Introduction
Bor-nitrogenholdige heterocykliske (dvs. 1,2-azaborines) har for nylig trukket betydelig opmærksomhed som isostere af arener. Denne isosterism kan føre til spredning af eksisterende strukturelle motiver til at udvide den kemiske rum 2, 3, 4. Azaborines har potentiel anvendelighed til anvendelse inden for biomedicinsk forskning 5, 6, 7, 8, især på området medicinsk kemi, hvor kemikere foretage syntese af biblioteker af strukturelt og funktionelt relevante molekyler. Betydeligt, dog mens der er mange veludviklede synteseveje til rådighed arene-holdige molekyler, er blevet rapporteret kun et begrænset antal af fremgangsmåder til syntese af azaborines 9, 10, 11, 12, 13. Dette skyldes primært et begrænset antal muligheder for bor kilden og luft- og fugt følsomme karakter af molekylet i den tidlige fase af syntetisk sekvens.
I den første del af denne artikel vil vi beskrive en multi-gram skala syntese af N -TBS- B Cl-1,2-azaborine (3) ved hjælp af standard værelser med fri teknikker. Denne forbindelse tjener som en alsidig mellemprodukt, som kan funktionaliseres yderligere til strukturelt mere kompleks molekyler 14, 15. Ud fra 3 vil syntesen og oprensningen af N -H- B ethyl-1,2-azaborine (5) til anvendelse i Proteinbindingsforsøg blive beskrevet. På grund af volatiliteten af 5, dets effektive isolering kræver præcis styring af reaktion temperatur, tid, og distillation forhold.
I den anden del, protokoller for protein-ekspression og isolering af T4 lysozym mutanter (L99A og L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 vil blive præsenteret, efterfulgt af protein krystallisering og forberedelse af protein-ligand-krystal-komplekser. T4 lysozym mutanter L99A og L99A / M102Q blev valgt som biologiske modelsystemer til at undersøge hydrogenbindingen evne NH indeholder azaborine molekyler 17. Anvendelse af en standard molekylær biologi protokol proteinet udtrykkes i Escherichia coli RR1 stammen og induceret med isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Proteinoprensning udføres under anvendelse ionbyttersøjle kromatografi. Protein krystallisation udføres med stærkt koncentreret oprenset proteinopløsning (> 95% renhed ved gelelektroforese) under anvendelse af hængendedråbedampdiffusion metode. På grund af følsomheden af denne undersøgelsens ligander til ilt, er protein-ligand komplekser udarbejdet i henhold værelser med gratis betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle oxygen- og fugtfølsomme manipulationer blev udført under en inert atmosfære (N2) under anvendelse af enten standard luftfrie teknikker eller en handskeboks. THF (tetrahydrofuran), Et2O (diethylether), CH2C 2 (dichlormethan), toluen og pentan blev oprenset ved passage gennem en søjle af neutralt aluminiumoxid under argon. Acetonitril blev tørret over CaH2 (calciumhydrid) og destilleret under nitrogenatmosfære før anvendelse. Pd / C (palladium på carbon) blev opvarmet under højvakuum ved 100 ° C i 12 timer før anvendelse. Silicagel (230-400 mesh) blev tørret i 12 timer ved 180 ° C under højt vakuum. Flashkromatografi blev udført med denne kiselsyregel under en inert atmosfære. Alle andre kemikalier og opløsningsmidler blev købt og anvendt som modtaget.
BEMÆRK: Forsigtig, se venligst alle relevante sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Flere af de kemikalier, der anvendes ved syntesen etre akut toksisk og kræftfremkaldende.
1. Fremstilling af 1,2-Azaborines
BEMÆRK: Karakterisering data for alle forbindelser i denne undersøgelse er tidligere blevet rapporteret 12, 13, 16.
Figur 1: synteseskema af 1,2-azaborines. Detaljerede protokoller til syntese af hver forbindelse (1-5) er beskrevet i protokollen sektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Fremstilling af N -allyl- N -TBS- B allyl chlorid addukt (1)
- I et handskerum, udmåle 6,70 g (50,0 mmol) triallylborane 22 i en ovn-tørret 24/40 1 L rundbundet kolbe udstyret med en omrører og tilsæt 250 ml dichlormethan. Forsegl kolben med en gummimembran. Udenfor feltet opløsningen afkøles til -78 ° C under en nitrogenatmosfære på en vakuumgasolie manifold.
- Tilsæt 100 ml 1,00 M bortrichlorid-opløsning (100 mmol) i hexan til triallylborane opløsningen ved -78 ° C via kanyle overførsel. Lad reaktionsblandingen omrør ved denne temperatur i 4 timer.
BEMÆRK: Forsigtig, bortrichlorid er meget reaktive med vand. - I en separat 100 ml kolbe, udmåle 25,7 g N - (t-butyldimethylsilyl) - N -allylamine (150 mmol) og tilsæt 20,0 ml dichlormethan. Til 1 L reaktionskolbe tilsættes denne opløsning via kanyle overførsel opretholdelse af reaktionstemperaturen på -78 ° C.
- Tilføj 21,0 mL triethylamin (150 mmol) til reaktionsblandingen. Oprethold omrøring under en positiv nitrogenstrøm og lad det gradvist at opvarme til room natten over.
- Efter 18 timer omrøring fjerne ca. halvdelen af opløsningsmidlet gennem en vakuumgasolie manifold ved hjælp af høj vakuum (300-500 mTorr) med en flydende nitrogen-fælde.
- Tag reaktionskolben i et handskerum og filtrere det hvide salt dannet i reaktionsblandingen gennem en ovntørret medium-porøsitet fritte udstyret med en 24/40 vakuum adapter og en 24/40 500 ml rundbundet kolbe med en omrører bar. Brug dichlormethan til at overføre alle de resterende materialer.
- Fjern alle de resterende flygtige stoffer fra filtratet uden for boksen under anvendelse af en vakuum gas manifold med højvakuum.
- I en handskekasse, overføre den koncentrerede reaktionsblandingen i en ovntørret 14/20 100 ml rundbundet kolbe med en omrører til at forberede destillation. Cap kolben med en skillevæg.
- Under en strøm af nitrogen, hurtigt at åbne skillevæggen og der tilsættes 200 mg calciumhydrid som tørremiddel.
- Opsæt destillationsapparat ved at montere en ovn-tørret 14/20 destillationshoved fastgjort med et termometer, en side med en modtagende 14/20 50 ml luftfri opbevaring kolbe og den anden side med 100 ml kolbe indeholdende råprodukt. Udstyre destillationshoved med afkølet vand. (Brug fedt for alle leddene destillationsapparatet.)
BEMÆRK: Produktet begynder at destillere når dampen temperaturen når 60 ° C ved 300 mTorr. - Fortsætte indsamlingen produktet ved at hæve temperaturen af oliebadet indtil destillationshoved termometeret læser 75 ° C.
BEMÆRK: Produktet er en klar farveløs væske. - Stop destillation ved at fjerne varmekilden og køle apparatet til stuetemperatur før opbevaring. Efter afkøling repressurize apparatet med nitrogen og stramt lukke stopventilen på luft-fri lagerplads kolbe. Opbevar isolerede produkt i en handskekasse fryser.
BEMÆRK: Udbyttet kan variere fra 65% til 84%.
- Fremstilling af N B -Cl ringsluttes produkt (2)
- I en handskekasse, udmåle 56,0 g N -allyl- N -TBS- B allyl chlorid addukt (1) (217 mmol) i en ovntørret 24/40 1 L rundbundet kolbe med en omrører og tilsæt 500 ml toluen.
- Udmåle 1,79 g Grubbs 1 st generation katalysator (2,17 mmol).
- Tilsæt katalysatoren portionsvis til den omrørte opløsning af 1 ved stuetemperatur i en handskekasse. Rense boksen under tilsætningen for at fjerne ethylengas dannet fra reaktionen.
BEMÆRK: Reaktionen er typisk fuldstændig inden for 30 min af ophør af gasudvikling. Som en anden indikator for færdiggørelse vil reaktionen farve har fuldstændig ændret fra sin oprindelige violet til brun. På dette tidspunkt kan produktet isoleres ved anvendelse af vakuumdestillation; se reference 12 for yderligere oplysninger. I denne protokol, er en one-pot, totrinsprocedure til direkte syntese af 3 beskrevne. - Fremstilling af N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
- Til reaktionsopløsningen af ringen lukket produkt (2) i toluen tilsættes 14,0 g palladium på carbon (10 vægt% Pd, 13,2 mmol).
- Kolben fjernes fra kassen og passer det med en ovntørret 24/40 tilbagesvaler, der er blevet skyllet med nitrogen og udstyret med afkølet vand.
- Opvarm reaktionsblandingen ved anvendelse af et oliebad til en kraftig tilbagesvaling ved 135 ° C under omrøring.
- Efter opretholdelse ved tilbagesvaling i 16 timer, afkøl reaktionsblandingen ved kolben fjernes fra oliebadet. Efter afkøling til stuetemperatur, trække en 0,5 ml alikvot fra reaktionsblandingen ved anvendelse af en sprøjte udstyret med en ovntørret Luer lock nål. Overfør 0,5 ml alikvot til en skrue-top NMR-rør til analyse via 11 B NMR 12.
BEMÆRK: Den maksimale ønskede produkt vises ca. 35,5 ppm 12, mens udgangs-material peak vises ved ca. 42,9 ppm 12. Normalt på dette tidspunkt 11 B NMR angiver at reaktionen er ufuldstændig, med en mindre udgangsmateriale peak resterende. - Hvis reaktionen er ufuldstændig, reaktionskolben sætter en handskekasse og tilføje en ekstra 3,00 g palladium på carbon (10 vægt% Pd, 2,82 mmol).
- Resubject reaktionen til reflux betingelser som beskrevet i 1.3.2 og 1.3.3.
- Efter yderligere 24 timer ved tilbagesvaling, analysere en anden alikvot af reaktionen ved 11 B NMR. På dette tidspunkt bør reaktionen er fuldstændig.
- Overfør reaktionskolben til handskerummet og passere reaktionsblandingen gennem en engangs flashchromatografisøjle pakket med papirservietter. Filtratet opsamles ved vask med 50,0 ml toluen.
- Fjerne alle de flygtige stoffer fra filtratet uden for boksen på en vakuumgasolie manifold udstyret med højvakuum.
BEMÆRK: Fjernelse af de flygtige stoffer kan tage 40 min to 90 min afhængig af vakuumtrykket. Når vakuummåleren læser maksimalt tryk, betyder det, at fjernelse af opløsningsmiddel er fuldstændig. Mens fjerne opløsningsmiddel, skal du sørge for, at vandbadet under kolben forbliver ved stuetemperatur i varmeafledning. - I en handskekasse, overføre den koncentrerede reaktionsblandingen i en ovntørret 24/40 250 ml rundbundet kolbe med en omrører. Cap kolben med en skillevæg.
- Hurtigt fjerne skillevæggen og der tilsættes 200 mg calciumhydrid som tørremiddel.
- Nedsat destillationsapparat ved at montere en ovntørret 24/40 destillationshoved fastgjort med et termometer, en side med en modtagende 24/40 100 ml luftfri opbevaring kolbe og den anden side med 100 ml kolbe indeholdende råprodukt. Udstyre destillationshoved med afkølet vand. Brug fedt til alle leddene destillationsapparatet.
BEMÆRK: Produktet begynder at destillere når dampen temperaturen når 65 til 70 ° C ved 1000 mTorr med en oliebadtemperatur mellem 90-100 ° C. Produktet er en klar farveløs væske. - Stop destillation ved at fjerne varmekilden og køle apparatet til stuetemperatur før opbevaring. Efter afkøling repressurize apparatet med nitrogen og stramt lukke stopventilen på luft-fri lagerplads kolbe. Opbevar isolerede produkt i en handskekasse fryser ved -30 ° C.
BEMÆRK: Udbyttet for one-pot, to-trins procedure er 52%.
Figur 2: 11 B-NMR-spektre for overvågning dannelse af N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). A) N -Allyl- N -TBS-B-allylchlorid addukt (1), udgangsmateriale for ring lukning metatese. B) Oxidation efter 16 timer. (Uomsat N -TBS- B -Cl ring-lukket produkt (2) og isomeriseret B vinyl ring-lukket produkt (2 ') sammen med N-TBS-B-CI-1,2-azaborine (3) er vist.) C) Oxidation efter yderligere 24 timer. D) isolerede produkt (3) efter oprensning ved vakuumdestillation. Klik her for at se en større version af dette tal.- Fremstilling af N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
- I et handskerum, udmåle 4,00 g N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) i en ovntørret 100 ml rundbundet kolbe med en omrører og tilsættes 35 ml acetonitril. Afmål 1,14 g acetamid (19,3 mmol) og overførsel til reaktionskolben. Forsegl kolben med en gummimembran.
- reaktionskolben Fjern fra kassen og passer med en oVen-tørret 24/40 tilbagesvaler, der er blevet skyllet med nitrogen og udstyret med afkølet vand.
- Opvarm reaktionsblandingen til tilbagesvaling ved 85 ° C i et oliebad under omrøring.
- Efter 3 timer ved tilbagesvaling, afkøles reaktionen ved kolben fjernes fra oliebadet. Efter afkøling til stuetemperatur fjernes opløsningsmidlet på en vakuumgasolie manifold udstyret med højvakuum.
- Efter fjernelse af de flygtige stoffer under vakuum, genopløses reaktionsblandingen resten i 15,0 ml THF. Til denne opløsning tilsættes 3,21 ml n-butanol (35,1 mmol).
- Omrør reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 1 time.
- Fjern opløsningsmidlet på en vakuumgasolie manifold udstyret med højvakuum til opnåelse af det rå produkt.
- I en handskekasse, isolere produkt via silicagelsøjlekromatografi under anvendelse af en blanding af pentan og diethylether (5: 1) som eluent. Fjern flygtige stoffer fra de produktholdige fraktioner ved anvendelse af en vakuum gas manifold udstyret med højvakuum til opnåelse af rent produkt somet hvidt fast stof.
BEMÆRK: Udbyttet kan variere fra 82% til 87%.
- Fremstilling af N -H- B ethyl-1,2-azaborine (5)
- I en handskekasse, udmåle 1,00 g N- H -B- OBu-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) i en ovntørret 100 ml rundbundet kolbe med en omrører og tilsættes 25 ml Et2O O. Seal kolben med en gummimembran og sted, under N2 på en vakuum gas manifold.
- I en separat ovntørret 100 ml rundbundet kolbe, der tilsættes 26,5 ml ethyllithium opløsning (0,5 M i benzen / cyclohexan, 13,2 mmol) under nitrogenatmosfære. Fjern blandingen af opløsningsmidlet (benzen / cyclohexan) fra ethyllithium reagens for at undgå problemer med isolering af den ønskede azaborine produkt. Genopløs den faste ethyllithium i 13,0 ml Et2O
BEMÆRK: Advarsel: organolithiumreagenser er pyrofore (antændelige ved kontakt med luft eller vand). Det ønskede produkt (5 - Afkøl reaktionsblandingen kolbe indeholdende 4 til -30 ° C med et kølebad.
- Tilsæt ethyllithium opløsning til reaktionskolben via kanyle overførsel ved -30 ° C. Hold omrøring ved denne temperatur i 1 time og lad den langsomt at opvarme til stuetemperatur.
- Overvåg reaktion ved 11 B NMR. (Den ønskede mellemliggende top vises ca. 39,8 ppm.)
- Efter reaktionsfærdiggørelse afkøl reaktionsblandingen til -30 ° C og tilsæt 6,62 mL HCI-opløsning (2,0 M i Et2O, 13,2 mmol). Reaktionsblandingen omrøres i 1 time, samtidig med at den til langsomt at opvarme til stuetemperatur.
- Fjern opløsningsmidlet på en vakuumgasolie manifold udstyret med lavt vakuum (20-25 Torr) til opnåelse af det rå produkt blandingen.
- I en handskekasse,isolere produktet via silicagelsøjlekromatografi ved anvendelse af 2-methylbutan som eluent. Fjern den flygtige på en vakuumgasolie manifold udstyret med en svækket vakuum for at opnå det rene produkt som en farveløs væske.
BEMÆRK: Udbyttet er 56%.
2. proteinpræparat og Krystallisation af T4 lysozym Mutanter
- Proteinekspression og oprensning
- Grow E. coli RR1 celler transformeret med de subklonede plasmider (L99A eller L99A / M102Q) 17, 20 i 200 ml LB (lysogeni bouillon) medium suppleret med 40,0 mg ampicillin ved 37 ° C i 12 timer.
BEMÆRK: Sammensætningen af LB-medium er 12 g trypton, 5 g gærekstrakt, 10 g natriumchlorid og 1 g glucose pr 1 LH 2 O. - Pode 4.00 L LB-medium (suppleret med 800 mg ampicillin) med 160 ml af natten over kultur og inkuberes ved 37 ° C ved 240 rpm med en filtered lufttilførsel.
- Når den optiske densitet når 0,7 ved 600 nm, køle bakteriekulturen til stuetemperatur ved at fjerne det fra inkubatoren.
- Afmål 695 mg isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) (slutkoncentration på 0,7 mM) i en konisk centrifugerør og tilsættes 4 ml LB-medier for at opløse.
- Tilsæt IPTG-opløsning til kulturen for at inducere proteinekspression. Inkuber kulturerne ved 110 rpm i 21 timer ved 25 ° C.
- Centrifugeres kulturen ved 4.412 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten kasseres og pellet resuspenderes i 300 ml 0,1 M natriumphosphat (pH 6,6), 0,2 M NaCl, og der tilsættes 30,0 ml 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (pH 8,0). Suspensionen omrøres i 17 timer ved 4 ° C.
- Tilføj 30,0 ml 1,0 M MgCl2 og 0,500 ml deoxyribonuclease I (DNase I) til suspensionen, og der omrøres ved stuetemperatur i 8 timer.
- Centrifugeres den lyserede cellesuspension ved 30.913 xg i 30 minutter ved 4 76; C. Opsaml supernatanten indeholdende udtrykte protein og kassér pelleten.
- Dialysere lysatet mod 20 mM natriumphosphat (pH 6,5 for L99A og pH 6,3 for L99A / M102Q) ved 4 ° C natten over.
- Vask og tempereres 20,0 ml carboxymethyl ionbyttende perler med ækvilibreringsbuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7,3)) i en kolonne. Indlæse opløsningen indeholdende proteinet på perlerne og vask af søjlen med 100 ml af ækvilibreringspufferen. Søjlen elueres med en 600 ml lineær gradient af 300 mM NaCl i ækvilibreringspufferen.
- Brug et lavtryks kromatografi system til kolonnen oprensning. Brug en pumpe hastighed på 1 ml / min og indsamle fraktioner på 10 ml. Opsaml fraktionerne indeholdende rent protein.
BEMÆRK: Under eluering, overvåge den optiske densitet (OD) ved 280 nm for at verificere tilstedeværelsen af proteinet. Bestemme renheden af hver fraktion ved SDS-PAGE og indsamler kun de reneste fraktioner.
- Grow E. coli RR1 celler transformeret med de subklonede plasmider (L99A eller L99A / M102Q) 17, 20 i 200 ml LB (lysogeni bouillon) medium suppleret med 40,0 mg ampicillin ved 37 ° C i 12 timer.
Figur 3: Repræsentative resultater for proteinoprensning T4 lysozym mutant L99A / M102Q. A) Kromatogram viser den målte UV-absorbans i AU ved 280 nm (blå linje) og ledningsevne i mS / cm (rød linje). Fraktioner 20-23 blev kombineret, og renhed blev bestemt ved SDS-PAGE. B) 15% SDS-PAGE gel, der viser tilstedeværelsen af oprenset protein af fraktioner 20-23 på 18,6 kDa. Klik her for at se en større version af dette tal.- Protein krystallisering
- Overfør det oprensede protein opløsningen til en dialysemembran rør (12.000 til 14.000 MWCO). Placer dialyse slangen i et bægerglas indeholdende 4,00 L 100 mM natriumphosphat, 550 mM NaCl, 0,02% NaN3 (pH 6,5 for L99A og pH 6,3 for L99A / M102). Omrør 4 l opløsning natten over ved 4 ° C.
- Tilsæt 2-mercaptoethanol (slutkoncentration på 5 mM) til den dialyserede prøve og koncentreres til ~ 40,0 mg / ml under anvendelse af en centrifugal-koncentrator (10.000 MWCO). Bestem proteinkoncentration ved at måle absorption ved 280 nm. Fjerne eventuelt bundfald ved spinding før krystallisation.
- Brug damp-diffusion hængende-dråbe metoden for protein krystallisation. Bland 5,00 pi af den koncentrerede proteinopløsning med 5,00 pi af reservoiret opløsning (2,0-2,2 M natrium / kalium-phosphat, pH 6,7-7,1, 50 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM 2-hydroxyethyldisulfid) på en siliconiseret glas dækglas.
- Ækvilibrere blandingen drop mod 1,00 ml af reservoiret opløsning ved at placere dækglas på hovedet oven på hver brønd indeholdende reservoir opløsning. Brug fedt stramt forsegle hver brønd med dias. Opsæt forskellige betingelser ved hjælp af en 24-brønds plade med reservoir løsning nævnt i 2.2.3.Opbevar pladen ved 4 ° C i krystalvækst.
BEMÆRK: Krystaller normalt vokse inden for 1-2 uger i ækvilibrerede buffer på forsiden dias. Umiddelbar udfældning under blanding proteinopløsning med reservoiret opløsning i trin 2.2.3 indikerer svigt af krystallisation.
Figur 4: repræsentativt billede af krystaller af T4 lysozym mutant L99A før kompleksdannelse med ligander. Krystaller er i moderluden (2,1 M natrium / kalium-phosphat, pH 6,9, 50 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM 2-hydroxyethyldisulfid). Klik her for at se en større version af dette tal.- Kompleks forberedelse
- Pick krystallerne under anvendelse af en kryogen slange formet til en løkke (se Materialer List) ogplacere dem i en 0,6 ml mikrocentrifugerør. Tilføj 50,0 pi af moderluden til røret for at undgå tørhed og bevare krystallerne.
BEMÆRK: Single crystal udvælgelse hjælpes af anvendelse af et mikroskop. - Overfør rør indeholdende krystaller i et handskerum. Tag 5.00 pi af azaborine ligand (5) og sted inde i snap-cap af røret. Cap og gemme røret i køleskab (4 ° C) inde i handskerummet til 2-7 dage for ligevægt ved dampdiffusion.
BEMÆRK: De fysiske egenskaber (høj volatilitet og opløselighed i vandig opløsning) af azaborine ligand (5) gør det muligt for kompleksdannelse med den i forvejen dannede proteinkrystaller via damp diffusion metode. - Overfør krystallerne under anvendelse af en kryogen slange formet til en sløjfe til et objektglas indeholdende en dråbe af N-Paratone før flash-frysning i flydende nitrogen. Vælg den krystal beskyttet med N-Paratone og hurtigt flash-freeze ved at kaste krystal påløkke i en Dewar indeholder flydende nitrogen. Monter krystal på fastlåsning med en kryogen tang.
- Indsamle datasæt fra en enkelt krystal ved hjælp synkrotronstråling. Udføre molekyludbytning under anvendelse af publicerede strukturer 20, 24; verificere eksistensen af ligand inde proteinbindingsstedet af en un-modelleret klat elektrondensitet.
- Pick krystallerne under anvendelse af en kryogen slange formet til en løkke (se Materialer List) ogplacere dem i en 0,6 ml mikrocentrifugerør. Tilføj 50,0 pi af moderluden til røret for at undgå tørhed og bevare krystallerne.
Figur 5: Atomic modeller T4 lysozym mutant L99A bindende lomme med elektrondensitet. A) L99A hulrum med en un-modelleret elektrondensitet klat i bindingsstedet. B) L99A hulrum med den modellerede azaborine ligand 5 i to alternative konformerer. venligst click her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skematiske syntesevej til 1,2-azaborines er vist i figur 1. Denne protokol gælder for syntesen af fem forskellige bor-nitrogenholdige molekyler. Figur 2 repræsenterer 11 B NMR-spektre målt i løbet af trin 1.3 at overvåge dannelsen af det ønskede produkt (3). Proteinoprensning blev udført ved anvendelse lavtryks kromatografi-system og en repræsentant kromatogram er vist i figur 3. Renheden af de indsamlede fraktioner blev bestemt ved SDS-PAGE. Krystaller af T4 lysozym mutant L99A er afbildet i figur 4. Figur 5 viser L99A bindende lomme med un-modelleret elektrontæthed, og bindingen hulrum efter raffinement med liganden 5 bundet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den første del af denne protokol, beskrev vi en modificeret syntese af 1,2-azaborines baseret på tidligere rapporterede metoder 12, 13. Triallylborane 22 blev brugt som en erstatning for de ruter, der bruger allyltriphenyl tin eller kalium allyltrifluoroborate at forberede N -allyl- N -TBS- B allyl chlorid addukt (1). Denne fremgangsmåde giver mulighed for en mere atom-økonomisk og miljøvenlig fremgangsmåde. Til syntesen af N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3), blev en one-pot, to-trins sekvens (ring lukning metatese efterfulgt af oxidation) anvendes, hvilket resulterede i højere isoleret udbytte end den tidligere fremgangsmåde, der involverer isolering af mellemproduktet (2) (52% vs. 29% over to trin). (Men afhængigt af renheden af adduktet (1), isolering af ringsluttes produkt før oxidationstrinkan være nødvendigt under anvendelse af vakuumdestillation. I dette tilfælde anvendelse af dichlormethan som opløsningsmiddel i stedet for toluen reducerer tid til fjernelse af flygtige materialer inden destillation.) Overvågning 11 B NMR (figur 2) under oxidationstrinnet også godt i reduktion i de totale mængder af Pd / C anvendes i denne reaktion (7 mol% vs 15 mol-%).
Syntese af N -H- B ethyl-1,2-azaborine (5) er udført i to trin ud fra 4 under anvendelse ethyllithium i stedet for den tidligere rapporterede flertrins sekvens 16, som krævede anvendelsen af en chrom-kompleks. Isolationen krævede præcis temperaturstyring og svækket-vakuum manipulation på grund af volatiliteten af produktet. Teknikkerne der præsenteres i denne protokol kan også anvendes til oprensning af andre flygtige forbindelser.
I den anden del, demonstrerede vi proteinoprensning og krystal kompleksdannelseaf T4 lysozym mutanter L99A og L99A / M102Q. En standard protein ekspression i E. coli RR1 stamme og induktion under anvendelse IPTG, efterfulgt af kemisk cellelysis gav isolering af det ønskede protein. Det tilrådes at køre SDS-PAGE efter proteinekspression og cellelysis at bekræfte succes hvert trin eller identificere den mislykkedes proces. På L99A T4 lysozym, kan det udtrykte protein kan findes i både supernatanten og pelleten grundet dens aktivitet at lysere bakterieceller. I dette tilfælde kan protein i supernatanten dialyseres mod 20 mM natriumphosphatpuffer og kombineret med lysatet fra cellelysis for søjleoprensning. Induktionsbetingelser kan justeres til højere temperatur og kortere tid (fra 21 timer ved 25 ° C til 2-3 timer ved 37 ° C). Cellelysis kan også udføres ved anvendelse sonikering med et isbad for at undgå overophedning. Carboxymethyl ionbytningssøjle med en 300 mM NaCl lineær gradient blev anvendt til proteinoprensning. Kun> 95% rent (baseret på SDS-PAGE) proteinfraktioner blev opsamlet og anvendt i protein krystallisation.
Forud for at koncentrere proteinopløsningen, tilsætning af 2-mercaptoethanol (slutkoncentration på 5 mM) (trin 2.2.2) til den dialyserede protein var nødvendig for at forhindre dens spontane nedbør, især for L99A / M102Q protein, som har tendens til at udfælde let ved høj koncentration. Som protein kompleksdannelse med 5 krævede en luft-atmosfære, blev proteinet-ligandkompleks fremstillet i en handskekasse. Materialerne fremstillet på denne protokol blev brugt i bindende studier af 1,2-azaborines i et biologisk model-system: hulrum-bearingT4 lysozym mutanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free | Sigma Aldrich | 309966 | |
| Methylene chloride (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) | Fisher | D37-20 | |
| Toluene | Fisher | T290-4 | |
| Pentane, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
| Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophoric |
| Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M Boron trichloride solution in hexane | Sigma Aldrich | 211249 | Highly toxic/Pyrophoric |
| Triethylamine, ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st generation catalyst | materia | C823 | |
| Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane | Sigma Aldrich | 561452 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| HCl solution, 2.0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher | BP329 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher | BP332 | |
| Sodium chloride | Fisher | S642212 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher | BP118 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosive |
| Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Sodium azide | TCI | S0489 | Highly toxic |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators | Fisher | 14-558-501 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hydroxyethyl disulfide | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | cryogenic tubing shaped into a loop | |
| CryoTong | Thermo Fisher | cryogenic tong | |
| Coot | Electron density images are generated from the software |
References
- Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
- Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
- Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
- Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
- Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
- Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
- Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
- Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
- White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
- Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
- Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
- Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
- Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
- Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
- Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
- Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
- Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
- Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
- Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
- Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
- Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).
