effekten av olika bindningsbuffertar vid eluering jämfördes också (Figur 2A). Det observerades att PBS pH 7,4 och 20 mM natriumfosfat pH 7 hade jämförbara elueringsprofiler, medan tillsats av 3 M NaCl till natriumfosfatbuffert (för att förbättra antikroppsbindning till kolonnen) var inte gynnsamma. På grund av lättheten att PBS-buffert preparat mättes PBS pH 7,4 väljs som bindande buffert för framtida reningar.

Renings kromatogram av parti växa över Cultures visas i figur 3; trypton-kompletterade kulturen jämförs med un-kompletterade kulturen. Det konstaterades att tillsatsen av trypton till den kompletterade kulturen resulterade i en ökad UV280 signal under provladdningssteget, jämfört med icke-kompletterat kultur. Den trypton-kompletterade kulturen gav 3,8 mg och FN-kompletterade odlings 1,7 mg trastuzumab, baserat på protein återhämtat sig efter buffertbyte och koncentration. Kvalitetskontroll av den renade antikroppen bekräftades genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) som visas i Figur 4. Trastuzumab odlas i un-kompletteras och trypton-kompletterade betingelser resulterar i liknande profiler antikropps under icke-reducerande och reducerande betingelser. Som väntat, en framträdande band vid ungefär 150 kDa bekräftar korrekt vikta antikropp; andra band representerar fragmenterade former av antikroppen, ett resultat av disulfidbindning brott och en metod-inducerad artefact. Likaså två band vid 50 och cirka 25 kDa bekräfta närvaron av antikroppens tunga och lätta kedjor, respektive.

Figur 1: Bekräftelse av proteinproduktion genom stabilt transfekterade HEK-293-celler med användning av bio-skikt interferometri (BLI). (A) Standardkurva genererades genom att mäta bindningshastighet IgG-antikroppar standard protein A biosensor över 120 sekunder (grå) följt av rå supernatant prov av PEI-transfekterade trastuzumab (PEI-Tmab, svart). (B) Koncentration av antikroppsprotein i rå supernatant (öppen svart cirkel) interpolerades från standardkurvan (slutna svarta cirklar) genom att rita IgG-antikropp standardkoncentration kontra bindande takt. Klicka här för att se en större version av denna f igure.

Figur 2: Rening kromatogram av elution och bindningsbuffert spana experiment. (A) Stegen för rening utseende beroende UV280 signal (blå, gröna eller svarta linjer); provladdning på kolonnen, följt av kolonn tvätta att tvätta bort obundna proteiner sedan eluering av bundet protein från kolonnen. Mätning av pH (röd linje), konduktivitet (brun linje) och systemtryck (grå linje) övervakas genom hela körningen. Tre buffertar testades för optimal bindning av trastuzumab till kolonnen och borttvättning av obundet protein att maximera eluering utbyte. (B) 0,1 M glycin-HCl (pH 2,5-3,3) och 0,1 M citronsyra (pH 2,5 till 3,5) buffertar testades för optimal eluering av trastuzumab från protein A-kolonn.target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Rening kromatogram av trastuzumab (TmAb) parti växa över kulturer odlade utan tillägg eller kompletteras med trypton. Stabilt transfekterade HEK-293-celler var setup på 2 x 10 ⁵ celler / ml och odlades under 8 dagar antingen un-kompletterad (120 ml; svart linje) eller kompletteras med 0,5% trypton (90 ml; grön linje). Efter skörd var supernatanter renas med användning av PBS pH 7,4 (bindningsbuffert) och 0,1 M glycin-HCl pH 2,7 (elueringsbuffert). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4: Analys av renat trastuzumab genom SDS-PAGE. Cirka 2 pg av trastuzumab renat från un-kompletterat (-) eller trypton-kompletterat (+) kulturer togs prov med 10% SDS-PAGE under icke-reducerade eller reducerade betingelser. Gelén färgades med Coomassie R-250. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta protokoll specificerar transfektion, stabil uttryckning och rening av en terapeutisk antikropp i HEK-293-celler. Stabilt uttryck av antikroppsgener är det första steget vid generering av en antikroppsproducerande cell-linje för utveckling och tillverkning av en terapeutisk antikropp. Medan kinesisk hamsterovarie (CHO) celler förblir uttrycket plattform som väljs för terapeutiska proteiner, är den HEK-293-cellinjen få en framträdande plats med insikten att proteiner producerade i dessa celler är en bättre matchning till naturligt förekommande humana proteiner, i termer av inlägget -translational modifieringar och funktion ^{14, 15.}

Däggdjurscellinjer inkluderande CHO (t.ex., CHO-DG44 och CHO-K1) såväl som icke-immunoglobulin-utsöndrande murina B-cellinjer NS0 och SP2 / 0 är till övervägande del används i biofarmaceutisk produktion. Expressionssystem baserade på dessa cellinjer är baserade på val proccesser där högproducerande kloner induceras och utvalda genom stegvis tillsats av en specifik selektiv drog ^{16, 17.} Urvalsförfarandet för en stabil klon kan därför vara mödosam och tidskrävande. I jämförelse med dessa befintliga metoder, HEK-293-cellinjen transfects robustly med hög effektivitet. Urvalsprocessen förenklas och mycket lätt anpassar sig till serumfri suspensionskultur, vilket gör det till en idealisk expressionssystem för laboratorieskala produktion av proteiner ^18.

En begränsning med stabil transfektion är tid vid vilken en praktisk mängd protein kan produceras och utnyttjas i experiment. Att försöka lösa detta, beskriver det nuvarande protokollet ett odlingssteg som kan uppnå betydande mängder protein inom 3-6 veckor efter transfektion. Satsen växa över kulturer (storskalig produktion) ger möjlighet att producera stora mängder avantikropp för installationen av in vitro karakterisering experiment i ledningen till valet av en klonal cellinje och leda kandidater. Detta har klara fördelar jämfört med övergående transfektion, vilket kan kräva högre mängder DNA och reagens. Dessutom är proteinutbytet inte reproducerbar från sats till sats, eftersom uttrycket är bara tillfälligt och bestäms av transfektion effektivitet.

Tillsatsen av trypton i detta protokoll gav en ökad avkastning på proteinuttryck. Tillsats av trypton transfektion kulturer har tidigare visats att förbättra proteinsyntes ^{19, 20.} Den trypton kompletterade kulturen lett till förbättrade trastuzumab utbyten av 40 mg / L jämfört med icke-kompletterat kultur 14 mg / L (Figur 3) antikroppar. SDS-PAGE kontrollerat att: (1) antikroppen som produceras korrekt; och (2) tillsats av trypton inte förändrar strukturen bygger på comjämförelse av antikroppen band under icke-reducerande och reducerande betingelser (Figur 4). Tillsatsen av trypton till kulturerna är valfri och används särskilt för att uppnå högre proteinutbyten. Andra kosttillskott har ansetts öka proteinuttryck såsom natriumbutyrat och valproinsyra ^{21, 22, 23.}

Den första kontrollpunkten i protokollet är en bekräftelse på att proteinet produceras av transfekterade cellinje. Detta steg kan utföras när som helst efter det att två-veckors period av selektivt tryck används för att välja stabila transformanter. Ett antal metoder kan användas för att bekräfta proteinproduktion inklusive bio-skikt interferometri (figur 1) eller liknande tillvägagångssätt av en IgG ELISA. Alternativt kan en western blot utföras med användning av en anti-IgG-detektionsantikropp för att identifiera antikroppsprotein i rå supernatanteneller renas prov.

Andra forskare har visat att högre effektivitet transfektion uppnås med användning av fastsittande celler i seruminnehållande medium ^24. Närvaron av tillskott från animaliskt ursprung inte är önskvärt för biofarmaceutisk produktion. Därför sekventiella anpassning till serumfria medier är ett kritiskt steg i protokollet kräver tålamod och noggrann kontroll av cellernas livskraft. Perioden 4-dagars omsättning föreslås i detta protokoll är en guide och så om problem uppstår vid en viss serumkoncentrationen rekommenderas att cellerna subkultiveras 2-3 gånger i tidigare förhållandet mellan seruminnehållande till serumfritt medium innan du fortsätter med nästa förhållande. Före inrättandet av satskulturer och frysförvaring av celler, anser att de flesta cellinjer anses helt anpassade efter tre subkulturer i 100% serumfria medier.

En av de mest avgörande steg vid reningssteget är than scouting för optimala förhållanden och buffertar för att säkerställa en effektiv bindning av antikroppen till kolonnen och sedan fullständig eluering från kolonnen (Figur 2). Det konditionerade mediet uppsamlades vid varje subkultur är användbara för detta ändamål. I detta fall, elueringsbufferten av citronsyra pH 3,5 rekommenderas generellt för protein A-affinitetskromatografi var olämpliga för eluering av trastuzumab från kolonnen. Scouting experiment med användning av två olika elueringsbuffertar vid olika pH visade tydligt att det även inom det smala området av pH testades, var graden av eluering påverkas (figur 2B).

När det gäller nedströms bearbetning av antikroppsfraktioner efter rening, antikroppen kan buffertutbyte med hjälp av en avsaltningskolonn antingen genom manuell eller automatiserad drift. Alternativt, kan också användas dialysmembran. Slutlig proteinkoncentration kan bestämmas genom andra protein kvantifieringsmetoder inklusive mätningav absorbansen signalen vid 280 nm med koncentrationen härledas från Beer Lamberts lag baserat på extinktionskoefficienten för antikroppen.

Detta protokoll har framgångsrikt producerat antikroppsprotein av trastuzumab genom stabil transfektion av HEK-293-celler. Antikroppen renades och karakteriserades för att bekräfta integriteten. Stegen i detta protokoll detaljer DNA-preparation, kan stabil transfektion, följt av serumfritt anpassning, storskalig produktion och automatiserad rening överföras till att producera andra proteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFUSE vector series	InvivoGen	N/A	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	Lonza		Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Addgene	61883	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	Sigma-Aldrich	G6279	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose	Life Technologies	11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	Life Technologies	10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	Polysciences, Inc.	23966	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (casein peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Citric Acid, monohydrate	Astral Scientific	BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	fortéBIO	45-5000	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	fortéBIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	Astral Scientific	786-502
Ammonium Persulfate (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	Bio-Rad	1610374