Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Syntes av 1,2-Azaborines och utarbetandet av deras proteinkomplex med T4 Lysozyme mutanter

Published: March 25, 2017 doi: 10.3791/55154

Introduction

Boron-kväveinnehållande heterocykler (dvs 1,2-azaborines) har nyligen dragit stor uppmärksamhet som isosterer av arener. Denna isosterism kan leda till en diversifiering av befintliga strukturella motiv för att utöka den kemiska utrymmet 2, 3, 4. Azaborines har potentiell användbarhet för tillämpning i biomedicinsk forskning 5, 6, 7, 8, i synnerhet inom området för medicinsk kemi i vilken kemister utföra syntes av bibliotek av strukturellt och funktionellt relevanta molekyler. Betecknande dock, medan det finns många väl utvecklade syntesvägar till tillgängliga areninnehållande molekyler, har bara ett begränsat antal metoder för syntes av azaborines rapporterats 9, 10, 11, 12, 13. Detta beror främst på att ett begränsat antal alternativ för borkällan och luft- och fuktkänsliga naturen hos molekylen i det tidiga skedet av syntessekvensen.

I den första delen av denna artikel kommer vi att beskriva en flergramskala syntes av N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) med användning av standardluftfria tekniker. Denna förening fungerar som en mångsidig mellanprodukt som kan funktionaliseras ytterligare för att strukturellt mer komplexa molekyler 14, 15. Med början från 3 kommer syntesen och reningen av N -H- B -etyl-1,2-azaborine (5) för användning vid proteinbindningsstudier beskrivas. På grund av flyktigheten hos 5 kräver dess effektiv isolering exakt kontroll av reaktionstemperatur, tid, och distSLUTSATS villkor.

I den andra delen, protokoll för proteinuttryck och isolering av T4 lysozym mutanter (L99A och L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 kommer att presenteras, följt av proteinkristallisation och framställning av protein ligand kristallkomplex. T4 lysozym mutanter L99A och L99A / M102Q valdes som biologiska modellsystem för att undersöka vätebindningsförmåga av NH innehållande azaborine molekyler 17. Med användning av en standard molekylärbiologi-protokollet, är det protein som uttrycks i Escherichia coli RR1-stam och inducerades med isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG). Proteinrening utförs med användning av jonbytes-kolonnkromatografi. Proteinkristallisation utförs med starkt koncentrerad renad proteinlösning (> 95% renhet genom gelelektrofores) med användning av den hängandesläppa ångdiffusion metod. På grund av känsligheten av denna studiens ligander till syre, är protein-ligand-komplex som framställts under luftfria betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTERA: Alla syre- och fuktkänsliga manipulationer utfördes under en inert atmosfär (N2) med användning av antingen standard luftfria tekniker eller en handskbox. THF (tetrahydrofuran), Et 2 O (dietyleter), CH 2 Cl 2 (diklormetan), toluen, och pentan renades genom passage genom en neutral aluminiumoxidkolonn under argon. Acetonitril torkades över CaH2 (kalciumhydrid) och destillerades under kväveatmosfär före användning. Pd / C (palladium på kol) upphettades under högt vakuum vid 100 ° C under 12 h före användning. Silikagel (230-400 mesh) torkades under 12 h vid 180 ° C under högt vakuum. Snabbkromatografi utfördes med denna silikagel under en inert atmosfär. Alla andra kemikalier och lösningsmedel köptes och användes som mottagna.

OBS: Varning, se alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Flera av de kemikalier som används i syntesen enre akut giftigt och cancerframkallande.

1. Framställning av 1,2-Azaborines

OBS: karakteriseringsdata för alla föreningar i denna studie har tidigare rapporterats 12, 13, 16.

Figur 1
Figur 1: syntetiskt schema av 1,2-azaborines. Detaljerade protokoll för syntes av varje förening (1-5) beskrivs i protokollet sektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Framställning av N -allyl- N -TBS- B allyl-klorid addukt (1)
    1. I en handskbox, mäta upp 6,70 g (50,0 mmol) triallylborane 22 in i en ugnstorkad 24/40 1 L rundbottnad kolv utrustad med en omrörarstav och tillsätt 250 ml diklormetan. Kolven med ett gummimembran. Utanför boxen, kyl lösningen till -78 ° C under en kväveatmosfär på en vakuum gasgrenröret.
    2. Tillsätt 100 ml av 1,00 M bortriklorid-lösning (100 mmol) i hexan till triallylborane lösningen vid -78 ° C via kanyl överföring. Låt reaktionsblandningen omröras vid denna temperatur under 4 h.
      OBS: Varning, är mycket reaktiv med vatten bortriklorid.
    3. I en separat 100 ml kolv, mäta upp 25,7 g N - (t-butyldimetylsilyl) - N -allylamine (150 mmol) och tillsätt 20,0 ml diklormetan. Till en L reaktionskolv, tillföra denna lösning via kanyl överföring bibehållande av reaktionstemperaturen vid -78 ° C.
    4. Lägga 21,0 ml trietylamin (150 mmol) till reaktionsblandningen. Upprätthålla omröring under ett positivt flöde av kväve och tillåta den att gradvis värmas till roabout temperatur över natten.
    5. Efter 18 h av omröring, ta bort ungefär en halv av lösningsmedlet genom en vakuum gasgrenröret med användning av högt vakuum (300-500 mTorr) med en flytande kväve-fälla.
    6. Ta reaktionskolven in i en handskbox och avfiltrera det vita saltet bildas i reaktionsblandningen genom en ugnstorkad medelporositet fritta utrustad med en 24/40 vakuumadapter och ett 24/40 500 ml rundbottnad kolv med en omröringsstav bar. Använd diklormetan för att överföra alla återstående material.
    7. Ta bort alla kvarvarande flyktiga från filtratet utanför boxen med hjälp av en vakuum gas grenrör med högvakuum.
    8. I en handskbox, överföra den koncentrerade reaktionsblandningen i en ugnstorkad 14/20 100 ml rundbottnad kolv med en omrörarstav att förbereda sig för destillation. Cap kolven med ett septum.
    9. Under ett flöde av kväve, snabbt öppna septum och tillsätt 200 mg kalciumhydrid som ett torkmedel.
    10. Inrätta destillationsapparaten genom att montera en ugn-torkades 14/20 destillationshuvud fäst med en termometer, en sida med en mottagande 14/20 50 ml luftfri lagringskolven och den andra sidan med 100 ml kolv innehållande rå produkt. Utrusta destillation huvudet med kylt vatten. (Använd fett för alla lederna i destillationsapparaten.)
      OBS: Produkten börjar destillera när ångan temperaturen når 60 ° C vid 300 mTorr.
    11. Fortsätta uppsamling av produkten genom att höja temperaturen hos oljebadet tills destillationshuvudet termometer läser 75 ° C.
      OBS: Produkten är en klar färglös vätska.
    12. Stoppa destillation genom att avlägsna värmekällan och kyla anordningen till rumstemperatur före lagring. Vid kylning, repressurize apparaturen med kväve och sluta tätt pluggventilen på luftfria lagringskolven. Lagra den isolerade produkten i en handskbox frys.
      OBS: Avkastningen kan variera från 65% till 84%.
  2. Framställning av N B -Cl ringslutas produkt (2)
    1. I en handskbox, mäta upp 56,0 g N -allyl- N -TBS- B allyl klorid addukt (1) (217 mmol) i en ugnstorkad 24/40 1 L rundbottnad kolv med en omrörarstav och tillsätt 500 ml toluen.
    2. Mät ut 1,79 g Grubbs en st generation katalysator (2,17 mmol).
    3. Lägga katalysatorn portionsvis till den omrörda lösningen av en vid rumstemperatur i en handskbox. Rensa lådan under tillsatsen för att avlägsna etengas bildas från reaktionen.
      OBS: Reaktionen är vanligen avslutad inom 30 min av upphörandet av gasutvecklingen. Som en annan indikator för färdigställande kommer reaktionen färg har helt förändrats från dess ursprungliga lila till brun. Vid denna punkt kan produkten isoleras med användning av vakuum-destillation; se detaljer 12 referens. I detta protokoll är en one-pot, tvåstegsförfarande för direkt syntes av 3 beskrivs.
    4. Framställning av N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
      1. Till reaktionslösningen av den ringsluten produkt (2) i toluen, tillsätt 14,0 g palladium på kol (10 vikt% Pd, 13,2 mmol).
      2. Ta kolven ur lådan och montera den med en ugnstorkad 24/40 återflödeskondensor som har spolats med kväve och försedd med kylt vatten.
      3. Värm reaktionsblandningen med användning av ett oljebad till en kraftigt återflöde vid 135 ° C under omrörning.
      4. Efter upprätthållande vid återflöde under 16 h kyldes reaktions genom avlägsnande av kolven från oljebadet. Vid kylning till rumstemperatur, dra tillbaka en 0,5 ml alikvot från reaktionsblandningen med användning av en spruta försedd med en ugnstorkad Luer lås nål. Överför 0,5 ml alikvot till en skruvlock NMR-rör för att analysera via 11 B NMR 12.
        OBS: Den önskade produkten toppen uppträder vid ca. 35,5 ppm 12, medan start material topp uppträder vid ca. 42,9 ppm 12. Vanligtvis vid denna punkt 11 B NMR indikerar att reaktionen är ofullständig, med en mindre utgångsmaterial topp kvar.
      5. Om reaktionen är ofullständig, bringa reaktionskolven in i en handskbox och lägga till en extra 3,00 g palladium på kol (10 vikt% Pd, 2,82 mmol).
      6. Resubject reaktionen till återflöde villkor som beskrivs i 1.3.2 och 1.3.3.
      7. Efter ytterligare 24 h vid återflöde, analysera en annan alikvot av reaktionen genom 11 B NMR. Vid denna punkt bör reaktionen vara fullständig.
      8. Överför reaktionskolven till handskfacket och passera reaktionsblandningen genom en engångs flashkromatografikolonn packad med pappersdukar. Samla upp filtratet genom tvättning med 50,0 ml toluen.
      9. Ta bort alla flyktiga från filtratet utanför boxen på ett vakuum gas grenrör utrustad med högvakuum.
        OBS: Borttagning av de flyktiga kan ta 40 minuter to 90 min beroende på vakuumtrycket. När vakuummätaren läser maximalt tryck, betyder det att avlägsnandet av lösningsmedel är fullständig. Medan avlägsnande av lösningsmedel, se till att vattenbadet under kolven förblir vid rumstemperatur för värmeavledning.
      10. I en handskbox, överföra den koncentrerade reaktionsblandningen i en ugnstorkad 24/40 250 ml rundbottnad kolv med en omrörarstav. Cap kolven med ett septum.
      11. Snabbt ta bort septum och tillsätt 200 mg kalciumhydrid som ett torkmedel.
      12. Inrättat destillationsapparaten genom att montera en ugnstorkad 24/40 destillationshuvud fäst med en termometer, en sida med en mottagande 24/40 100 ml luftfri lagringskolven och den andra sidan med 100 ml kolv innehållande rå produkt. Utrusta destillation huvudet med kylt vatten. Använd fett för alla lederna i destillationsapparaten.
        Anmärkning Produkten börjar destillera när ångtemperaturen når 65 till 70 ° C vid 1000 mTorr med en oljabadtemperatur mellan 90-100 ° C. Produkten är en klar färglös vätska.
      13. Stoppa destillation genom att avlägsna värmekällan och kyla anordningen till rumstemperatur före lagring. Vid kylning, repressurize apparaturen med kväve och sluta tätt pluggventilen på luftfria lagringskolven. Lagra den isolerade produkten i en handskbox frys vid -30 ° C.
        OBS: Direktavkastningen för en-potten, tvåstegsförfarande är 52%.

    figur 2
    Figur 2: 11 B-NMR-spektra för övervakning bildning av N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). A) N -Allyl- N -TBS-B-allylklorid addukten (1), utgångsmaterial för ringslutnings metates. B) Oxidation efter 16 timmar. (Oreagerad N -TBS- B -Cl ring stängd produkt (2) och isomeriseras B -vinyl ringslutna produkten (2 ') tillsammans med N-TBS-B-CI-1,2-azaborine (3) är visade.) C) Oxidation efter ytterligare 24 h. D) Isolerad produkt (3) efter rening genom vakuumdestillation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    1. Framställning av N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
      1. I en handskbox, mäta upp 4,00 g N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) i en ugnstorkad 100 ml rundbottnad kolv med en omrörarstav och tillsätt 35 ml acetonitril. Mät ut 1,14 g acetamid (19,3 mmol) och överför till reaktionskolven. Kolven med ett gummimembran.
      2. Avlägsna reaktionskolven från lådan och passform med en oven torkad 24/40 återflödeskondensor som har spolats med kväve och försedd med kylt vatten.
      3. Värm reaktionsblandningen till återloppskokning vid 85 ° C i ett oljebad under omröring.
      4. Efter 3 h vid återflöde kyldes reaktions genom avlägsnande av kolven från oljebadet. Vid kylning till rumstemperatur, avlägsna lösningsmedlet på en vakuum gasgrenröret utrustad med högt vakuum.
      5. Efter avlägsnande av de flyktiga materialen under vakuum, lös upp reaktions återstoden i 15,0 ml THF. Till denna lösning till 3,21 ml n-butanol (35,1 mmol).
      6. Rör om reaktionsblandningen vid rumstemperatur under 1 h.
      7. Avlägsna lösningsmedlet på en vakuum gasgrenröret utrustad med högt vakuum för erhållande av den råa produkten.
      8. I en handskbox, isolera produkten via silikagelkolonnkromatografi, med användning av en blandning av pentan och dietyleter (5: 1) som elueringsmedel. Avlägsna flyktiga ämnen från de produktinnehållande fraktioner med användning av en vakuum gasgrenröret utrustad med högt vakuum för erhållande av den rena produkten somett vitt fast ämne.
        OBS: Avkastningen kan variera från 82% till 87%.
    2. Framställning av N -H- B -etyl-1,2-azaborine (5)
      1. I en handskbox, mäta upp 1,00 g N-H -B- OBu-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) i en ugnstorkad 100 ml rundbottnad kolv med en omrörarstav och tillsätt 25 ml Et 2 O. Tillslut kolven med en gummipropp och placerades under N2 på en vakuum gas grenrör.
      2. I en separat ugnstorkad 100 ml rundbottnad kolv, till 26,5 mL etyllitium-lösning (0,5 M i bensen / cyklohexan, 13,2 mmol) under kväveatmosfär. Avlägsna blandning av lösningsmedel (bensen / cyklohexan) från etyllitium reagens för att undvika problem med att isolera den önskade azaborine produkten. Återupplösa den fasta etyllitium i 13,0 ml Et 2 O.
        OBS: Varning: litiumorganiska reagens är pyrofora (antändbar vid kontakt med luft eller vatten). Den önskade produkten (5
      3. Kyl reaktionskolv innehållande 4 till -30 ° C med ett kylbad.
      4. Tillsätt etyllitium lösning till reaktionskolven via kanyl överföring vid -30 ° C. Hålla omröring vid denna temperatur under 1 timme och låt den sakta värmas till rumstemperatur.
      5. Övervaka reaktionen med 11 B NMR. (Den önskade mellan topp uppträder vid ca 39,8 ppm.)
      6. Efter reaktionens fullbordan kyldes reaktions till -30 ° C och tillsätt 6,62 ml HCl-lösning (2,0 M i Et 2 O, 13,2 mmol). Rör om reaktionsblandningen under 1 timme medan tillåter den att långsamt värmas till rumstemperatur.
      7. Avlägsna lösningsmedlet på en vakuum gasgrenröret utrustad med lågt vakuum (20-25 torr) för erhållande av den råa produktblandningen.
      8. I en handskboxisolera produkten via silikagelkolonnkromatografi, med användning av 2-metylbutan som elueringsmedel. Avlägsna flyktiga på ett vakuum gassamlingsrör utrustad med en attenuerad vakuum för att erhålla den rena produkten som en färglös vätska.
        OBS: Utbytet är 56%.

    2. Protein Framställning och Kristallisation av T4 Lysozyme mutanter

    1. Proteinexpression och rening
      1. Växer E. coli RR1-celler transformerade med de subklonade plasmider (L99A eller L99A / M102Q) 17, 20 i 200 ml LB (lysogeni buljong) medium kompletterat med 40,0 mg ampicillin vid 37 ° C under 12 timmar.
        OBS: Sammansättningen av LB-medier är 12 g trypton, 5 g jästextrakt, 10 g natriumklorid och 1 g glukos per 1 LH 2 O.
      2. Inokulera 4,00 L LB-medium (kompletterat med 800 mg ampicillin) med 160 ml av den över natten odlade kulturen och inkubera vid 37 ° C vid 240 rpm med en filtered lufttillförsel.
      3. När den optiska densiteten når 0,7 vid 600 nm, kyla den bakteriekultur till rumstemperatur genom att avlägsna den från inkubatorn.
      4. Mät upp 695 mg isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) (slutkoncentration av 0,7 mM) i ett koniskt centrifugrör och tillsätt 4 ml LB-media för att lösas upp.
      5. Tillsätt IPTG-lösning till odlingen för att inducera proteinexpression. Inkubera kulturer vid 110 rpm under 21 h vid 25 ° C.
      6. Centrifugera kulturen vid 4412 xg under 30 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 300 ml 0,1 M natriumfosfat (pH 6,6), 0,2 M NaCl och tillsätt 30,0 ml av 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (pH 8,0). Rör om suspensionen under 17 h vid 4 ° C.
      7. Lägga 30,0 ml 1,0 M MgCl2 och 0,500 ml deoxiribonukleas I (DNas I) till suspensionen och rör om vid rumstemperatur under 8 h.
      8. Centrifugera den lyserade cellsuspensionen vid 30.913 xg under 30 min vid 4 76; C. Samla in supernatanten innehållande uttryckta proteinet och kasta pelleten.
      9. Dialysera lysatet mot 20 mM natriumfosfat (pH 6,5 för L99A och pH 6,3 för L99A / M102Q) vid 4 ° C över natten.
      10. Tvätta och jämvikta 20,0 ml karboximetyl jonbytar pärlor med jämviktsbuffert (50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7,3)) i en kolonn. Ladda lösningen innehållande proteinet på kornen och tvätta kolonnen med 100 ml av jämviktningsbufferten. Eluera kolonnen med en 600 ml linjär gradient av 300 mM NaCl i jämviktningsbufferten.
      11. Använda en lågtrycks kromatografisystem för kolumnen rening. Använda en pump hastighet av 1 ml / min och samla fraktioner av 10 ml. Samla de fraktioner som innehåller rent protein.
        OBS! Under eluering, övervaka den optiska densiteten (OD) vid 280 nm för att kontrollera närvaron av proteinet. Bestämma renheten av varje fraktion med SDS-PAGE och samla endast de renaste fraktionerna.
    "Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 1
    Figur 3: representativa resultat för proteinrening av T4 lysozym mutant L99A / M102Q. A) Kromatogram som visar den uppmätta UV-absorbans i AU vid 280 nm (blå linje) och konduktivitet i mS / cm (röd linje). Fraktioner 20-23 kombinerades och renheten bestämdes med SDS-PAGE. B) 15% SDS-PAGE gel som visar närvaron av renat protein av fraktioner 20-23 vid 18,6 kDa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    1. proteinkristallisation
      1. Överföra den renade proteinlösningen till en dialysmembranslang (12000 till 14000 MWCO). Placera dialysslangen i en bägare innehållande 4,00 L av 100 mM natriumfosfat, 550 mM NaCl, 0,02% NaN3 (pH 6,5 för L99A och pH 6,3 för L99A / M102). Rör om 4 L lösning över natten vid 4 ° C.
      2. Lägg 2-merkaptoetanol (slutlig koncentration av 5 mM) till den dialyserade provet och koncentrera till ~ 40,0 mg / ml med användning av en centrifugalkoncentrator (10000 MWCO). Bestämma proteinkoncentrationen genom mätning absorption vid 280 nm. Ta bort eventuell fällning genom att snurra före kristallisering.
      3. Använd ång-diffusion hängande-släpp-metoden för proteinkristallisering. Blanda 5,00 mikroliter av den koncentrerade proteinlösningen med 5,00 mikroliter av reservoarlösningen (2,0-2,2 M natrium / kaliumfosfat, pH 6,7 till 7,1, 50 mM 2-merkaptoetanol, 50 mM 2-hydroxietyl-disulfid) på en silikoniserad glaslocket.
      4. Jämvikta blandningen droppe mot 1,00 ml av reservoarlösningen genom att placera locket glida upp och ner på toppen av varje brunn innehållande reservoarlösningen. Använd fett tätt försegla varje brunn med bilden. Inrättat olika betingelser med användning av en 24-brunnar med reservoarlösning som nämns i 2.2.3.Lagra plattan vid 4 ° C under kristalltillväxt.
        OBS: Kristaller normalt växa inom 1-2 veckor i den ekvilibrerade bufferten på locket. Omedelbar utfällning vid blandning proteinlösning med reservoarlösningen i steg 2.2.3 indikerar fel på kristallisation.

    figur 4
    Figur 4: representativ bild av kristaller av T4 lysozym mutant L99A före komplexbildning med ligander. Kristaller är i moderluten (2,1 M natrium / kaliumfosfat, pH 6,9, 50 mM 2-merkaptoetanol, 50 mM 2-hydroxietyl-disulfid). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    1. komplex beredning
      1. Plocka kristallerna med hjälp av en kryogen rör formas till en ögla (se Materials List) ochplacera dem i en 0,6 ml mikrocentrifugrör. Lägg 50,0 mikroliter av moderluten till röret för att undvika torrhet och bevara kristallerna.
        OBS: Enkel kristall val underlättas genom användning av ett mikroskop.
      2. Överför röret med kristaller i en handskfacket. Ta 5,00 mikroliter av azaborine liganden (5) och placera på insidan av snäpp locket på röret. Lock och förvara röret i kylskåp (4 ° C) inuti handskboxen för 2-7 dagar för ekvilibrering av ångdiffusion.
        OBS: De fysikaliska egenskaperna (hög volatilitet och löslighet i vattenlösning) i azaborine liganden (5) gör det möjligt att komplex med förformade proteinkristaller via ångdiffusion metod.
      3. Överföra kristallerna med hjälp av en kryogen slang formad till en ögla till en glasskiva som innehåller en droppe av N-paratone före flash-frysning i flytande kväve. Välj kristallen skyddas med N-paratone och snabbt flash-frysning genom störta kristallen påslinga in i en dewar innehållande flytande kväve. Montera kristallen på slingan med hjälp av en kryogen tång.
      4. Samla datamängder i en enda kristall med hjälp av synkrotronljus. Utför molekylär ersättning med användning av publicerade strukturer 20, 24; kontrollera förekomsten av liganden i proteinbindningsstället av en un-modellerad klump elektrondensitet.

    figur 5
    Figur 5: Atomic modeller T4 lysozym mutant L99A bindande ficka med elektrondensitet. A) L99A utrymme med en un-modellerad elektrondensitet klump i bindningsstället. B) L99A hålighet med det modellerade azaborine ligand 5 i två alternativa konformerer. vänligen click här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den schematiska syntesväg för 1,2-azaborines visas i figur 1. Detta protokoll gäller för syntes av fem olika bor-kväveinnehållande molekyler. Figur 2 representerar 11 B NMR-spektra mättes under loppet av steg 1,3 för att övervaka bildningen av den önskade produkten (3). Proteinrening utfördes genom att använda lågtrycks kromatografisystem och ett representativt kromatogram visas i figur 3. Renheten hos de uppsamlade fraktionerna bestämdes genom SDS-PAGE. Kristaller av T4 lysozym mutant L99A visas i Figur 4. Figur 5 visar L99A bindningsfickan med un-modellerade elektrondensitet och bindande håligheten efter förfining med liganden 5 bunden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den första delen av detta protokoll beskrivs vi en modifierad syntes av 1,2-azaborines baserat på tidigare rapporterade metoder 12, 13. Triallylborane 22 användes som ett substitut för de linjer som använder allyltriphenyl tenn eller kalium allyltrifluoroborate att förbereda N -allyl- N -TBS- B allyl klorid addukt (1). Denna metod gör det möjligt för en mer atom-ekonomisk och miljövänlig metod. För syntes av N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3), var en en-gryta, två-stegssekvens (ring stängning metates följt av oxidation) användes, vilket resulterade i högre isolerat utbyte än tidigare metod som inbegriper isolering av mellanprodukten (2) (52% mot 29% över två steg). (Men beroende på renheten av addukten (1), isolering av den ringslutna produkt före oxidationsstegetkan vara nödvändigt att använda vakuumdestillation. I detta fall, med användning av diklormetan som lösningsmedel i stället för toluen reducerar tid för avlägsnande av flyktiga ämnen före destillation.) Övervakning 11 B NMR (Figur 2) under oxidationssteget också nytta i minskning av de totala mängderna av Pd / C som används i denna reaktion (7 mol-% vs 15 mol-%).

Syntes av N -H- B -etyl-1,2-azaborine (5) åstadkoms i två steg från 4 med användning av etyllitium i stället för den tidigare rapporterade flerstegssekvens 16 som krävde användning av en kromkomplex. Den isolering som krävs exakt temperaturkontroll och dämpas-vakuum manipulation på grund av flyktigheten av produkten. De tekniker som presenteras i detta protokoll kan också tillämpas på rening av andra flyktiga föreningar.

I den andra delen, visade vi proteinrening och kristallkomplexbildningav T4 lysozym mutanter L99A och L99A / M102Q. En standardproteinuttryck i E. coli RR1-stam och induktion med användning av IPTG, följt av kemisk cell-lys gav isolering av det önskade proteinet. Det rekommenderas att köra SDS-PAGE efter proteinuttryck och cellys för att bekräfta framgång för varje steg eller identifiera den misslyckade processen. För L99A T4 lysozym, kan det uttryckta proteinet återfinns i både supernatanten och pelleten på grund av sin verksamhet för att lysera bakterieceller. I detta fall, kan proteinet i supernatanten dialyseras mot 20 mM natriumfosfatbuffert och kombineras med lysat från cellys för kolonnrening. Induktionsbetingelser kan justeras till högre temperatur och kortare tid (från 21 h vid 25 ° C till 2-3 timmar vid 37 ° C). Cellys kan också utföras med hjälp av ultraljudsbehandling med ett isbad för att förhindra överhettning. Karboximetyl jonbyteskolonn med en 300 mM NaCl linjär gradient användes för proteinrening. Endast> 95% ren (baserat på SDS-PAGE) proteinfraktionerna uppsamlades och användes vid proteinkristallisation.

Före koncentrering av proteinlösningen, som var nödvändigt för att förhindra dess spontana utfällningen tillsats av 2-merkaptoetanol (slutlig koncentration av 5 mM) (steg 2.2.2) till den dialyserade proteinet, speciellt för L99A / M102Q protein som tenderar att fälla ut lätt vid hög koncentration. Som proteinkomplexbildning med 5 krävs en luftfri atmosfär, var protein-ligand-komplexet som framställts i en handskbox. Materialen framställda i detta protokoll användes i bindningsstudier av 1,2-azaborines i ett biologiskt modellsystem: cavity-bearingT4 lysozym mutanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% Sigma Aldrich 34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free Sigma Aldrich 309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) Fisher D37-20
Toluene Fisher T290-4
Pentane, HPLC Fisher P399-4
Acetonitrile Fisher A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% Sigma Aldrich 208027 Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd Strem 46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane Sigma Aldrich 211249 Highly toxic/Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5% Sigma Aldrich 471283
Grubbs 1st generation catalyst  materia C823
Acetamide Sigma Aldrich A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane Sigma Aldrich 561452 Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O Sigma Aldrich 455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% Sigma Aldrich 277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) ATCC 31343
T4 lysozyme WT* (L99A) Addgene 18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) Addgene 18477
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Invitrogen AM9464
Sodium phosphate monobasic anhydrous Fisher BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher BP332
Sodium chloride Fisher S642212 
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BP118
Magnesium chloride Sigma Aldrich M4880 Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI Fisher PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media Fisher 45-002-931
Tris-base Fisher BP152-500 
Sodium azide TCI S0489 Highly toxic
2-Mercaptoethanol Fisher ICN806443 
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators Fisher 14-558-501
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
2-Hydroxyethyl disulfide Sigma Aldrich 380474
N-paratone  Hampton Research HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO  Fisher 08-667E
 CryoLoop Hampton Research cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong Thermo Fisher cryogenic tong
Coot Electron density images are generated from the software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

Tags

Biokemi azaborine heterocykler syntes proteinkristallisering T4 lysozym ångdiffusion hängande droppe protein-ligandkomplex röntgendiffraktion bindningsinteraktion
Syntes av 1,2-Azaborines och utarbetandet av deras proteinkomplex med T4 Lysozyme mutanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis ofMore

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants. J. Vis. Exp. (121), e55154, doi:10.3791/55154 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter