Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

1,2-Azaborines Sentezi ve T4 Lizozim Mutants ile Bunların Protein Kompleksleri hazırlanması

Published: March 25, 2017 doi: 10.3791/55154
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Boston College

Introduction

Heterosikller (yani 1,2-azaborines) içeren Bor-Azot son zamanlarda arenlerin izosterlerinin olarak büyük ilgi çekmiştir. Bu isosterism kimyasal alanı 2, 3, 4 genişletmek için mevcut yapısal motifler çeşitlendirilmesi yol açabilir. Azaborines özellikle kimyagerler yapısal kütüphanelerinden ve fonksiyonel olarak ilgili moleküllerin sentezi gerçekleştirmek olan tıbbi kimya alanında, biyomedikal araştırmalar 5, 6, 7, 8 uygulama için potansiyel kullanıma sahiptir. Fakat önemli iken, mevcut aren içeren moleküller çok sayıda iyi gelişmiş sentetik yolları vardır, azaborines sentezi için yöntemler sadece sınırlı sayıda rapor edilmiştir 9, 10, 11, 12, 13 kadar. Bunun nedeni sentetik dizinin erken evrede bor kaynağı ve hava ve molekülün neme hassas doğası için çeşitli seçenekler sınırlı sayıda esas olan.

Bu yazının ilk bölümünde, biz (3) standart hava içermeyen teknikler kullanılarak N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine bir çok gram ölçekli sentezini anlatacağız. Bu bileşik daha ileri yapısal olarak daha karmaşık moleküllerdir 14, 15 fonksiyonalize edilebilir çok yönlü bir ara madde olarak hizmet eder. 3 ile başlayarak, protein bağlama çalışmalarında kullanılmak üzere N -H- B-etil-1,2-azaborine (5) sentezi ve saflaştırılması tarif edilecektir. 5 volatilite nedeniyle, onun etkin izolasyon reaksiyon sıcaklığı, süresi ve dist hassas kontrol gerektirirsonuç çıkarma koşulları.

İkinci bölümde, protein ekspresyonu ve T4 lizozim mutantlar (L99A ve L99A / M102Q) 17, 18, 19 izolasyonu için protokoller, 20, protein kristalleştirme ve protein-ligand bir kristal komplekslerinin hazırlanması ve ardından sunulacaktır. T4 lizozim mutantları L99A ve L99A / M102Q NH azaborine moleküller 17 ihtiva eden hidrojen bağlama yeteneğini incelemek için biyolojik model sistemleri seçilmiştir. Standart moleküler biyoloji protokolü kullanarak protein E. coli RR1 suşunda ifade izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile teşvik edilir. Protein saflaştırma iyon değiştirme kolon kromatografisi ile gerçekleştirilir. Protein kristalleştirme asılı kullanılarak (jel elektroforezi ile>% 95 saflık), yüksek konsantrasyonlu saflaştırılmış protein çözeltisi ile gerçekleştirilirbuhar difüzyon yöntemi bırakın. Çünkü oksijenin Bu çalışmanın ligandların duyarlılık protein-ligand kompleksleri, hava içermeyen koşullar altında hazırlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: tüm oksijen ve neme duyarlı manipülasyonlar standart hava içermeyen teknikleri veya bir eldiven kutusu kullanılarak inert bir atmosfer (N2) altında gerçekleştirilmiştir. THF (tetrahidrofuran), Et, 2 O (dietil eter), CH2 Cl2 (diklorometan), toluen ve pentan argon altında nötr alümin kolonundan geçirilerek saflaştırılmıştır. Asetonitril CaH 2 (kalsiyum hidrid) üzerinde kurutuldu ve kullanımdan önce nitrojen atmosferi altında damıtıldı. Pd / C (karbon üzerinde paladyum) kullanımdan önce 12 saat boyunca 100 ° C'de yüksek vakum altında ısıtılmıştır. Silika jeli (230-400 göz), yüksek vakum altında 180 ° C'de 12 saat boyunca kurutulmuştur. Flaş kromatografi inert bir atmosfer altında, bu, silika jel ile gerçekleştirildi. Bütün diğer kimyasal maddeler ve çözücüler alındı ​​ve alındığı şekilde kullanıldı.

NOT: Dikkat, kullanılmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) başvurun. sentez, kullanılan kimyasalların bazılarıakut toksik ve kanserojen yeniden.

1,2-Azaborines hazırlanması 1.

NOT: Bu çalışmadaki tüm bileşiklerin karakterizasyon verileri, daha önce, 16, 12, 13 olarak bildirilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1: 1,2-azaborines sentetik şeması. Her bir bileşik (1-5) sentezi için ayrıntılı protokoller, protokol bölümünde tarif edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. N Hazırlanması N -TBS- B alil klorür ilave maddesinin -allyl- (1)
    1. Bir eldiven kutusu içinde, dışarı 6.70 g (50.0 mmol) triallylbora ölçmekBir fırında kurutulmuş 24/40 1 litrelik yuvarlak dipli bir şişeye NE 22 Bir karıştırıcı çubuğu ile teçhiz edilmiş, 250 ml diklorometan ilave edin. Bir lastik septum ile balon kapatın. kutu dışında, çözelti soğumaya -78 ° C bir vakum gaz manifoldu üzerinde, bir nitrojen atmosferi altında tutuldu.
    2. Kanül transferi ile, -78 ° C de triallylborane çözeltisine heksan içinde 1.00 M boron triklorür solüsyonu (100 mmol) 100 ml. 4 saat bu sıcaklıkta, reaksiyon karışımı, karışmaya bırakıldı.
      NOT: Dikkat, bor triklorür su ile son derece reaktif olduğunu.
    3. (T-butildimetilsilil) - - ayrı 100 mL şişe içinde, 25.7 g N ölçmek N -allylamine (150 mmol) ve 20.0 ml diklorometan ilave edin. 1 L'lik tepkime şişesine, -78 ° C'de reaksiyon sıcaklığı kanül transferi yoluyla çözeltisi ilave edilir.
    4. Reaksiyona 21.0 ml trietilamin (150 mmol) ekleyin. pozitif bir azot akışı altında karıştırılarak muhafaza etmek ve yavaş yavaş sıcak RO izinom sıcaklığı gece boyunca karıştırıldı.
    5. 18 saat karıştırıldıktan sonra, bir sıvı azot tuzağı ile yüksek vakum (300-500 mTorr'dur) kullanarak bir vakum gaz manifoldu ile çözücünün yaklaşık olarak yarısı çıkarın.
    6. bir eldiven kutusu içine Reaksiyon şişesi al ve bir karıştırma ile 24/40 vakum adaptörü ile donatılmış fırında kurutulmuş orta gözenekli frit ve 24/40 500 mL'lik yuvarlak dipli bir şişede ile reaksiyon karışımı içinde meydana gelen beyaz tuzlar filtre bar. Kalan tüm malzeme transferi için diklorometan kullanın.
    7. yüksek vakum ile bir vakum gaz manifoldu kullanılarak kutunun dışında süzüntüden kalan tüm uçucuların çıkarın.
    8. Bir eldiven kutusu içinde, damıtma hazırlamak için bir karıştırma çubuğuna sahip olan, bir fırında kurutulmuş 14/20 100 mL'lik yuvarlak tabanlı bir balon içinde konsantre edilmiş reaksiyon karışımı aktarın. bir septum ile balon kap.
    9. bir azot akımı altında, hızlı bir şekilde septum açık ve bir kurutma maddesi olarak 200 mg kalsiyum hidrid ekleyin.
    10. Bir fınnla takarak damıtma aparatı kurmakBir termometre ile bağlı 14/20 distilasyon kafası, bir alıcı 14/20 50 ml hava içermeyen bir depolama şişesi ile bir tarafı ve ham ürün ihtiva eden 100 ml bir şişede ile diğer tarafı kurutulmuştur. soğutulmuş su distilasyon kafası donatmak. (Damıtma cihazının tüm eklemler için gres kullanın.)
      NOT: Ürün buhar sıcaklığı 300 mTor 60 ° C ulaştığında damıtmak başlar.
    11. damıtma kafası termometre 75 ° C okuyana kadar yağ banyosunun sıcaklığını yükselterek ürünü toplamaya devam.
      NOT: ürün berrak, renksiz bir sıvıdır.
    12. ısı kaynağı kaldırarak damıtma durdurun ve depolamadan önce, oda sıcaklığına kadar soğumaya cihaz. Soğuduktan sonra, azotla aparatı basýnç ve sıkıca hava serbest depolama şişesi üzerinde fiş vanasını kapatın. Bir torpido gözü dondurucuda izole ürünü saklayın.
      NOT: verim% 65% 84 arasında değişebilir.
  2. N hazırlanması B -Cl halka kapalı ürün (2)
    1. Bir eldiven kutusu içinde, bir karıştırma çubuğuna sahip olan, bir fırında kurutulmuş 24/40 1 litrelik yuvarlak dipli bir reaksiyon kabı içinde 56.0 g N -allyl- N -TBS- B -alil klorid adüktü (1) (217 mmol) ölçülmesi ve 500 ekleme ml tolüen.
    2. Dışarı 1.79 g Grubblar 1. nesil katalizör (2.17 mmol) ölçün.
    3. kısımlar halinde, bir eldivenli kutu içinde oda sıcaklığında 1 karıştırılan çözeltiye katalizörü ilave edin. reaksiyonundan oluşan etilen gazı çıkarmak için ekleme sırasında kutu temizleyin.
      Not: Reaksiyon Gaz oluşumu kesildikten sonra 30 dakika içinde, tipik olarak tamamlanır. tamamlanma başka göstergesi olarak, reaksiyon rengi tamamen kahverengiye ilk mor değişmiş olacaktır. Bu noktada, ürün, vakum altında damıtma yoluyla izole edilebilir; Ayrıntılar için başvuru 12 bkz. Bu protokol, 3 doğrudan sentezi için bir tek kap, iki aşamalı bir prosedür tarif edilmektedir.
    4. N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine hazırlanması (3)
      1. Toluen zincir-kapalı bir ürün (2) tepkime çözeltisine, karbon (ağırlık olarak% 10 Pd, 13.2 mmol) ile 14.0 g palladyum.
      2. kutusundan balon çıkarın ve azot ile temizlenmiş ve soğuk su ile donatılmış olan bir fırında kurutulmuş 24/40 geri akış yoğunlaştırıcısı ile uygun.
      3. karıştırılarak 135 ° C de şiddetli bir geri akışa kadar bir yağ banyosu kullanılarak reaksiyon ısısı.
      4. 16 saat geri akışta tutulduktan sonra, yağ banyosundan balon kaldırarak reaksiyonu soğutun. Oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra, bir fırında kurutulmuş Luer kilit iğnesi ile donatılmış bir şırınga kullanılarak, reaksiyon karışımından 0.5 ml kısım geri. 11 B NMR 12 üzerinden analiz etmek için bir vida-üst NMR tüpe 0.5 ml kısım aktarın.
        Not: İstenilen ürün zirve yaklaşık görünür 35.5 ppm 12, başlangıç mater iseial zirve ca görünür. 42.9 ppm 12. Genellikle bu noktada 11 B at NMR reaksiyon küçük bir başlangıç maddesi zirve kalan, eksik olduğunu gösterir.
      5. Reaksiyon tamamlanmamış ise, bir eldiven kutusu içine Reaksiyon şişesi getirmek ve karbon (ağırlık olarak% 10 Pd, 2.82 mmol), ek bir 3.00 g palladyum.
      6. 1.3.2 ve 1.3.3, tarif edilen şartlar geri akışa reaksiyonun Resubject.
      7. Refluksta 24 saat sonra, 11 B, NMR ile reaksiyonun bir kısım analiz eder. Bu noktada, reaksiyon, tam olmalıdır.
      8. torpido gözü reaksiyon şişesi aktarın ve kağıt mendil ile dolu bir atılabilir flaş kromatografi kolonu içinden reaksiyon karışımı geçmektedir. tolüen 50.0 mL yıkanarak süzüntü toplanır.
      9. yüksek vakum ile donatılmış bir vakum gaz manifoldu üzerine kutunun dışında süzüntüden tüm uçucuların çıkarın.
        NOT: Uçucu maddelerin uzaklaştırılması 40 dk t alabiliro 90 dakika vakum basıncına bağlı olarak. Vakum göstergesi, maksimum basınç okuduğunda, Çözücünün çıkarılması tamamlandığını gösterir. Çözücü çıkartılırken, şişenin altında su banyosu ısı dağılımı için oda sıcaklığında kalır emin olun.
      10. Bir eldiven kutusu içinde, bir karıştırma çubuğuna sahip olan, bir fırında kurutulmuş 24/40 250 mL'lik yuvarlak tabanlı bir balon içinde konsantre edilmiş reaksiyon karışımı aktarın. bir septum ile balon kap.
      11. Hızlı bir şekilde septum çıkarın ve bir kurutma maddesi olarak 200 mg kalsiyum hidrid ekleyin.
      12. bir termometre ile bağlanan bir fırında kurutulmuş 24/40 damıtma kafası, bir alıcı 24/40 100 ml hava içermeyen bir depolama kabı ve ham ürün ihtiva eden 100 ml bir şişede, diğer yüzü bir tarafı oturtulması ile damıtma aygıtı ayarlayın. soğutulmuş su distilasyon kafası donatmak. damıtma cihazının tüm eklemler için gres kullanın.
        Not: ürün buhar sıcaklığı, bir yağ olan 1.000 mTorr en 65-70 ° C olduğunda, damlamaya başlar90-100 ° C arasında banyo sıcaklığı. ürün berrak, renksiz bir sıvıdır.
      13. ısı kaynağı kaldırarak damıtma durdurun ve depolamadan önce, oda sıcaklığına kadar soğumaya cihaz. Soğuduktan sonra, azotla aparatı basýnç ve sıkıca hava serbest depolama şişesi üzerinde fiş vanasını kapatın. -30 ° C'de bir eldiven kutusu dondurucu İzole edilen ürünün saklayın.
        Not: tek kap, iki aşamalı bir prosedür verim 52% 'dir.

    şekil 2
    Şekil 2: N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine oluşumunu izlemek için 11 B NMR spektrası (3). A) N -Allyl- N -TBS-B-allil klorid adüktü (1), bir halka kapama metatezi için başlangıç malzemesi. 16 saat sonra B) oksidasyonu. (Reaksiyona girmemiş N -TBS- B -Cl halka kapalı ürün (24 saat daha sonra 2) ve (3) gösterilmektedir, N-TBS-B-Cı-1,2-azaborine ile izomerize B -vinil zincir-kapalı bir ürün (2 ')). C) oksidasyonu. Vakumla damıtma ile saflaştırma sonrası D) İzole edilen ürün (3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    1. N -H- B -Obu-1,2-azaborine hazırlanması (4)
      1. Bir eldiven kutusu içinde, dışarı 4.00 g N-TBS -B- Cı-1,2-azaborine ölçmek (3), bir karıştırma çubuğu olan bir fırında kurutulmuş 100 mL'lik yuvarlak dipli bir şişede (17.6 mmol) ve 35 ml asetonitril ilave edin. üzerinden 1.14 g asetamid (19.3 mmol) ölçülür ve reaksiyon balonuna aktarılır. Bir lastik septum ile balon kapatın.
      2. kutusundan reaksiyon balon çıkarın ve bir o ile uyumnitrojen ile temizlendi ve soğuk su ile donatılmıştır 24/40 geri akış kondansatörü ven-kurutulmuştur.
      3. karıştırılarak bir yağ banyosu içinde 85 ° C'de geri akışa kadar reaksiyon ısısı.
      4. geri akış sıcaklığında 3 saat sonra, yağ banyosundan balon kaldırarak reaksiyonu soğutun. Oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra, yüksek vakum ile donatılmış bir vakum gaz manifoldu üzerine çözücüyü çıkarın.
      5. Uçucu bileşenlerin vakum altında uzaklaştırılmasından sonra, 15.0 ml THF içinde, reaksiyon artığı çözülür. Bu çözeltiye, n-butanol (35.1 mmol) 3.21 ml.
      6. 1 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyona karıştırın.
      7. ham ürün elde etmek üzere yüksek vakum ile donatılmış bir vakum gaz manifoldu üzerine çözücüyü çıkarın.
      8. (5: 1) yıkama sıvısı olarak bir eldiven kutusu içinde, pentan ve dietil eterin bir karışımı kullanılarak, silika jel kolon kromatografisi ile ürünü izole eder. saf ürün elde etmek üzere yüksek vakum ile donatılmış bir vakum gaz manifoldu kullanılarak ürün içeren fraksiyonlardan uçucu maddelerin ayrılmasıbeyaz bir katı.
        NOT: Verim% 82,% 87 arasında değişebilir.
    2. N -H- B-etil-1,2-azaborine hazırlanması (5)
      1. Bir eldiven kutusu içinde, bir karıştırma çubuğuna sahip olan, bir fırında kurutulmuş 100 mL'lik yuvarlak dipli bir şişede 1.00 g N-H -B- Obu-1,2-azaborine (4) (6.62 mmol) ölçmek ve ilave 25 mL Et 2 O. Seal bir vakum gaz manifoldu üzerinde N2 altında bir lastik septum ve yer ile şişesi.
      2. Ayrı bir fırında kurutulmuş 100 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, azot atmosferi altında, etillityum çözeltisi (benzen / sikloheksan içinde 0.5 M, 13.2 mmol), 26.5 ml. İstenilen azaborine ürünü izole sorunları önlemek için etillityum reaktifi çözücü (benzen / sikloheksandan) karışımı çıkarın. 13.0 ml Et 2 O. katı etillityum çözülür
        Not: Dikkat: organolityum reaktifleri piroforik (hava ya da su ile temas ettiğinde tutuşabilen) 'dir. Arzu edilen ürün (5
      3. bir soğutma banyosu ile 4 ila -30 ° C içeren reaksiyon balonuna soğutun.
      4. -30 ° C'de kanül transferi yoluyla reaksiyon şişesine etillityum çözeltisi ekleyin. 1 saat boyunca bu sıcaklıkta karıştırıldıktan edin ve oda sıcaklığına kadar bu yavaş yavaş ısınmaya bırakın.
      5. 11 B NMR ile reaksiyonu izleyin. (Istenen ara zirve yaklaşık 39.8 ppm görünür.)
      6. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, -30 ° C'ye kadar reaksiyon soğumaya bırakıldı ve 6.62 ml HCI çözeltisi (Et 2 O içinde 2.0 M, 13.2 mmol) ekleyin. Oda sıcaklığına kadar yavaş yavaş ısınmaya bırakarak 1 saat boyunca reaksiyona karıştırın.
      7. Ham ürün karışımı elde etmek için düşük vakumda (20-25 Torr) ile teçhiz edilmiş bir vakum gaz manifoldu üzerine çözücüyü çıkarın.
      8. Bir eldiven kutusu içinde,yıkama sıvısı olarak 2-metilbütan kullanılarak, silika jel kolon kromatografisi ile ürünü izole eder. renksiz bir sıvı olarak saf ürün elde etmek için azaltılmış vakum ile donatılmış bir vakum gaz manifoldu uçucu çıkarın.
        NOT: verim% 56 olduğunu.

    2. Protein Hazırlama ve T4 Lizozim Mutantlarının kristalleştirilmesi

    1. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması
      1. Alt-klonlanmıştır plazmidler (L99A ve L99A / M102Q), 200 mL LB 17, 20 (lizojeni suyu) 12 saat boyunca 37 ° C'de 40.0 mg ampisilin ile desteklenmiş ortam ile transforme edilmiş E. coli RR1 hücreleri büyütün.
        Not: LB ortamı bileşimi 12 g tripton, 5 g maya ekstresi, 10 g sodyum klorür ve 1 LH 2 O 1 g glikozdur
      2. gece boyunca kültür 160 mL (800 mg ampisilin ile desteklenmiş) 4.00 L LB ortamı aşılamak ve filtresi oluşturmak 240 rpm'de 37 ° C'de inkübed hava kaynağı.
      3. Optik yoğunluk, 600 nm'de 0.7 ulaştığında, inkübatör kaldırarak, oda sıcaklığına kadar soğumaya bakteri kültürü.
      4. konik santrifüj tüpü içinde izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) (0.7 mM'lik nihai konsantrasyon) 695 mg ölçün ve eritmek için 4 ml LB ortamı ilave edin.
      5. Protein ekspresyonu indükte etmek için kültür IPTG çözeltisi ekleyin. 25 ° C'de 21 saat boyunca 110 rpm'de kültürleri inkübe edin.
      6. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 4.412 x g'de kültür santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 0.1 M sodyum fosfat (pH 6.6), 0.2 M NaCl, 300 ml pelet 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) (pH 8.0) 30.0 ml. 4 ° C'de 17 saat süspansiyonu karıştırılır.
      7. Süspansiyona deoksiribonükleaz 1.0 M MgCI2 ve 0.500 mL I (DNase I) 'in 30.0 ml ilave edilir ve 8 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı.
      8. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 30.913 x g'de Parçalanan hücre süspansiyonu santrifüj 76 ° C. ifade proteini içeren süpernatant toplayın ve pelet atın.
      9. gece boyunca 4 ° C 'de (L99A / M102Q için L99A pH 6.5 ve pH 6.3), 20 mM sodyum fosfat karşı lizat dialyze.
      10. Yıkayın ve bir sütun dengeleme tamponu (50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7.3)) ile karboksimetil iyon değişim boncuk 20.0 mL dengeye. boncuklar üzerine çözelti ihtiva eden protein yükü ve dengeleme tamponu ile 100 ml kolon yıkayın. dengeleme tamponu içinde, 300 mM NaCI, 600 ml lineer bir gradyan ile kolondan elüte.
      11. kolon saflaştırılması için düşük basınçlı kromatografi sistemini kullanarak. 1 ml / dk'lık bir pompa hızı kullanarak ve 10 ml fraksiyonları toplanır. Saf protein içeren fraksiyonlar toplanır.
        Not: elüsyon sırasında, proteinin varlığını doğrulamak için 280 nm'de optik yoğunluk (OD) izleyin. SDS-PAGE ile her fraksiyondan saflığını belirlemek ve tek saf fraksiyonlar toplanır.
    "Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Şekil 1
    Şekil 3: T4 lizozim mutant L99A / M102Q protein saflaştırma için Örnek sonuçlanır. A) Kromatogram) mS / cm (kırmızı çizgi 280 nm (mavi çizgi) ve iletkenlik de AU ölçülen UV absorbans gösteren. Fraksiyonlar 20-23 birleştirildi ve saflığı, SDS-PAGE ile tespit edilmiştir. B) 18.6 kDa'da fraksiyon 20-23 saflaştırılmış protein mevcudiyetini gösteren% 15 SDS-PAGE jeli. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    1. Protein kristalleştirme
      1. Bir diyaliz membran boru (12,000 14,000 MWCO) için saflaştırılmış protein çözüm aktarın. 100 mM sodyum fosfat, 550 mM NaCI,% 0.02 NaN3 (L L99A pH 6.5 ve pH 6.3 4.00 L ihtiva eden bir beher içine diyaliz tüpüne koyun99A / M102). 4 ° C'de bir gece boyunca 4 l'lik bir çözelti ilave edin.
      2. Diyalizlenmiş örnek, 2-merkaptoetanol (5 mM nihai konsantrasyon) ilave edilir ve ~ 40.0 mg / ml bir santrifüj konsantratör (10,000 MWCO) kullanılarak konsantre edilir. 280 nm'de emilimin ölçülmesiyle protein konsantrasyonunu belirleyin. kristalleştirme öncesinde iplik, varsa çökeltileri çıkartmak.
      3. Protein kristalleşme için buhar difüzyon asılı bırak yöntemini kullanın. Bir silikonlu cam kapak slayt rezervuar çözeltisi (2.0-2.2 M sodyum / potasyum fosfat, pH 6.7-7.1, 50 mM 2-merkaptoetanol, 50 mM 2-hidroksietil disülfid) 5.00 uL konsantre edilmiş protein çözeltisi 5.00 uL karıştırın.
      4. her bir içerikli rezervuar çözeltisi üzerine baş aşağı kapak slayt koyarak rezervuar çözeltisi 1.00 mL karşı kanşım damla dengelenmesi. sıkıca slayt her iyi mühür gres kullanın. 2.2.3 belirtilen çözelti ile 24 oyuklu plaka kullanılarak çeşitli koşulları ayarlayın.kristal büyümesi için 4 ° C'de plaka saklayın.
        NOT: Kristaller normalde kapak slayt dengelenmiş tamponda 1-2 hafta içinde büyür. Adım 2.2.3 rezervuar çözümü ile protein çözeltisi karıştırma sırasında acil yağış kristalleşme başarısızlığını gösterir.

    Şekil 4,
    Şekil 4: ligandlarla kompleks hale getirilmeden önce, T4 lizozim mutan L99A kristallerinin Örnek resmi. Kristaller ana çözeltiden olan (2.1 M sodyum / potasyum fosfat, pH 6.9, 50 mM 2-merkaptoetanol, 50 mM 2-hidroksietil disülfid). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    1. Kompleks preparasvonu
      1. bir döngü içine şeklinde bir kriyojenik boru kullanarak kristalleri seçin (Malzeme Listesi) ve0.6 ml mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirin. kuruluğu önlemek ve kristaller korumak için tüp için ana çözeltiye 50.0 uL ekleyin.
        NOT: Tek kristal seçimi mikroskop kullanılarak destekli olduğunu.
      2. Bir eldiven kutusu içine kristalleri içeren tüp aktarın. Tüpün ek kapağın iç azaborine ligandı (5) ve yerine 5.00 mcL alın. Kap ve buhar difüzyon ile dengeleme için 2-7 gün boyunca eldiven kutusu içinde bir buzdolabına (4 ° C) bir tüp saklayın.
        NOT: azaborine ligand (5) fiziksel özellikleri (sulu çözelti içinde yüksek volatilite ve çözünürlük) buharı difüzyon yöntemi ile önceden protein kristalleri ile komplekslenmeyi sağlar.
      3. önceden sıvı azot içinde flaş dondurma, N-Paratone bir damlacık içeren bir cam slayt, bir döngü halinde şekillendirilir bir kriyojenik boru kullanarak kristaller aktarın. kristal üzerinde dalan N-Paratone ve hızla flaş dondurma ile korunan kristal almaksıvı azot içeren bir Dewar içine döngü. kriyojenik tong kullanarak döngü kristal monte edin.
      4. sinkrotron radyasyon kullanılarak, tek bir kristal veri setleri toplayın. Yayınlanan yapılar 20, 24 kullanılarak moleküler değiştirme işlemini; elektron yoğunluğunun bir un-modellenmiştir blob protein bağlama site içindeki ligand varlığını doğrulamak.

    Şekil 5,
    Şekil 5: elektron yoğunluğu ile bağlayıcı cebinde T4 lizozim mutant L99A Atom modelleri. Bağlama sitedeki un-modellenmiştir elektron yoğunluğu blob ile A) L99A boşluğu. B) iki alternatif konformerlerine modellenmiş azaborine ligand 5 ile L99A boşluğu. cl LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya ick.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1,2-azaborines şematik bir sentez yolu Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu protokol, beş farklı boron, azot ihtiva eden moleküllerin sentezi için de geçerlidir. Şekil 2, arzu edilen ürün (3) oluşumunu izlemek için adım 1.3 boyunca ölçülen 11 B NMR spektrumları temsil eder. Protein saflaştırma düşük basınçlı kromatografi sistemini temsil eden bir kromatogramıdır Şekil 3'te gösterilmiştir kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Toplanan fraksiyonların saflığı, SDS-PAGE ile tespit edilmiştir. T4 lisozim mutant L99A kristalleri, Şekil 4'te gösterilmiştir. Şekil 5 un-modellenmiş elektron yoğunluğu ve bağlı ligand 5 ile arıtma sonra bağlayıcı kavite ile L99A bağlama cebindeki gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolün birinci bölümünde, daha önce bildirilen yöntemlere 12, 13 göre 1,2-azaborines değiştirilmiş bir sentezini tarif. Triallylborane 22 hazırlamak için allyltriphenyl kalay ya da potasyum allyltrifluoroborate kullanarak yolları için bir ikame olarak kullanılan N -allyl- N -TBS- B -alil klorid adüktü (1). Bu yöntem daha atom-ekonomik ve çevre dostu bir yaklaşım sağlar. N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) sentezi için, bir tek-kap, iki aşamalı bir sıra (oksidasyon takip metatez kapatma halkası) Önceki daha yüksek izole verimle sonuçlandı kullanılmıştır ara madde (2) (% 52 vs iki aşamada% 29) izolasyonuna içeren yöntemi. (Bununla birlikte, kimyasal katkı ürünü (1) saflığı bağlı olarak, kapalı halka ürünün izole edilmesinden önce, oksidasyon safhasıvakum altında damıtma yoluyla gerekli olabilir. Bu durumda, tolüen yerine çözücü olarak diklorometan, bu kullanılan Pd / C içinde toplam vücut ağırlığının azaltılmasında oksitleme aşaması esnasında uçucu maddelerin ayrılmasından önce damıtmaya.) 11 B NMR İzleme (Şekil 2) için de fayda süresini azaltır reaksiyon (15 mol% 'vs% 7 mol).

N -H- B-etil-1,2-azaborine (5) Sentezi Bir krom kompleksi kullanılması gereken daha önce bildirilen çok basamaklı dizisi 16 yerine etillityum kullanılarak 4 iki aşamada gerçekleştirildi. izolasyon ürünün uçuculuğu nedeniyle hassas sıcaklık kontrolü ve zayıflatılmış vakum manipülasyon gereklidir. Bu protokol sunulan teknikler diğer uçucu bileşiklerin saflaştırılması için uygulanabilir.

İkinci bölümde ise, biz protein saflaştırma ve kristal komplekslenmeyi gösterdiT4 lizozim mutantlar L99A ve L99A / M102Q evi. İstenen proteinin kimyasal hücre liziz verdi izolasyonu, ardından E.coli RR1 gerilme ve IPTG kullanılarak indüksiyon standart bir protein ekspresyonu,. Her adımın başarısını teyit ya da başarısız işlemi belirlemek amacıyla protein ekspresyonu ve hücre parçalama sonra SDS-PAGE çalıştırmak için tavsiye edilir. L99A T4 lizozim için, ifade edilen protein, bakteriyel hücreler lize edildi nedeniyle aktivitesine yüzer tabakanın ve pelletin hem de bulunabilir. Bu durumda, üstte kalan sıvı protein 20 mM sodyum fosfat tampon maddesine karşı diyaliz edilir ve kolon saflaştırılması için hücre lizizi lizat ile birlikte. İndüksiyon koşulları (37 ° C'de 2-3 saat, 21 saat, 25 ° C'de) daha yüksek bir sıcaklıkta ve daha kısa bir süre için ayarlanabilir. Hücre liziz işlemi, aynı zamanda, aşırı ısınmayı önlemek için bir buz banyosu ile sonikasyon kullanılarak gerçekleştirilebilir. 300 mM NaCl doğrusal gradyan ile karboksimetil iyon değiştirme sütunu, protein saflaştırma için kullanılmıştır. Sadece>% 95 saf (S dayalıDS-PAGE) ile protein fraksiyonları toplandı ve protein kristalleştirme kullanıldı.

Protein çözeltisinin konsantre önce diyaliz edilmiş proteine ​​2-merkaptoetanol (5 mM nihai konsantrasyon) (aşama 2.2.2) eklenmesi, özellikle yüksek de kolaylıkla çökmeye eğilimi L99A / M102Q proteini, spontan çökelmesini önlemek için gerekli olduğu konsantrasyonu. 5 protein kompleks bir hava-ortam, İhtiyaca göre, protein-ligand kompleksi bir eldiven kutusu içinde hazırlanmıştır. oyuk bearingT4 lizozim mutantları: Bu protokol hazırlanan materyaller biyolojik model sistem 1,2-azaborines arasında bağlanma çalışmaları kullanıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% Sigma Aldrich 34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free Sigma Aldrich 309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) Fisher D37-20
Toluene Fisher T290-4
Pentane, HPLC Fisher P399-4
Acetonitrile Fisher A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% Sigma Aldrich 208027 Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd Strem 46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane Sigma Aldrich 211249 Highly toxic/Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5% Sigma Aldrich 471283
Grubbs 1st generation catalyst  materia C823
Acetamide Sigma Aldrich A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane Sigma Aldrich 561452 Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O Sigma Aldrich 455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% Sigma Aldrich 277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) ATCC 31343
T4 lysozyme WT* (L99A) Addgene 18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) Addgene 18477
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Invitrogen AM9464
Sodium phosphate monobasic anhydrous Fisher BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher BP332
Sodium chloride Fisher S642212 
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BP118
Magnesium chloride Sigma Aldrich M4880 Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI Fisher PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media Fisher 45-002-931
Tris-base Fisher BP152-500 
Sodium azide TCI S0489 Highly toxic
2-Mercaptoethanol Fisher ICN806443 
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators Fisher 14-558-501
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
2-Hydroxyethyl disulfide Sigma Aldrich 380474
N-paratone  Hampton Research HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO  Fisher 08-667E
 CryoLoop Hampton Research cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong Thermo Fisher cryogenic tong
Coot Electron density images are generated from the software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

Tags

Biochemistry Sayı 121 azaborine Heterocycles sentezi protein kristalleştirme T4 lizozim buhar difüzyonu asılı damla protein-ligand kompleksi X-ışını kırınımı bağlanma etkileşimi
1,2-Azaborines Sentezi ve T4 Lizozim Mutants ile Bunların Protein Kompleksleri hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of… More

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants. J. Vis. Exp. (121), e55154, doi:10.3791/55154 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter