Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Синтез 1,2-Azaborines и подготовке их белковых комплексов с Т4 лизоцима Мутанты

Published: March 25, 2017 doi: 10.3791/55154
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Boston College

Introduction

Бором азотсодержащие гетероциклы (например , 1,2-azaborines) недавно обращено значительное внимание как изостерами аренов. Это isosterism может привести к изменению существующих структурных мотивов для расширения химического пространства 2, 3, 4. Azaborines имеют потенциальную полезность для применения в биомедицинских исследованиях , 5, 6, 7, 8, особенно в области медицинской химии , в которой химики осуществляют синтез библиотек структурно и функционально соответствующих молекул. При этом , однако, в то время как существуют многочисленные хорошо развитые путей синтеза , доступных аренов , содержащих молекулы, только ограниченное количество методов синтеза azaborines было зарегистрировано 9, 10, 11, 12, 13. Это происходит главным образом из-за ограниченного числа вариантов источника бора и воздухо- и влаго- чувствительной природы молекулы в ранней стадии последовательности синтеза.

В первой части этой статьи мы опишем несколько грамм масштабный синтез N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) с использованием стандартных методов без доступа воздуха с. Это соединение служит универсальным промежуточного продукта, который может быть дополнительно функционализированный структурно более сложных молекул 14, 15. Начиная с 3, синтез и очистка N -H- B - этил-1,2-azaborine (5) для использования в исследованиях связывания белков будут описаны ниже. Из - за волатильности 5, его эффективная изоляция требует точного контроля температуры реакции, времени и дистусловия. вывод

Во второй части, протоколы для экспрессии белка , и выделения Т4 лизоцима мутантов (L99A и L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 будут представлены, с последующей кристаллизации белков и получения белок-лиганд кристаллических комплексов. T4 лизоцима мутанты L99A и L99A / M102Q были выбраны в качестве модельных систем для изучения биологических возможности водородных связей NH , содержащих молекулы azaborine 17. Использование стандартного протокола молекулярной биологии, белок экспрессируется в штамм кишечной палочки RR1 и индуцировали изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). очистки белка проводят с использованием ионообменной хроматографии на колонках. Протеин кристаллизацию проводят с высокой концентрацией очищенного раствора белка (> 95% чистоту с помощью электрофореза в геле) с использованием нависаниюпадение пара методом диффузии. Из-за чувствительности лигандов этого исследования к кислороду, белок-лиганд комплексы получают в Деаэрированная условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все кислород- и чувствительные к влаге манипуляции проводились в инертной атмосфере (N 2) с использованием либо стандартных воздушных свободной техники или перчаточный ящик. ТГФ (тетрагидрофуран), Et 2 O (диэтиловый эфир), CH 2 Cl 2 (дихлорметан), толуол и пентан очищают пропусканием через колонку с нейтральной окиси алюминия в атмосфере аргона. Ацетонитрил сушат над СаН 2 (гидрид кальция) и дистиллированную в атмосфере азота до использования. Pd / C (палладий на угле) нагревали в высоком вакууме при температуре 100 ° C в течение 12 часов перед использованием. Силикагель (230-400 меш), сушат в течение 12 ч при 180 ° С под высоким вакуумом. Флэш-хроматографию проводили с этим силикагелем, в инертной атмосфере. Все другие химические вещества и растворители были приобретены и использованы в полученном виде.

Примечание: Внимание, пожалуйста, консультации со всеми соответствующими Паспорта безопасности (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в синтезе,вновь остро токсичными и канцерогенными.

1. Получение 1,2-Azaborines

Примечание: характеристические данные всех соединений в данном исследовании были ранее сообщалось 12, 13, 16.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схема синтеза 1,2-azaborines. Подробные протоколы для синтеза каждого соединения (1-5), описаны в разделе протокола. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Получение N -allyl- N -TBS- B хлорида аллил аддукта (1)
    1. В перчаточном боксе, отмерить 6,70 г (50,0 ммоль) triallylboraН.Е. 22 в высушенной в сушильном шкафу 24/40 1 л круглодонную колбу , снабженную мешалкой и добавляют 250 мл дихлорметана. Уплотнение колбу резиновой пробкой. Вне коробки, охлаждают раствор до -78 ° С в атмосфере азота на вакуумном коллекторе газа.
    2. Добавить 100 мл 1,00 М раствора трихлорида бора (100 ммоль) в гексане к раствору triallylborane при -78 & deg; С с помощью передачи канюлей. Пусть реакционную смесь перемешиваться при этой температуре в течение 4 ч.
      Примечание: Внимание, трихлорид бора обладает высокой реакционной способностью с водой.
    3. В отдельной колбе 100 мл, отмерить 25,7 г N - (т бутилдиметилсилил) - N -allylamine (150 ммоль) и добавляют 20,0 мл дихлорметана. В реакционную колбу емкостью 1 л, добавляют этот раствор с помощью передачи канюлей поддерживая температуру реакционной смеси при -78 ° С.
    4. Добавить 21,0 мл триэтиламина (150 ммоль) к реакционной смеси. Поддержание перемешивания при положительном токе азота и дайте ему постепенно нагреться до роом температуре в течение ночи.
    5. Через 18 ч перемешивания, удалите примерно половину растворителя через вакуумный коллектор газа с использованием высокого вакуума (300-500 мТорр) с жидким азотом ловушку.
    6. Возьмем реакционную колбу в перчаточной камере, и отфильтровывают белый соль, образованную в реакционной смеси с помощью высушенной в сушильном шкафу средней пористости фритты оборудованного 24/40 вакуумным адаптером и 24/40 500 мл круглодонную колбу с перемешиванием бар. Используйте дихлорметан, чтобы перевести все остальные материалы.
    7. Удалить все оставшиеся летучие компоненты из фильтрата за пределы коробки, используя вакуумную систему газа с высоким вакуумом.
    8. В перчаточном боксе, передавать Концентрированную реакционную смесь в высушенной в сушильном шкафу 14/20 100 мл круглодонную колбу с мешалкой, чтобы подготовиться к перегонке. Закрывают колбу с перегородкой.
    9. В токе азота, быстро открыть перегородку и добавить 200 мг гидрида кальция в качестве сушильного агента.
    10. Установить перегонный аппарат путем установки oven-сушат 14/20 ректификационной головку, прикрепленную с помощью термометра, на одной стороне с приемной 14/20 50 безвоздушного колбу для хранения мл, а с другой стороны с 100 мл колбу, содержащую неочищенный продукт. Оборудуйте перегонной голову с охлажденной водой. (Используйте смазку для всех суставов перегонного аппарата.)
      Примечание: Продукт начинает перегонку, когда температура пара достигает 60 ° C при 300 мТорр.
    11. Продолжить сбор продукта за счет повышения температуры масляной бани до тех пор, перегонка головка термометр читает 75 ° C.
      Примечание: Продукт представляет собой прозрачной бесцветной жидкостью.
    12. Прекратить перегонку путем удаления источника тепла и охлаждения аппарата до комнатной температуры перед помещением на хранение. После охлаждения repressurize аппарат с азотом и плотно закрыть пробковый кран на безвоздушного колбу для хранения. Храните изолированный продукт в перчаточном ящике морозильной камеры.
      Примечание: Выход может варьироваться от 65% до 84%.
  2. Получение N Б -Cl продукта с замкнутым циклом (2)
    1. В перчаточном боксе, отмерить 56,0 г N -allyl- N -TBS- B аллил хлорида аддукта (1) (217 ммоль) в высушенной в сушильном шкафу 24/40 1 л круглодонную колбу с мешалкой и добавьте 500 мл толуола.
    2. Отмерить 1,79 г Grubbs 1 - го поколения катализатора (2,17 ммоль).
    3. Добавляют катализатор порциями к перемешиваемому раствору 1 при комнатной температуре в перчаточном боксе. Purge коробки во время добавления, чтобы удалить газообразный этилен, полученные из реакции.
      Примечание: Реакция, как правило, завершается в течение 30 мин после прекращения выделения газа. В качестве другого показателя завершения реакции цвет будет полностью изменен с его начальной фиолетового до коричневого цвета. На данный момент, продукт может быть выделен с помощью вакуумной дистилляции; см ссылку 12 для деталей. В этом протоколе один горшок, двухступенчатый процедура прямого синтеза 3 описана.
    4. Получение N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
      1. К реакционному раствору кольцеобразной закрытого продукта (2) в толуоле, добавляют 14,0 г палладия на угле (10 мас% Pd, 13,2 ммоль).
      2. Выньте колбу из коробки и установить его с высушенной в сушильном шкафу 24/40 дефлегматором, который продут азотом и оборудованный с охлажденной водой.
      3. Реакционную смесь нагревают с помощью масляной бане до энергичного с обратным холодильником при 135 ° С при перемешивании.
      4. После выдерживания при нагревании с обратным холодильником в течение 16 ч, охлаждают реакцию путем удаления колбы из масляной бани. При охлаждении до комнатной температуры, изымать Аликвоту 0,5 мл из реакционной смеси с помощью шприца, снабженного высушенную в сушильном шкафу люэровского иглы. Переносят 0,5 мл аликвоты в ЯМР пробирку с завинчивающейся крышкой для анализа с помощью ЯМР 11 B 12.
        Примечание: Заданная Пик продукта появляется при температуре около 35,5 частей на миллион 12, в то время как исходное матерриала пик появляется в ок. 42,9 частей на миллион 12. Как правило , в этом пункте 11 B ЯМР указывает на то реакция является неполной, с незначительным пиком исходного материала осталось.
      5. Если реакция является неполной, довести реакционную колбу в перчаточной камере, и добавить дополнительные 3,00 г палладия на угле (10 мас% Pd, 2,82 ммоль).
      6. Resubject реакции с обратным холодильником в условиях, описанных в 1.3.2 и 1.3.3.
      7. Через еще 24 ч при кипячении с обратным холодильником, анализируют другой аликвоты реакционной смеси с помощью 11В ЯМР. На данный момент, реакция должна быть полной.
      8. Переносят реакционную колбу в камере с перчатками и передают реакционную смесь через одноразовую колонку дл быстрой хроматографии, наполненную бумажными салфетками. Сбор фильтрата промыванием 50,0 мл толуола.
      9. Удалить все летучие вещества из фильтрата снаружи коробки на вакуумный газойль коллектор, снабженный высоким вакуумом.
        Примечание: Удаление летучих веществ может занять 40 мин тO 90 мин в зависимости от вакуумметрического давления. Когда вакуумный датчик считывает максимальное давление, это указывает на то, что удаление растворителя завершена. При удалении растворителя, убедитесь, что водяной бане под колбу остается при комнатной температуре для отвода тепла.
      10. В перчаточном боксе, передавать Концентрированную реакционную смесь в высушенной в сушильном шкафу 24/40 250 мл круглодонную колбу с мешалкой. Закрывают колбу с перегородкой.
      11. Быстро удалить перегородку и добавить 200 мг гидрида кальция в качестве сушильного агента.
      12. Установить перегонный аппарат путем установки высушенной в сушильном шкафу 24/40 ректификационной головку, прикрепленную с помощью термометра, на одной стороне с приемной 24/40 100 мл безвоздушного колбу для хранения, а другая сторона с 100 мл колбу, содержащую неочищенный продукт. Оборудуйте перегонной голову с охлажденной водой. Используйте смазку для всех суставов перегонного аппарата.
        Примечание: Продукт начинает перегоняется при температуре паров достигает от 65 до 70 ° C при 1,000 мТорр с масломТемпература ванны между 90-100 ° C. Продукт представляет собой прозрачной бесцветной жидкостью.
      13. Прекратить перегонку путем удаления источника тепла и охлаждения аппарата до комнатной температуры перед помещением на хранение. После охлаждения repressurize аппарат с азотом и плотно закрыть пробковый кран на безвоздушного колбу для хранения. Хранить выделенного продукта в перчаточном боксе морозильной камере при температуре -30 ° C.
        Примечание: Выход за один горшок, двухступенчатой ​​процедуры составляет 52%.

    фигура 2
    На рисунке 2: 11 В ЯМР - спектры для формирования мониторинга N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). A) N -Allyl- N -TBS-B-аллилхлорид аддукт (1), исходный материал для изготовления кольца закрытия метатезиса. Б) Окисление через 16 ч. (Непрореагировавший N -TBS- B -Cl кольцо закрыто продукт (2) и изомеризуется Б -винил кольцо замкнутый продукт (2 ') вместе с N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine (3) показаны.) С) Окисление после еще 24 ч. D) Выделенный продукт (3) после очистки с помощью вакуумной перегонки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    1. Получение N -h- B -OBu-1,2-azaborine (4)
      1. В перчаточном боксе, отмерить 4,00 г N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 ммоль) в высушенной в сушильном шкафу 100 мл круглодонную колбу с мешалкой и добавляют 35 мл ацетонитрила. Отмерить 1,14 г ацетамида (19,3 ммоль) и передать в реакционную колбу. Уплотнение колбу резиновой пробкой.
      2. Удалите реакционную колбу из коробки и установить с уплотнительнымаже высушенных 24/40 обратным холодильником, который был продувают азотом и оборудованный с охлажденной водой.
      3. Реакционную смесь нагревают с обратным холодильником при температуре 85 ° С в масляной бане при перемешивании.
      4. Через 3 ч с обратным холодильником, охлаждают реакцию путем удаления колбы из масляной бани. При охлаждении до комнатной температуры, удаляют растворитель на вакуумном коллекторе газа, снабженный высоким вакуумом.
      5. После удаления летучих веществ в вакууме, остаток повторно растворить реакции в 15,0 мл ТГФ. К этому раствору добавляют 3,21 мл н - бутанола (35,1 ммоль).
      6. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч.
      7. Растворитель удаляют на вакуумном коллекторе газа, снабженный высоким вакуумом, чтобы получить сырой продукт.
      8. В перчаточном боксе, изолировать продукт с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, используя смесь пентана и диэтилового эфира (5: 1) в качестве элюента. Удалить летучие вещества из фракций, содержащих продукт с использованием вакуумного газового коллектора, оснащенный высоким вакуумом с получением чистого продукта в видетвердого вещества белого цвета.
        Примечание: Выход может варьироваться от 82% до 87%.
    2. Получение N -H- B - этил-1,2-azaborine (5)
      1. В перчаточном боксе, отмеряют 1,00 г N- Н -B- OBU-1,2-azaborine (4) (6,62 ммоль) в высушенной в сушильном шкафу 100 - мл круглодонную колбу с мешалкой и добавляют 25 мл Et 2 О. Уплотнение колбу с резиновой перегородкой и место под N 2 на вакуумном коллекторе газа.
      2. В отдельной высушенную в сушильном шкафу 100-мл круглодонную колбу, добавляют 26,5 мл раствора этиллития (0,5 М в смеси бензол / циклогексан, 13,2 ммоль) в атмосфере азота. Удаляют смесь растворителя (бензол / циклогексан) из реагента этиллития, чтобы избежать проблем с выделением желаемого продукта azaborine. Растворится твердый этиллития в 13,0 мл Et 2 O.
        Примечание: Внимание: Литийорганические реагенты пирофорное (воспламеняемость при контакте с воздухом или водой). Требуемый продукт (5
      3. Охлаждают реакционную колбу, содержащую от 4 до -30 ° C с охлаждающей бани.
      4. Добавьте этиллития раствор в реакционную колбу через канюлю передачи при -30 ° С. Продолжайте перемешивание при этой температуре в течение 1 ч и позволяют ему медленно нагреться до комнатной температуры.
      5. Мониторинг реакции с помощью 11 B ЯМР. (Желательного промежуточного продукта пик при приблизительно 39,8 частей на миллион.)
      6. После завершения реакции Реакционную смесь охлаждают до -30 ° С и добавляют 6,62 мл раствора HCl (2,0 М в Et 2 O, 13,2 ммоль). Перемешивают реакционную смесь в течение 1 ч, позволяя ему медленно нагреться до комнатной температуры.
      7. Растворитель удаляют на вакуумном коллекторе газа, снабженный низким вакуумом (20-25 мм рт.ст.), для получения смеси сырого продукта.
      8. В перчаточном боксе,выделения продукта с помощью хроматографии на колонке с силикагелем, используя 2-метилбутан в качестве элюента. Удалить летучее на вакуумный газойль коллектор, снабженный ослабленного вакуумом с получением чистого продукта в виде бесцветной жидкости.
        Примечание: Выход составляет 56%.

    2. Получение белка и Кристаллизация T4 лизоцима Мутанты

    1. Экспрессию белка и очистка
      1. Grow клетки E.coli RR1 трансформированные субклонированный плазмид (L99A или L99A / M102Q), дополненной 40,0 мг ампициллина , при 37 ° С в течение 12 ч 17, 20 в 200 мл LB (лизогении бульон).
        Примечание: Состав LB сред 12 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г хлорида натрия, и 1 г глюкозы на 1 LH 2 O.
      2. Инокулируйте 4,00 л LB среды (дополненную 800 мг ампициллина) с 160 мл ночной культуры, и инкубировали при 37 ° С со скоростью 240 оборотов в минуту с filtered подачи воздуха.
      3. Когда оптическая плотность достигает 0,7 при длине волны 600 нм, охлаждают бактериальной культуры до комнатной температуры путем его удаления из инкубатора.
      4. Отмерить 695 мг изопропил-бета-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) (конечная концентрация 0,7 мМ) в коническую центрифужную пробирку и добавляют 4 мл LB носитель для растворения.
      5. Добавить раствор IPTG в культуру, чтобы индуцировать экспрессию белка. Инкубацию культуры при 110 оборотах в минуту в течение 21 ч при 25 ° С.
      6. Центрифуга культуру в 4,412 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 300 мл 0,1 М фосфата натрия (рН 6,6), 0,2 М NaCl и добавляют 30,0 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (рН 8,0). Перемешайте суспензии в течение 17 ч при температуре 4 ° С.
      7. Добавить 30,0 мл 1,0 М MgCl 2 и 0,500 мл дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I) к суспензии и перемешивают при комнатной температуре в течение 8 ч.
      8. Центрифуга лизированных клеточную суспензию при 30,913 х г в течение 30 мин при 4 76; С. Собирают супернатант, содержащий экспрессированного белка и отбросить осадок.
      9. Диализировать лизат против 20 мМ фосфата натрия (рН 6,5 для L99A и рН 6,3 для L99A / M102Q) при 4 ° С в течение ночи.
      10. Промыть и уравновешивают 20,0 мл карбоксиметиловых ионообменными шариками с уравновешивающим буфером (50 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА (рН 7,3)) в колонке. Нагрузка в раствор, содержащий белок на шарики и колонку промывают 100 мл буфера для уравновешивания. Элюируют колонку 600 мл линейного градиента 300 мМ NaCl в буфере для уравновешивания.
      11. Используйте систему хроматографии низкого давления для очистки колонны. Используйте скорость насоса 1 мл / мин и собирают фракции по 10 мл. Собирают фракции, содержащие чистый белок.
        Примечание: Во время элюирования, мониторинг оптической плотности (OD) при 280 нм, чтобы проверить наличие белка. Определить чистоту каждой фракции путем SDS-PAGE и собирают только самые чистые фракции.
    "ВОК: Keep-together.within-страницу =" 1 "> Рисунок 1
    Рисунок 3: Типичные результаты для очистки белка T4 лизоцима мутант L99A / M102Q. A) Хроматограмма показывает измеренное поглощение в УФ АС при длине волны 280 нм (синяя линия) и проводимость в мСм / см (красная линия). Фракции 20-23 объедин ли, а чистоту определ ли с помощью SDS-PAGE. Б) 15% гель SDS-PAGE , показывающий присутствие очищенного белка из фракций 20-23 при 18,6 кДа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    1. кристаллизации белка
      1. Передача очищенного белкового раствора в диализной мембраны трубки (12000 до 14000 MWCO). Поместите диализной трубки в стакан , содержащий 4,00 л 100 мМ фосфата натрия, 550 мМ NaCl, 0,02% NaN 3 (рН 6,5 для L99A и рН 6,3 для L99A / M102). Перемешивают 4 л раствора в течение ночи при температуре 4 ° С.
      2. Добавить 2-меркаптоэтанол (конечная концентрация 5 мМ) к диализу образца и концентрируют до ~ 40,0 мг / мл с использованием центробежного концентратора (10000 MWCO). Определить концентрацию белка путем измерения поглощения при 280 нм. Удалите осадок крутя перед кристаллизацией.
      3. С помощью паровой диффузии метод висячей капли для кристаллизации белков. Смешать 5,00 мкл концентрированного белкового раствора с 5,00 мкл раствора резервуара (2,0-2,2 М натрий / калий-фосфатного, рН 6,7-7,1, 50 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ 2-гидроксиэтил) дисульфида на силиконизированный покровного стекла слайда.
      4. Равновесие капли смеси против 1,00 мл раствора резервуара путем размещения крышки Задвиньте вниз на верхней части каждой лунки, содержащей раствор пласта. Используйте смазку, чтобы плотно запечатать каждую лунку с горкой. Настройка различных условий с использованием 24-луночного планшета с раствором коллектора упомянутого в пункте 2.2.3.Хранить планшет при температуре 4 ° С для роста кристаллов.
        Примечание: Кристаллы обычно растут в течение 1-2 недель в уравновешенную буфером на обложке слайд. Немедленное осаждение во время смешивания белкового раствора с раствором резервуара на этапе 2.2.3 указывает на невозможность кристаллизации.

    Рисунок 4
    Рисунок 4: показательная картина кристаллов T4 лизоцима мутантного L99A , предшествующих комплексообразования с лигандами. Кристаллы в маточном растворе (2,1 М натрий / калий-фосфатный, рН 6,9, 50 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ 2-гидроксиэтил дисульфида). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    1. Комплексная подготовка
      1. Выберите кристаллы с использованием криогенной трубки формы в петлю (см список материалов) ипоместить их в 0,6 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 50,0 мкл маточного раствора в трубе, чтобы избежать сухости и сохранить кристаллы.
        Примечание: Одиночный выбор кристалла с помощью автоматизированного микроскопа.
      2. Передача трубки, содержащей кристаллы в перчаточном боксе. Взять 5,00 мкл azaborine лиганда (5) и место внутри оснастки колпачок трубки. Cap и хранить трубку в холодильнике (4 ° C) внутри перчаточного ящика на 2-7 дней для уравновешивания путем диффузии пара.
        Примечание: Физические свойства (высокая летучесть и растворимость в водном растворе) НАСТОЯЩЕГО azaborine лиганда (5) позволяет комплексообразованию с предварительно сформированных кристаллов протеина по методу диффузии в паровой фазе.
      3. Передача кристаллов с помощью криогенной трубки формируют в петлю на стеклянную пластинку, содержащую капельку N-paratone перед флэш-замораживания в жидком азоте. Выберите кристалл, защищенное с N-paratone и быстро флэш-замораживание путем погружения кристалла напетля в Дьюара с жидким азотом. Установить кристалл на петле с помощью криогенного тонг.
      4. Соберите наборы данных из одного кристалла с использованием синхротронного излучения. Выполните молекулярную замену с использованием опубликованных структур 20, 24; проверить наличие лиганда внутри сайта связывания белка с помощью маркированного смоделированы сгустка электронной плотности.

    Рисунок 5
    Рисунок 5: Атомные модели T4 лизоцима мутантного L99A связывающего кармана с плотностью электронов. А) L99A полости с маркированного смоделированы сгустка электронной плотности в участке связывания. Б) L99A полость с моделируемой azaborine лиганда 5 в двух альтернативных конформеров. Пожалуйста , клИк здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схематическое путь синтеза 1,2-azaborines показана на рисунке 1. Этот протокол применяется к синтезу пяти различных бор-азотсодержащих молекул. На рисунке 2 представлен 11 B ЯМР - спектров , измеренных в течение этапа 1.3 , чтобы контролировать образование целевого продукта (3). Очистку белка проводили с использованием системы хроматографии низкого давления и представитель хроматограмма показана на рисунке 3. Чистоту собранных фракций определяли с помощью SDS-PAGE. Кристаллы T4 лизоцима мутантного L99A изображены на рисунке 4. На рисунке 5 показан связывающий карман L99A с ООН-смоделирован электронной плотности и связывающей полости после уточнения с лигандом 5 связанного.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В первой части этого протокола, мы описали модифицированный синтез 1,2-azaborines на основе ранее представленных методов 12, 13. Triallylborane 22 был использован в качестве замены для маршрутов с использованием allyltriphenyl олова или калия allyltrifluoroborate подготовить N -allyl- N -TBS- B аллил аддукт хлорид (1). Этот метод позволяет более атомно-экономичной и экологически чистой подход. Для синтеза N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3), был использован один горшок, два шага последовательности (кольцо закрытия метатезу с последующим окислением), что привело к более изолированным выходом , чем предыдущая способ , включающий выделения промежуточного соединения (2) (52% против 29% за две стадии). (Тем не менее, в зависимости от чистоты аддукта (1), изоляция кольцевого закрыто продукта перед стадия окисленияможет быть необходимо при помощи вакуумной дистилляции. В этом случае, с использованием дихлорметана в качестве растворителя вместо толуола сокращает время для удаления летучих веществ перед перегонкой.) Мониторинга 11В ЯМР (рисунок 2) в ходе стадии окисления также извлекает выгоду в сокращении в общих количеств Pd / C , используемых в этом реакция (7 моль% против 15% мол).

Синтез N -H- B - этил-1,2-azaborine (5) была выполнена в два этапа с 4 с использованием этиллития вместо ранее сообщалось многоступенчатой последовательности 16 , которая требует использования комплекса хрома. Изоляция требуется точный контроль температуры и ослабляется-вакуумную манипуляции из-за летучести продукта. Методы, представленные в данном протоколе могут быть также применены к очистке других летучих соединений.

Во второй части, мы показали очистку белка и кристаллический комплексообразованиеТ4 лизоцима мутантов L99A и L99A / M102Q. Стандартный экспрессии белка в E.coli RR1 штамм и индукции с использованием IPTG, с последующим химическим лизиса клеток , обеспечиваемой выделению целевого белка. Рекомендуется запускать SDS-PAGE после экспрессии белка и лизиса клеток, чтобы подтвердить успех каждого шага или определить неисправный процесс. Для T4 лизоцима L99A, экспрессированный белок может быть найден и в надосадочной жидкости и окатышей из-за его активности, чтобы лизировать клетки бактерий. В этом случае белок в надосадочной жидкости может быть диализу против 20 мМ натрий-фосфатным буфером, и в сочетании с лизат из клеточного лизиса для очистки на колонке. Условия Индукционные можно отрегулировать до более высокой температуры и более короткое время (с 21 ч при 25 ° С до 2-3 ч при 37 ° С). Лизис клеток может быть также выполнена с использованием ультразвука с на бане со льдом, чтобы предотвратить перегрев. Карбоксиметилцеллюлозы с использованием ионообменной колонки с линейным градиентом NaCl 300 мМ использовали для очистки белков. Только> 95% чистоты (на основе SDS-PAGE) белковые фракции собирали и использовали в кристаллизации белков.

До концентрирования раствора белка, добавление 2-меркаптоэтанола (конечной концентрации 5 мМ) (этап 2.2.2) к диализу белка было необходимо, чтобы предотвратить его самопроизвольное осадков, особенно для L99A / белок M102Q, который имеет тенденцию легко осаждается при высоких концентрация. В качестве белка комплексообразование с 5 требуется атмосферу без доступа воздуха, белок-лиганд , был приготовлен в перчаточном боксе. Материалы, полученные в этом протоколе были использованы в связывании исследования 1,2-azaborines в биологической системе модели: Полость-bearingT4 лизоцим мутантов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% Sigma Aldrich 34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free Sigma Aldrich 309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) Fisher D37-20
Toluene Fisher T290-4
Pentane, HPLC Fisher P399-4
Acetonitrile Fisher A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% Sigma Aldrich 208027 Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd Strem 46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane Sigma Aldrich 211249 Highly toxic/Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5% Sigma Aldrich 471283
Grubbs 1st generation catalyst  materia C823
Acetamide Sigma Aldrich A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane Sigma Aldrich 561452 Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O Sigma Aldrich 455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% Sigma Aldrich 277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) ATCC 31343
T4 lysozyme WT* (L99A) Addgene 18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) Addgene 18477
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Invitrogen AM9464
Sodium phosphate monobasic anhydrous Fisher BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher BP332
Sodium chloride Fisher S642212 
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BP118
Magnesium chloride Sigma Aldrich M4880 Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI Fisher PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media Fisher 45-002-931
Tris-base Fisher BP152-500 
Sodium azide TCI S0489 Highly toxic
2-Mercaptoethanol Fisher ICN806443 
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators Fisher 14-558-501
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
2-Hydroxyethyl disulfide Sigma Aldrich 380474
N-paratone  Hampton Research HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO  Fisher 08-667E
 CryoLoop Hampton Research cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong Thermo Fisher cryogenic tong
Coot Electron density images are generated from the software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

Tags

Биохимия выпуск 121 azaborine гетероциклы синтез кристаллизации белка Т4 лизоцим диффузии паров висячей капли белок-лиганд дифракции рентгеновских лучей связывающее взаимодействие
Синтез 1,2-Azaborines и подготовке их белковых комплексов с Т4 лизоцима Мутанты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of… More

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants. J. Vis. Exp. (121), e55154, doi:10.3791/55154 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter