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Biochemistry

Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes

Published: March 25, 2017 doi: 10.3791/55154

Introduction

El boro-heterociclos que contienen nitrógeno (es decir, 1,2-azaborines) recientemente han llamado la atención significativa como isosteras de arenos. Este isosterism puede conducir a la diversificación de los motivos estructurales existentes para ampliar el espacio químico 2, 3, 4. Azaborines tienen utilidad potencial para la aplicación en la investigación biomédica 5, 6, 7, 8, especialmente en el área de la química médica en la que los químicos llevar a cabo la síntesis de bibliotecas de moléculas estructuralmente y funcionalmente relevantes. Significativamente, sin embargo, si bien hay numerosas rutas sintéticas bien desarrollados a moléculas que contienen areno-disponibles, se han reportado sólo un número limitado de métodos para la síntesis de azaborines 9, 10, 11, 12, 13. Esto se debe principalmente a un número limitado de opciones para la fuente de boro y el aire y la naturaleza sensible a la humedad de la molécula en la fase inicial de la secuencia sintética.

En la primera parte de este artículo, describiremos una síntesis escala multi-gramo de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) usando técnicas sin aire estándar. Este compuesto sirve como un intermedio versátil que puede ser además funcionalizado para estructuralmente más complejas moléculas 14, 15. A partir de 3, se describirán la síntesis y purificación de N -H- B etil-1,2-azaborine (5) para su uso en estudios de unión a proteínas. Debido a la volatilidad de 5, su aislamiento eficiente requiere un control preciso de la temperatura de reacción, tiempo, y distillation condiciones.

En la segunda parte, los protocolos para la expresión de proteínas y el aislamiento de mutantes T4 lisozima (L99A y L99A / M102Q) 17, 18, 19, se presentarán 20, seguido de la cristalización de proteínas y la preparación de los complejos de cristal de proteína-ligando. Mutantes de lisozima T4 L99A y L99A / M102Q fueron elegidos como modelo de los sistemas biológicos para examinar la capacidad de enlace de hidrógeno de las moléculas que contienen NH azaborine 17. El uso de un protocolo de biología molecular estándar, la proteína se expresa en la cepa Escherichia coli RR1 y indujo con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Purificación de proteínas se lleva a cabo usando cromatografía en columna de intercambio iónico. cristalización de proteínas se lleva a cabo con una solución altamente concentrada y purificada de proteínas (> 95% de pureza por electroforesis en gel) usando el colgantedeje caer método de difusión de vapor. Debido a la sensibilidad de los ligandos de este estudio para el oxígeno, los complejos proteína-ligando se preparan en condiciones libre de aire.

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Protocol

NOTA: Todas las manipulaciones de oxígeno y sensibles a la humedad se llevaron a cabo bajo una atmósfera inerte (N2), utilizando cualquiera de las técnicas sin aire estándar o una caja de guantes. THF (tetrahidrofurano), Et 2 O (éter dietílico), CH 2 Cl 2 (diclorometano), tolueno, y pentano se purificaron pasando a través de una columna de alúmina neutra en atmósfera de argón. El acetonitrilo se secó sobre CaH 2 (hidruro de calcio) y se destiló bajo atmósfera de nitrógeno antes de su uso. Pd / C (paladio sobre carbono) se calentó a alto vacío a 100 ° C durante 12 h antes de su uso. El gel de sílice (malla 230-400) se secó durante 12 horas a 180 ° C bajo alto vacío. La cromatografía ultrarrápida se realizó con este gel de sílice bajo una atmósfera inerte. Todos los demás productos químicos y disolventes se adquirieron y utilizaron como se recibieron.

NOTA: Precaución, consulte todas las fichas de seguridad pertinentes (MSDS) antes de usar. Varios de los productos químicos utilizados en la síntesis de unare agudamente tóxico y cancerígeno.

1. Preparación de 1,2-Azaborines

NOTA: Los datos de caracterización de todos los compuestos en este estudio se ha informado anteriormente 12, 13, 16.

Figura 1
Figura 1: esquema de síntesis de 1,2-azaborines. Los protocolos detallados para la síntesis de cada compuesto (1-5) se describen en la sección de protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Preparación de N -allyl- N -TBS- B aducto de cloruro de alil (1)
    1. En una caja de guantes, mida 6,70 g (50,0 mmol) triallylborane 22 24/40 en un matraz de 1 L de fondo redondo secado al horno equipado con una barra de agitación y añadir 250 ml de diclorometano. Sellar el matraz con un septum de goma. Fuera de la caja, se enfría la solución a -78 ° C bajo una atmósfera de nitrógeno en un colector de gas de vacío.
    2. Añadir 100 ml de solución 1,00 M de boro tricloruro (100 mmol) en hexano a la solución triallylborane a -78 ° C a través de la transferencia de la cánula. Deje que la mezcla de reacción de agitación a esta temperatura durante 4 h.
      NOTA: Precaución, tricloruro de boro es altamente reactivo con agua.
    3. En un matraz de 100 ml separados, mida 25,7 g de N - (t -butildimetilsililo) - N -allylamine (150 mmol) y se añaden 20,0 ml de diclorometano. Al matraz de reacción de 1 L, añadir esta solución a través de transferencia cánula manteniendo la temperatura de reacción a -78 ° C.
    4. Añadir 21,0 ml de trietilamina (150 mmol) a la reacción. Mantener la agitación bajo un flujo positivo de nitrógeno y deje que se caliente gradualmente a los transbordadoresdurante la noche la temperatura om.
    5. Después de 18 h de agitación, eliminar aproximadamente la mitad del disolvente a través de un colector de gas vacío usando alto vacío (300 a 500 mTorr) con una trampa de nitrógeno líquido.
    6. Tome el matraz de reacción en una caja de guantes y se separa por filtración la sal blanco formado en la mezcla de reacción a través de una frita de porosidad media secado al horno equipado con un adaptador de 24/40 de vacío y un matraz de fondo redondo de 24/40 500 con un revuelo bar. Utilice diclorometano para transferir todos los materiales restantes.
    7. Retire todos los volátiles restantes a partir del filtrado fuera de la caja utilizando un colector de gas de vacío con alto vacío.
    8. En una caja de guantes, la transferencia de la mezcla de reacción se concentró en un horno secados 14/20 100 ml matraz de fondo redondo con una barra de agitación para preparar la destilación. Se tapa el matraz con un septum.
    9. Bajo un flujo de nitrógeno, abrir rápidamente el tabique y añadir hidruro de calcio 200 mg como agente de secado.
    10. Preparar el aparato de destilación mediante la instalación de un horno-secado 14/20 cabeza de destilación unida con un termómetro, un lado con un 14/20 matraz de 50 ml de almacenamiento libre de aire recepción y el otro lado con el matraz de 100 ml que contenía producto bruto. Dotar a la cabeza de destilación con agua fría. (Use grasa para todas las articulaciones del aparato de destilación.)
      NOTA: El producto comienza a destilar cuando la temperatura del vapor alcanza 60 ° C a 300 mTorr.
    11. Continuar recoger el producto elevando la temperatura del baño de aceite hasta que el termómetro cabeza de destilación lee 75 ° C.
      NOTA: El producto es un líquido transparente e incoloro.
    12. Detener la destilación mediante la eliminación de la fuente de calor y enfriar el aparato a la temperatura ambiente antes de su almacenamiento. Después de enfriar, presurizar el aparato con nitrógeno y cerrar herméticamente la válvula de tapón en el frasco de almacenamiento gratuito al aire. Almacenar el producto aislado en un congelador de la guantera.
      NOTA: El rendimiento puede variar de 65% a 84%.
  2. Preparación de N B -Cl producto de anillo cerrado (2)
    1. En una caja de guantes, mida 56,0 g N N -allyl- cloruro de -TBS- B alil aducto (1) (217 mmol) en un matraz de 1 L 24/40 de fondo redondo secado al horno con una barra de agitación y añadir 500 tolueno mL.
    2. Mide 1,79 g de catalizador de Grubbs 1 st generación (2,17 mmol).
    3. Añadir la parte a gota a la solución en agitación de 1 a temperatura ambiente en una caja de guantes catalizador. Purgar el cuadro durante la adición para eliminar el gas de etileno formado a partir de la reacción.
      NOTA: La reacción típicamente se completa en 30 minutos de haber cesado la evolución de gas. Como otro indicador de finalización, el color de la reacción habrá cambiado completamente de su inicial púrpura a marrón. En este punto, el producto puede ser aislado utilizando la destilación al vacío; véase la referencia 12 para más detalles. En este protocolo, se describe un solo recipiente, el procedimiento de dos etapas para la síntesis directa de 3.
    4. Preparación de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
      1. A la solución de reacción del producto de anillo cerrado (2) en tolueno, añadir 14,0 g de paladio sobre carbono (10% en peso de Pd, 13,2 mmol).
      2. Retirar el matraz de la caja y encajarlo con un condensador de reflujo 24/40 secado al horno que ha sido purgado con nitrógeno y equipado con agua fría.
      3. Calentar la reacción usando un baño de aceite a un reflujo vigoroso a 135 ° C mientras se agitaba.
      4. Después de mantener a reflujo durante 16 h, se enfría la reacción mediante la eliminación de el matraz del baño de aceite. Después de enfriar a temperatura ambiente, retirar una alícuota de 0,5 ml de la mezcla de reacción usando una jeringa equipada con una aguja de bloqueo Luer secado en horno. La transferencia de la alícuota de 0,5 ml a un tubo de RMN con tapa de rosca para analizar a través de 11 B 12 RMN.
        NOTA: El pico del producto deseado aparezca en ca. 35,5 ppm 12, mientras que el mater de partidaial pico aparece en ca. 42,9 ppm 12. Por lo general, en este punto 11 B RMN indica que la reacción es incompleta, con un pico de material de partida menor restante.
      5. Si la reacción es incompleta, llevar el matraz de reacción en una caja de guantes y añadir un adicional de 3,00 g de paladio sobre carbono (10% en peso de Pd, 2,82 mmol).
      6. Resubject la reacción a reflujo condiciones como se describe en 1.3.2 y 1.3.3.
      7. Después de 24 h más a reflujo, analizar otra alícuota de la reacción por 11 B RMN. En este punto, la reacción debe ser completa.
      8. Transferir al matraz de reacción a la guantera y pasar la mezcla de reacción a través de una columna de cromatografía flash desechable lleno de toallitas de papel. Recoger el filtrado de lavado con 50,0 ml de tolueno.
      9. Retire todos los volátiles del filtrado fuera de la caja en un colector de gas de vacío equipado con alto vacío.
        NOTA: La eliminación de los volátiles puede tardar 40 min to 90 min en función de la presión de vacío. Cuando el indicador de vacío lee la presión máxima, indica que la eliminación del disolvente se completa. Si bien la eliminación de disolvente, asegúrese de que el baño de agua por debajo del matraz se mantiene a temperatura ambiente durante la disipación de calor.
      10. En una caja de guantes, transferir la mezcla de reacción se concentró en un horno-seca 24/40 matraz de 250 ml de fondo redondo con una barra de agitación. Se tapa el matraz con un septum.
      11. eliminar rápidamente el tabique y añadir hidruro de calcio 200 mg como agente de secado.
      12. Preparar el aparato de destilación mediante la instalación de una cabeza de destilación 24/40 secado en horno adjunto con un termómetro, un lado con una recepción de 24/40 matraz de 100 ml de almacenamiento libre de aire y el otro lado con el matraz de 100 ml que contenía producto bruto. Dotar a la cabeza de destilación con agua fría. Utilice grasa para todas las articulaciones del aparato de destilación.
        NOTA: El producto empieza a destilar cuando la temperatura del vapor alcanza 65 a 70 ° C en 1000 mTorr con un aceitetemperatura del baño entre 90-100 ° C. El producto es un líquido transparente e incoloro.
      13. Detener la destilación mediante la eliminación de la fuente de calor y enfriar el aparato a la temperatura ambiente antes de su almacenamiento. Después de enfriar, presurizar el aparato con nitrógeno y cerrar herméticamente la válvula de tapón en el frasco de almacenamiento gratuito al aire. Almacenar el producto aislado en un congelador de la guantera a -30 ° C.
        NOTA: El rendimiento de la de un solo recipiente, el procedimiento de dos etapas es 52%.

    Figura 2
    Figura 2: 11 B espectros de RMN para la formación de seguimiento de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). A) N -Allyl- N -TBS-B-alil cloruro de aducto (1), el material para el anillo de metátesis de cierre de partida. B) La oxidación después de 16 h. (Producto de anillo cerrado que no ha reaccionado N -TBS- B -Cl (2) y isomerizado producto B vinil de anillo cerrado (2 ') junto con N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine se muestran (3).) C) La oxidación después de 24 h adicionales. D) producto aislado (3) después de la purificación por destilación a vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    1. Preparación de N -H- B OBu-1,2-azaborine (4)
      1. En una caja de guantes, mida 4,00 g de N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) en un matraz de 100 ml de fondo redondo secado al horno con una barra de agitación y añadir 35 ml de acetonitrilo. Mide 1,14 g acetamida (19,3 mmol) y transferir al matraz de reacción. Sellar el matraz con un septum de goma.
      2. Retirar el matraz de reacción de la caja y en forma de una juntaven-seca 24/40 condensador de reflujo que ha sido purgado con nitrógeno y equipado con agua enfriada.
      3. La reacción se calienta a reflujo a 85 ° C en un baño de aceite con agitación.
      4. Después de 3 h a reflujo, se enfría la reacción mediante la eliminación de el matraz del baño de aceite. Después de enfriar a temperatura ambiente, eliminar el disolvente en un colector de gas de vacío equipado con alto vacío.
      5. Después de retirar los volátiles bajo vacío, volver a disolver el residuo de la reacción en 15,0 ml de THF. A esta solución añadir 3,21 ml de n-butanol (35,1 mmol).
      6. Se agita la reacción a temperatura ambiente durante 1 h.
      7. Eliminar el disolvente en un colector de gas de vacío equipado con alto vacío para obtener el producto bruto.
      8. En una caja de guantes, aislar el producto por cromatografía en columna de gel de sílice, utilizando una mezcla de pentano y éter dietílico (5: 1) como eluyente. Eliminar los volátiles de las fracciones que contienen el producto utilizando un colector de gas de vacío equipado con alto vacío para obtener el producto puro comoun sólido blanco.
        NOTA: El rendimiento puede variar de 82% a 87%.
    2. Preparación de N -H- B etil-1,2-azaborine (5)
      1. En una caja de guantes, mida 1,00 g de N- H -B- OBu-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) en un matraz de 100 ml de fondo redondo secado al horno con una barra de agitación y se añaden 25 ml de Et 2 O. Seal el matraz con un septum de goma y de lugar en N 2 en un colector de gas de vacío.
      2. En un matraz de 100 ml de fondo redondo secado al horno separado, añadir 26,5 ml de solución de etil-litio (0,5 M en benceno / ciclohexano, 13,2 mmol) en atmósfera de nitrógeno. Retirar la mezcla del disolvente (benceno / ciclohexano) a partir del reactivo etil-litio para evitar problemas con el aislamiento del producto deseado azaborine. Se vuelve a disolver el etil-litio sólido en 13,0 ml de Et 2 O.
        NOTA: Precaución: reactivos de organolitio son pirofóricos (inflamable en contacto con el aire o el agua). El producto deseado (5
      3. Se enfría el matraz de reacción que contiene 4 a -30 ° C con un baño de enfriamiento.
      4. Añadir la solución de etil-litio al matraz de reacción a través de transferencia cánula a -30 ° C. Mantener la agitación a esta temperatura durante 1 h y dejar que se caliente lentamente a temperatura ambiente.
      5. Controlar la reacción en un 11 B RMN. (El pico intermedio deseado aparece a aproximadamente 39,8 ppm).
      6. Tras la finalización de la reacción, se enfría la reacción a -30 ° C y añadir una solución de HCl 6,62 ml (2,0 M en Et2O, 13,2 mmol). Agitar la reacción durante 1 h, mientras que lo que le permite calentar lentamente a temperatura ambiente.
      7. Eliminar el disolvente en un colector de gas de vacío equipado con un vacío bajo (20 a 25 Torr) para obtener la mezcla de producto en bruto.
      8. En una caja de guantes,aislar el producto mediante cromatografía en columna de gel de sílice, usando 2-metilbutano como eluyente. Retire el volátil en un colector de gas de vacío equipado con un vacío atenuada para obtener el producto puro como un líquido incoloro.
        NOTA: El rendimiento es del 56%.

    2. Preparación y cristalización de proteínas de mutantes de lisozima T4

    1. expresión y purificación de proteínas
      1. Se cultivan las células E. coli RR1 transformado con los plásmidos subclonados (L99A o L99A / M102Q) 17, 20 en 200 ml de LB (caldo de lysogeny) suplementado con 40,0 mg de ampicilina a 37 ° C durante 12 h.
        NOTA: La composición de los medios LB es 12 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, cloruro de sodio 10 g, y 1 g de glucosa por 1 LH 2 O.
      2. Inocular 4.00 medios L LB (suplementado con 800 mg de ampicilina) con 160 ml de cultivo de una noche y se incuba a 37 ° C a 240 rpm con un filteresuministro de aire d.
      3. Cuando la densidad óptica alcanza 0,7 a 600 nm, enfriar el cultivo bacteriano a la temperatura ambiente mediante la eliminación de la incubadora.
      4. Medir 695 mg de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (concentración final de 0,7 mM) en un tubo de centrifugación cónico y añadir 4 ml de medio LB a disolverse.
      5. Añadir la solución de IPTG al cultivo para inducir la expresión de la proteína. Se incuban los cultivos a 110 rpm durante 21 horas a 25 ° C.
      6. Se centrifuga el cultivo a 4.412 xg durante 30 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 300 ml de fosfato de sodio 0,1 M (pH 6,6), 0,2 M NaCl y añadir 30,0 ml de ácido 0,5 M etilendiaminotetraacético (EDTA) (pH 8,0). Se agita la suspensión durante 17 horas a 4 ° C.
      7. Añadir 30,0 ml de 1,0 M MgCl 2 y 0,500 ml de desoxirribonucleasa I (ADNasa I) a la suspensión y se agita a temperatura ambiente durante 8 h.
      8. Centrifugar la suspensión de células lisadas a 30.913 xg durante 30 min a 4 76; C. Recoger el sobrenadante que contiene proteína expresada y desechar el sedimento.
      9. Se dializa el lisado frente a fosfato 20 mM de sodio (pH 6,5 para L99A y pH 6,3 para L99A / M102Q) a 4 ° C durante la noche.
      10. Lavar y equilibrar 20,0 ml de perlas de intercambio de iones de carboximetilo con tampón de equilibrado (Tris 50 mM, EDTA 1 mM (pH 7,3)) en una columna. Cargar la proteína solución que contiene sobre las perlas y se lava la columna con 100 ml del tampón de equilibrado. Eluir la columna con un gradiente de 600 ml lineal de NaCl 300 mM en el tampón de equilibrado.
      11. Utilice un sistema de cromatografía de baja presión para la purificación en columna. Utilice una velocidad de bombeo de 1 ml / min y recoger fracciones de 10 ml. Reunir las fracciones que contienen proteína pura.
        NOTA: Durante la elución, controlar la densidad óptica (DO) a 280 nm para verificar la presencia de la proteína. Determinar la pureza de cada fracción por SDS-PAGE y recoger solamente las fracciones más puras.
    "Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 1
    Figura 3: Los resultados representativos para la purificación de proteínas de la T4 lisozima mutante L99A / M102Q. A) cromatograma que muestra la absorbancia UV medido en AU a 280 nm (línea azul) y la conductividad en mS / cm (línea roja). Las fracciones 20-23 se combinaron y la pureza se determinó por SDS-PAGE. B) 15% de gel de SDS-PAGE que muestra la presencia de proteína purificada de las fracciones 20-23 en 18,6 kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    1. cristalización de proteínas
      1. Transferir la solución de proteína purificada a un tubo de membrana de diálisis (12.000 a 14.000 MWCO). Colocar el tubo de diálisis en un vaso de precipitados que contiene 4,00 l de fosfato de sodio 100 mM, NaCl 550 mM, 0,02% NaN 3 (pH 6,5 para L99A y pH 6,3 para la L99A / M102). Se agita la solución de 4 L noche a 4 ° C.
      2. Añadir 2-mercaptoetanol (concentración final de 5 mM) a la muestra dializada y se concentra para ~ 40,0 mg / ml usando un concentrador centrífugo (10.000 MWCO). Determinar la concentración de proteínas mediante la medición de la absorción a 280 nm. Eliminar cualquier precipitado por centrifugación antes de la cristalización.
      3. Utilice el método de la gota pendiente vapor de difusión para la cristalización de proteínas. Mezclar 5,00 l de la solución de proteína concentrada con 5,00 l de la solución de reserva (2,0 a 2,2 / M de fosfato de sodio de potasio, pH 6.7 a 7.1, 50 mM 2-mercaptoetanol, 50 mM 2-hidroxietil disulfuro) en un portaobjetos de cubierta de vidrio siliconado.
      4. Equilibrar la caída de mezcla contra 1,00 ml de la solución de depósito mediante la colocación de la tapa deslizante boca abajo encima de la solución de depósito que contiene cada pocillo. Utilice grasa para sellar herméticamente cada pocillo con la corredera. Configurar varias condiciones utilizando una placa de 24 pocillos con solución de depósito mencionado en el punto 2.2.3.Almacenar la placa a 4 ° C para el crecimiento de cristales.
        NOTA: Los cristales crecen normalmente dentro de 1-2 semanas en el búfer completo equilibrado en la tapa deslizante. precipitación inmediata durante la mezcla solución de proteína con la solución de depósito en el paso 2.2.3 indica el fracaso de la cristalización.

    Figura 4
    Figura 4: imagen representativa de los cristales de lisozima T4 L99A mutante antes de la formación de complejos con ligandos. Los cristales son en el licor madre (2,1 M / fosfato de sodio de potasio, pH 6,9, 50 mM 2-mercaptoetanol, 50 mM 2-hidroxietil disulfuro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    1. preparación de complejo
      1. Recoger los cristales utilizando una forma en un bucle de tubo criogénico (ver Lista de Materiales) ycolocarlos en un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Añadir 50,0 l de licor madre al tubo para evitar la sequedad y preservar los cristales.
        NOTA: la selección de cristal único es ayudada por el uso de un microscopio.
      2. Transferir el tubo que contiene cristales en una caja de guantes. Tome 5,00 l de ligando azaborine (5) y el lugar en el interior del complemento tapón del tubo. Tapa y almacenar el tubo en un refrigerador (4 ° C) en el interior de la guantera durante 2-7 días para el equilibrado por la difusión del vapor.
        NOTA: Las propiedades físicas (alta volatilidad y solubilidad en solución acuosa) del ligando azaborine (5) permite la formación de complejos con los cristales de proteína preformados mediante el método de difusión de vapor.
      3. La transferencia de los cristales utilizando una forma en un bucle a un portaobjetos de vidrio que contiene una gota de N-Paratone antes de flash-congelación en nitrógeno líquido tubo criogénico. Recoger el cristal protegido con N-Paratone y rápida de flash-congelación al sumergirse en el cristalbucle en un dewar que contiene nitrógeno líquido. Montar el cristal en bucle mediante el uso de una tenaza criogénico.
      4. Reunir conjuntos de datos de un solo cristal utilizando radiación sincrotrón. Realizar la sustitución molecular utilizando estructuras publicadas 20, 24; verificar la existencia de ligando en el sitio de unión de proteínas por una mancha-un modelo de densidad de electrones.

    Figura 5
    Figura 5: modelos atómicos de mutante L99A T4 lisozima bolsillo de unión con la densidad de electrones. A) L99A cavidad con una gota de densidad de electrones no-modelado en el sitio de unión. B) L99A cavidad con el ligando azaborine modelada 5 en dos confórmeros alternativos. Por favor, click aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

La vía de síntesis esquemático para 1,2-azaborines se muestra en la Figura 1. Este protocolo se aplica a la síntesis de cinco moléculas de nitrógeno que contiene boro diferentes. La Figura 2 representa los espectros de 11 B NMR medida durante el curso de la etapa 1.3 para monitorizar la formación del producto deseado (3). Purificación de proteínas se realizó mediante el uso de sistema de cromatografía de baja presión y un cromatograma representativo se muestra en la Figura 3. La pureza de las fracciones recogidas se determinó por SDS-PAGE. Los cristales de lisozima T4 L99A mutante se representan en la Figura 4. La figura 5 muestra el bolsillo de unión L99A con la densidad de electrones no-modelado y la cavidad de unión después de refinamiento con el ligando unido 5.

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Discussion

En la primera parte de este protocolo, se describe una síntesis modificada de 1,2-azaborines basadas en métodos reportados previamente 12, 13. Triallylborane 22 fue utilizado como un sustituto de las rutas usando allyltriphenyl estaño o de potasio allyltrifluoroborate para preparar N -allyl- N -TBS- B alil aducto de cloruro de (1). Este método permite un enfoque más átomos-económica y respetuosa con el medio ambiente. Para la síntesis de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3), se empleó un solo recipiente, la secuencia de dos pasos (cierre de anillo por metátesis seguido de oxidación), que resultó en un rendimiento más alto que el anterior aislado método que implica el aislamiento del compuesto intermedio (2) (52% vs. 29% en dos etapas). (Sin embargo, etapa de oxidación dependiendo de la pureza del producto de adición (1), el aislamiento del producto de anillo cerrado antespodría ser necesario el uso de destilación al vacío. En este caso, usando diclorometano como disolvente en lugar de tolueno reduce el tiempo para la eliminación de sustancias volátiles antes de la destilación.) Supervisión de 11 B RMN (figura 2) durante la etapa de oxidación también se beneficia en la reducción en las cantidades totales de Pd / C utilizados en este de reacción (7 mol% vs 15% mol).

Síntesis de N -H- B etil-1,2-azaborine (5) se llevó a cabo en dos etapas a partir de 4 usando etil-litio en lugar de la secuencia de varios pasos se informó anteriormente 16 que requiere el uso de un complejo de cromo. El aislamiento requiere un control preciso de la temperatura y la manipulación vacío atenuada debido a la volatilidad del producto. Las técnicas presentadas en este protocolo también se puede aplicar a la purificación de otros compuestos volátiles.

En la segunda parte, hemos demostrado la purificación de proteínas y la formación de complejos de cristalde T4 lisozima mutantes L99A y L99A / M102Q. A la expresión de proteínas estándar en E. coli cepa RR1 y la inducción con IPTG, seguido por lisis celular química aislamiento proporcionó de la proteína deseada. Se recomienda que se ejecutan SDS-PAGE después de la expresión de la proteína y la lisis celular para confirmar el éxito de cada paso o identificar el proceso fallado. Para la lisozima T4 L99A, la proteína expresada se puede encontrar tanto en el sobrenadante y el sedimento debido a su actividad para lisar células bacterianas. En este caso, la proteína en el sobrenadante puede ser dializó frente a tampón de fosfato de sodio 20 mM y se combinó con lisado de lisis celular para la purificación en columna. condiciones de inducción se pueden ajustar a una temperatura más alta y el tiempo más corto (de 21 horas a 25 ° C a 2-3 horas a 37 ° C). La lisis celular también se puede realizar mediante el uso de ultrasonidos con un baño de hielo para evitar el sobrecalentamiento. columna de intercambio de iones de carboximetilo con un gradiente lineal de NaCl 300 mM se utilizó para la purificación de proteínas. Sólo> 95% de pureza (basado en SDS-PAGE) las fracciones de proteína fueron recogidos y utilizados en la cristalización de proteínas.

Antes de la concentración de la solución de proteína, la adición de 2-mercaptoetanol (concentración final de 5 mM) (etapa 2.2.2) a la proteína dializada era necesaria para evitar su precipitación espontánea, sobre todo para la proteína L99A / M102Q que tiende a precipitar fácilmente en alto concentración. Como la formación de complejos de proteína con 5 requiere un ambiente libre de aire, el complejo proteína-ligando se preparó en una caja de guantes. Los materiales preparados en este protocolo se utilizaron en los estudios de 1,2-azaborines unión en un sistema modelo biológico: los mutantes de lisozima cavidad-bearingT4.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% Sigma Aldrich 34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free Sigma Aldrich 309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) Fisher D37-20
Toluene Fisher T290-4
Pentane, HPLC Fisher P399-4
Acetonitrile Fisher A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% Sigma Aldrich 208027 Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd Strem 46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane Sigma Aldrich 211249 Highly toxic/Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5% Sigma Aldrich 471283
Grubbs 1st generation catalyst  materia C823
Acetamide Sigma Aldrich A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane Sigma Aldrich 561452 Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O Sigma Aldrich 455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% Sigma Aldrich 277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) ATCC 31343
T4 lysozyme WT* (L99A) Addgene 18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) Addgene 18477
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Invitrogen AM9464
Sodium phosphate monobasic anhydrous Fisher BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher BP332
Sodium chloride Fisher S642212 
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BP118
Magnesium chloride Sigma Aldrich M4880 Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI Fisher PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media Fisher 45-002-931
Tris-base Fisher BP152-500 
Sodium azide TCI S0489 Highly toxic
2-Mercaptoethanol Fisher ICN806443 
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators Fisher 14-558-501
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
2-Hydroxyethyl disulfide Sigma Aldrich 380474
N-paratone  Hampton Research HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO  Fisher 08-667E
 CryoLoop Hampton Research cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong Thermo Fisher cryogenic tong
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References

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Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes
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Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis ofMore

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants. J. Vis. Exp. (121), e55154, doi:10.3791/55154 (2017).

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