Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Synthese van 1,2-Azaborines en de voorbereiding van hun eiwitcomplexen met T4 lysozym Mutanten

Published: March 25, 2017 doi: 10.3791/55154

Introduction

Boron stikstof bevattende heterocyclische verbindingen (dat wil zeggen 1,2-azaborines) hebben onlangs getrokken veel aandacht als isosteren van Arenes. Dit isosterism kan leiden tot diversificatie van bestaande structurele motieven op de chemische ruimte 2, 3, 4 uit te breiden. Azaborines hebben potentiële bruikbaarheid voor toepassing in biomedisch onderzoek 5, 6, 7, 8, vooral op het gebied van medicinale chemie waarin chemici uitvoeren synthese van bibliotheken van structureel en functioneel relevante moleculen. Belangrijk is echter, terwijl er talrijke goed ontwikkelde synthetische routes naar beschikbare areen bevattende moleculen, slechts een beperkt aantal werkwijzen voor de synthese van azaborines gerapporteerd 9, 10, 11, 12, 13. Dit is voornamelijk te wijten aan een beperkt aantal mogelijkheden voor de boor bron en de lucht- en vocht- gevoelige aard van het molecuul in het vroege stadium van synthetische sequentie.

In het eerste deel van dit artikel zullen we een multi-gram schaal synthese van N -TBS- B-Cl-1,2-azaborine (3) met behulp van standaard lucht-vrije technieken te beschrijven. Deze verbinding dient als een veelzijdig tussenproduct dat verder kan worden gefunctionaliseerd om structureel complexe moleculen 14, 15. Vanaf 3, de synthese en zuivering van N -H- B-ethyl-1,2-azaborine (5) voor gebruik in eiwitbindingsonderzoeken worden beschreven. Vanwege de volatiliteit van 5, zijn efficiënte isolatie vereist een nauwkeurige controle van de reactie temperatuur, tijd, en distgevolgtrekking omstandigheden.

In het tweede deel, protocollen voor eiwitexpressie en isolatie van T4 lysozym mutanten (L99A L99A en / M102Q) 17, 18, 19, 20 worden gepresenteerd, gevolgd door kristallisatie eiwit en bereiding van eiwit-ligand complexen kristal. T4 lysozym mutanten L99A en L99A / M102Q werden gekozen als biologische modelsystemen voor de waterstofbruggen vermogen van NH bevatten azaborine moleculen 17 te onderzoeken. Met behulp van een standaard moleculair biologische protocol wordt het eiwit tot expressie gebracht in Escherichia coli RR1 stam en geïnduceerd met isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Eiwitzuivering wordt uitgevoerd met kolomchromatografie ionenuitwisseling. Eiwit kristallisatie wordt uitgevoerd met sterk geconcentreerde gezuiverde eiwitoplossing (> 95% zuiverheid volgens gelelektroforese) met de hangendedruppel dampdiffusie methode. Vanwege de gevoeligheid van liganden van deze studie zuurstof, zijn de proteïne-ligand complexen bereid onder lucht-vrije omstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: Alle zuurstof en vocht-gevoelige manipulaties werden uitgevoerd onder een inerte atmosfeer (N2) met behulp van standaard lucht-free technieken of een handschoenenkastje uitgevoerd. THF (tetrahydrofuran), Et2O (diethylether), CH 2Cl 2 (dichloormethaan), tolueen en pentaan werden gezuiverd door het door een neutrale aluminiumoxide kolom onder argon. Acetonitril werd gedroogd over CaH2 (calciumhydride) en gedestilleerd onder stikstof atmosfeer vóór gebruik. Pd / C (palladium op koolstof) werd onder hoog vacuüm bij 100 ° C gedurende 12 h voorafgaand aan gebruik verwarmd. Silicagel (230-400 mesh) werd gedurende 12 uur bij 180 ° C onder hoog vacuüm. Flitschromatografie werd uitgevoerd met dit silicagel onder een inerte atmosfeer. Alle andere chemicaliën en oplosmiddelen werden gekocht en gebruikt zoals ontvangen.

LET OP: Let op, raadpleeg dan eerst alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor gebruik. Verscheidene van de chemicaliën die worden gebruikt bij de synthese eenre acuut giftig en kankerverwekkend.

1. Bereiding van 1,2-Azaborines

OPMERKING: Karakterisering gegevens van alle verbindingen in deze studie zijn eerder gerapporteerd 12, 13, 16.

Figuur 1
Figuur 1: synthetische schema van 1,2-azaborines. Gedetailleerde protocollen voor de synthese van elke verbinding (1-5) worden beschreven onder protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Bereiding van N -allyl- N -TBS- B allyl chloride adduct (1)
    1. In een handschoenenkastje, het afmeten van 6,70 g (50,0 mmol) triallylborane 22 in een oven gedroogde 24/40 1 L rondbodemkolf uitgerust met een roerstaaf en voeg 250 ml dichloormethaan. Sluit de kolf met een rubber septum. Buiten de box Koel de oplossing tot -78 ° C onder een stikstofatmosfeer op een vacuüm spruitstuk gas.
    2. Voeg 100 ml 1,00 M boortrichloride-oplossing (100 mmol) in hexaan om de triallylborane oplossing bij -78 ° C via een canule overdracht. Laat het reactiemengsel roer bij deze temperatuur gedurende 4 uur.
      LET OP: Let op, boortrichloride is zeer reactief met water.
    3. In een afzonderlijke 100 ml kolf, afmeten van 25,7 g N - (t-butyldimethylsilyl) - N -allylamine (150 mmol) en voeg 20,0 ml dichloormethaan. De 1 L reactiekolf, voeg deze oplossing via een cannule overdracht handhaven van de reactietemperatuur op -78 ° C.
    4. Voeg 21,0 ml triethylamine (150 mmol) aan het reactiemengsel. Handhaaf roeren onder een positieve stikstofstroom en laat het geleidelijk opwarmen tot roOM de temperatuur 's nachts.
    5. Na 18 uur roeren verwijdert ongeveer de helft van het oplosmiddel door vacuum gasverdeler behulp hoog vacuüm (300-500 mTorr) met een vloeibaar stikstof val.
    6. Neem de reactiekolf werd in een handschoenenkast en filtreer het witte zout gevormd in het reactiemengsel door een oven gedroogde middellange poreus frit met een 24/40 vacuümadapter en een 24/40 500 ml rondbodemkolf met een roer bar. Gebruik dichloormethaan om alle resterende materiaal overdraagt.
    7. Verwijder alle overblijvende vluchtige stoffen uit het filtraat buiten de box met een stofzuiger gasverdeler met hoogvacuüm.
    8. In een handschoenkast Breng het geconcentreerde reactiemengsel in een oven gedroogde 14/20 100 ml rondbodemkolf met een roerstaaf te bereiden voor distillatie. Cap de kolf met een septum.
    9. Onder een stroom stikstof snel het septum te openen en voeg 200 mg calciumhydride als droogmiddel.
    10. Opgericht destillatieapparaat door het aanbrengen van een oven-gedroogde 14/20 destillatiekop gevoegd met een thermometer, een zijde met een ontvangend 14/20 50 ml luchtvrije opslag kolf en de andere kant met de 100 ml kolf bevattende ruwe product. Voorzie de destillatie kop met gekoeld water. (Gebruik vet voor alle gewrichten van het destillatieapparaat.)
      Opmerking Het product begint te destilleren als de damptemperatuur 60 ° C bij 300 mTorr bereikt.
    11. Verder het verzamelen van het product door de temperatuur van het oliebad totdat de destillatiekop thermometer 75 ° C.
      NB: Het product is een heldere, kleurloze vloeistof.
    12. Distillatie te stoppen door het verwijderen van de warmtebron en laat de inrichting tot kamertemperatuur vóór bewaring. Na afkoeling, repressurize het apparaat met stikstof en strak sluit de stekker ventiel van de lucht-gratis opslagruimte kolf. Bewaar het geïsoleerde product in een handschoenenkastje vriezer.
      OPMERKING: De opbrengst kan variëren van 65% tot 84%.
  2. Bereiding van N- B -Cl-ringgesloten product (2)
    1. In een handschoenenkastje, het afmeten van 56,0 g N -allyl- N -TBS- B allyl chloride adduct (1) (217 mmol) in een oven gedroogd 24/40 1 L rondbodemkolf met een roerstaaf en voeg 500 mL tolueen.
    2. Meet 1,79 g Grubbs 1 e generatie katalysator (2,17 mmol).
    3. Voeg de katalysator portiegewijs aan de geroerde oplossing van 1 bij kamertemperatuur in een handschoenkast. Spoel de doos tijdens de toevoeging op ethyleengas gevormd uit de reactie te verwijderen.
      LET OP: De reactie is meestal voltooid binnen 30 min van de stopzetting van de gasontwikkeling. Als een andere indicator van voltooiing zal het reactiemengsel volledig zijn kleur veranderd van zijn oorspronkelijke paars naar bruin. Op dit punt, kan het product worden geïsoleerd met behulp van vacuümdistillatie; zie referentie 12 voor meer informatie. In dit protocol wordt een één-pot, tweestapsprocedure voor de directe synthese van 3 beschreven.
    4. Bereiding van N -TBS- B-Cl-1,2-azaborine (3)
      1. Aan de reactieoplossing van het ringgesloten product (2) in tolueen, voeg 14,0 g palladium op kool (10 gew% Pd, 13,2 mmol).
      2. Verwijder de kolf uit de doos en past met een oven gedroogde 24/40 reflux condensor werd gespoeld met stikstof en uitgerust met gekoeld water.
      3. Verwarm het reactiemengsel onder toepassing van een oliebad op een krachtige reflux bij 135 ° C onder roeren.
      4. Na handhaven onder terugvloeikoeling 16 uur, koel de reactie door verwijdering van de kolf uit het oliebad. Na afkoelen tot kamertemperatuur, trekken een 0,5 ml aliquot van het reactiemengsel met een injectiespuit met een oven gedroogde Luer lock naald. Breng de 0,5 mL van een schroef-top NMR-buis te analyseren via 11 B NMR 12.
        NB: Het gewenste product piek verschijnt ca. 35,5 ppm 12, terwijl het uitgangsmateriaal material piek verschijnt aan ca. 42,9 ppm 12. Meestal op dit moment 11 B NMR geeft de reactie incompleet is en een geringe piek uitgangsmateriaal overgebleven.
      5. Wanneer de reactie volledig is, brengt de reactiekolf in een handschoenenkast en voeg nog eens 3,00 g palladium op kool (10 gew% Pd, 2,82 mmol).
      6. Resubject de reactie omstandigheden reflux zoals beschreven in 1.3.2 en 1.3.3.
      7. Na nog 24 uur bij reflux, analyseert een monster van het reactiemengsel van 11 B NMR. Op dit punt moet de reactie compleet.
      8. Breng de reactie kolf met het handschoenenkastje en laat de reactiemengsel door een wegwerp flash chromatografie kolom gepakt met papieren doekjes. Verzamel het filtraat door wassen met 50,0 ml tolueen.
      9. Verwijder al de vluchtige stoffen uit het filtraat buiten de doos op een vacuüm gas manifold uitgerust met een hoog vacuüm.
        LET OP: Het verwijderen van de vluchtige stoffen kan nemen 40 min to 90 min afhankelijk van de vacuümdruk. Wanneer de vacuümmeter leest maximumdruk, betekent dit dat de verwijdering van het oplosmiddel voltooid. Tijdens het verwijderen van oplosmiddel, zorg ervoor dat het waterbad onder de kolf blijft bij kamertemperatuur voor warmteafvoer.
      10. In een handschoenkast Breng het geconcentreerde reactiemengsel in een oven gedroogde 24/40 250 ml rondbodemkolf met een roerstaaf. Cap de kolf met een septum.
      11. Snel te verwijderen van het septum en voeg 200 mg calcium hydride als droogmiddel.
      12. Opgericht destillatie afsluit door passen een oven gedroogde 24/40 destillatiekop gevoegd met een thermometer, een zijde met een ontvangend 24/40 100 ml luchtvrije opslag kolf en de andere kant met de 100 ml kolf bevattende ruwe product. Voorzie de destillatie kop met gekoeld water. Gebruik vet voor alle gewrichten van de destillatie-inrichting.
        Opmerking Het product begint te destilleren wanneer de temperatuur damp bereikt 65-70 ° C bij 1000 mTorr met een oliebadtemperatuur tussen 90-100 ° C. Het product is een heldere, kleurloze vloeistof.
      13. Distillatie te stoppen door het verwijderen van de warmtebron en laat de inrichting tot kamertemperatuur vóór bewaring. Na afkoeling, repressurize het apparaat met stikstof en strak sluit de stekker ventiel van de lucht-gratis opslagruimte kolf. Bewaar het geïsoleerde product in een handschoenenkastje vriezer bij -30 ° C.
        OPMERKING: De opbrengst van de een-pot, tweestapsprocedure is 52%.

    Figuur 2
    Figuur 2: 11 B NMR spectra voor bewaking vorming van N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). A) N N -Allyl- -TBS-B-allylchloride adduct (1), uitgangsmateriaal voor ringsluitingsmetathese. B) Oxidatie na 16 uur. (Niet-gereageerd N -TBS- B-Cl-ring gesloten product (2) geïsomeriseerd en B vinyl ringgesloten product (2 ') tezamen met N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine (3) getoond.) C) Oxidatie Na nog 24 uur. D) geïsoleerde product (3) na zuivering door vacuümdestillatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    1. Bereiding van N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
      1. In een handschoenenkastje, het afmeten van 4,00 g N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) in een oven gedroogde 100 ml rondbodemkolf met een roerstaaf en voeg 35 ml acetonitril. Meet 1,14 g aceetamide (19,3 mmol) en over te dragen aan de reactiekolf. Sluit de kolf met een rubber septum.
      2. Verwijder de reactiekolf uit de doos en rusten met een oven gedroogd 24/40 reflux condensor werd gespoeld met stikstof en uitgerust met gekoeld water.
      3. Verwarm het reactiemengsel tot reflux bij 85 ° C in een oliebad onder roeren.
      4. Na 3 uur onder terugvloeikoeling, koel de reactie door verwijdering van de kolf uit het oliebad. Na afkoelen tot kamertemperatuur, het oplosmiddel verwijdert op een vacuüm gasverdeler met hoogvacuüm.
      5. Na verwijdering van de vluchtige stoffen onder vacuüm, los het residu reactie in 15,0 ml THF. Aan deze oplossing werd 3,21 ml toevoegen van n-butanol (35,1 mmol).
      6. Roer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
      7. Verwijder het oplosmiddel op een vacuüm gasverdeler met hoog vacuüm om het ruwe product te verkrijgen.
      8. In een handschoenkast, isoleer het product via silicagel kolomchromatografie met een mengsel van pentaan en diethylether (5: 1) als elutiemiddel. Verwijderen van vluchtige stoffen uit de product bevattende fracties onder toepassing van een vacuüm gasverdeler met hoog vacuüm om het zuivere product te verkrijgen alseen witte vaste stof.
        OPMERKING: De opbrengst kan variëren van 82% tot 87%.
    2. Bereiding van N -H- B ethyl-1,2-azaborine (5)
      1. In een handschoenkast, afmeten van 1,00 g N- H -B- OBu-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) in een oven gedroogde 100 ml rondbodemkolf met een roerstaaf en voeg 25 ml Et 2 O. Seal de kolf met een rubber septum en plaats onder N2 op een vacuüm gas spruitstuk.
      2. In een aparte oven gedroogde 100 ml rondbodemkolf, voeg 26,5 ml ethyllithium oplossing (0,5 M in benzeen / cyclohexaan, 13,2 mmol) onder stikstofatmosfeer. Verwijder het mengsel van het oplosmiddel (benzeen / cyclohexaan) vanaf het ethyllithium reagens problemen met het isoleren van het gewenste product azaborine voorkomen. Los het vaste ethyllithium in 13,0 ml Et 2 O.
        LET OP: Let op: organolithiumchemie zijn pyrofoor (ontvlambaar bij contact met lucht of water). Het gewenste product (5
      3. Koel de reactiekolf met 4 tot -30 ° C met een koelbad.
      4. Voeg de ethyllithium oplossing aan de reactiekolf via een canule-overdracht bij -30 ° C. Blijf roeren bij deze temperatuur gedurende 1 uur en laat het langzaam opwarmen tot kamertemperatuur.
      5. Bewaken van de reactie met 11 B NMR. (Het gewenste tussenproduct piek verschijnt bij ongeveer 39,8 ppm).
      6. Na voltooiing van de reactie, koel de reactie tot -30 ° C en voeg 6,62 ml HCl-oplossing (2,0 M in Et2O, 13,2 mmol). Roer de reactie gedurende 1 uur terwijl zij langzaam opwarmen tot kamertemperatuur.
      7. Verwijder het oplosmiddel op een vacuüm gasverdeler met lage vacuüm (20-25 Torr) om het ruwe productmengsel verkregen.
      8. In een handschoenenkastje,isoleer het product via silicagel kolomchromatografie onder toepassing van 2-methylbutaan als elueermiddel. Verwijder de vluchtige op een vacuüm gasverdeler met een verzwakte vacuum om het zuivere product te verkrijgen als een kleurloze vloeistof.
        NB: De opbrengst is 56%.

    2. Eiwit Voorbereiding en kristallisatie van T4 lysozym Mutants

    1. Eiwitexpressie en zuivering
      1. Kweek E. coli RR1 getransformeerd met de plasmiden gekloneerd (of L99A L99A / M102Q) 17, 20 in 200 ml LB (lysogenie broth) medium aangevuld met 40,0 mg ampicilline bij 37 ° C gedurende 12 uur.
        OPMERKING: De samenstelling LB media 12 g trypton, 5 g gistextract, 10 g natriumchloride en 1 g glucose per 1 LH 2 O.
      2. Enten 4,00 L LB-medium (aangevuld met ampicilline 800 mg) met 160 ml van de overnacht cultuur en incubeer bij 37 ° C bij 240 rpm met een filtered luchttoevoer.
      3. Als de optische dichtheid bij 600 nm 0,7 bereikt Koel de bacteriekweek tot kamertemperatuur door het uit de incubator.
      4. Meet 695 mg isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (eindconcentratie 0,7 mM) in een conische centrifugebuis en voeg 4 ml LB-medium op te lossen.
      5. Voeg de oplossing IPTG aan de cultuur eiwitexpressie induceren. Incubeer het kweken bij 110 rpm gedurende 21 uur bij 25 ° C.
      6. Centrifugeer de kweken bij 4412 g gedurende 30 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 300 ml van 0,1 M natriumfosfaat (pH 6,6), 0,2 M NaCl en voeg 30,0 ml 0,5 M ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (pH 8,0). Roer de suspensie gedurende 17 uur bij 4 ° C.
      7. Voeg 30,0 ml 1,0 M MgCl2 en 0,500 ml deoxyribonuclease I (DNase I) aan de suspensie en roer bij kamertemperatuur gedurende 8 uur.
      8. Centrifugeer de gelyseerde celsuspensie bij 30.913 xg gedurende 30 min bij 4 76; C. Verzamel de supernatant dat tot expressie gebracht eiwit en gooi de pellet.
      9. Dialyseer het lysaat tegen 20 mM natriumfosfaat (pH 6,5 tot pH 6,3 en L99A L99A voor / M102Q) bij 4 ° C overnacht.
      10. Wassen en equilibreer 20,0 ml carboxymethyl ionenuitwisseling kralen met equilibratiebuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7,3)) in een kolom. Laad de oplossing die eiwit op de korrels en was de kolom met 100 ml van de equilibratiebuffer. Elueer de kolom met een 600 ml lineaire gradiënt van 300 mM NaCl in de equilibratiebuffer.
      11. Gebruik een lage-druk-chromatografie voor de kolomzuivering. Gebruik een pomp snelheid van 1 ml / min en het verzamelen van fracties van 10 ml. Verzamel de fracties die zuiver eiwit.
        : Tijdens elutie volgen de optische dichtheid (OD) bij 280 nm de aanwezigheid van het eiwit te controleren. Bepaal de zuiverheid van elke fractie door SDS-PAGE en laat alleen de zuiverste fracties.
    "Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 1
    Figuur 3: Representatieve resultaten voor het eiwit zuivering van T4 lysozym mutant L99A / M102Q. A) Chromatogram toont de gemeten UV-absorptie in AU bij 280 nm (blauwe lijn) en de geleidbaarheid in mS / cm (rode lijn). Fracties 20-23 werden samengevoegd en de zuiverheid werd bepaald met SDS-PAGE. B) 15% SDS-PAGE gel die de aanwezigheid van gezuiverde eiwit fracties 20-23 bij 18,6 kDa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    1. eiwitkristallisatie
      1. Breng de gezuiverde eiwitoplossing een dialysemembraan buis (12.000 tot 14.000 MWCO). Plaats de dialyse slang in een bekerglas met 4,00 liter 100 mM natriumfosfaat, 550 mM NaCl, 0,02% NaN3 (pH 6,5 voor L99A en pH 6,3 voor L99A / M102). Roer de 4 N oplossing overnacht bij 4 ° C.
      2. Voeg 2-mercaptoethanol (eindconcentratie van 5 mM) aan het gedialyseerde monster en concentreer tot ~ 40,0 mg / ml met behulp van een centrifugale concentrator (10.000 MWCO). Bepaal de eiwitconcentratie door meting van absorptie bij 280 nm. Verwijder eventuele neerslag door het draaien voorafgaand aan kristallisatie.
      3. Gebruik de damp-diffusie hanging-drop methode voor het eiwit kristallisatie. Meng 5,00 pi van het geconcentreerde proteïneoplossing met 5,00 pi van de reservoiroplossing (2,0-2,2 M natrium- / kaliumfosfaat, pH 6,7-7,1, 50 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM 2-hydroxyethyl disulfide) op een gesiliconiseerde glazen dekglaasje.
      4. Equilibreren het mengsel druppel tegen 1,00 mL van de voorraadoplossing door het plaatsen van het dekglaasje omgekeerd op de elk putje met reservoiroplossing. Gebruik vet om goed af, elk putje met de glijbaan. U verschillende omstandigheden met behulp van een 24-wells plaat met voorraadoplossing in 2.2.3 vermeld.Bewaar de plaat staan ​​bij 4 ° C voor kristalgroei.
        LET OP: Kristallen groeien normaal binnen 1-2 weken in de geëquilibreerde buffer op de cover dia. Onmiddellijke precipitatie tijdens het mengen eiwitoplossing met het reservoir in stap 2.2.3 geeft falen van kristallisatie.

    figuur 4
    Figuur 4: representatief beeld van kristallen van T4 lysozym mutant L99A voorafgaand aan complexvorming met liganden. Kristallen in de moederloog (2,1 M natrium- / kaliumfosfaat, pH 6,9, 50 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM 2-hydroxyethyl disulfide). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

    1. complex voorbereiding
      1. Pluk de kristallen met behulp van een cryogene buis gevormd tot een lus (zie Materials List) enleg ze in een 0,6 ml microcentrifugebuis. Voeg 50,0 ul van moederloog aan de buis tot droog te voorkomen en het behoud van de kristallen.
        LET OP: Single crystal selectie wordt geholpen met behulp van een microscoop.
      2. Breng de buis met kristallen in een handschoenenkastje. Neem 5,00 pi van de azaborine ligand (5) en plaats de binnenkant van de snap-cap van de buis. Kap en bewaar de buis in een koelkast (4 ° C) in de handschoenenkast voor 2-7 dagen evenwichtstoestand door dampdiffusie.
        De fysische en chemische eigenschappen (hoge volatiliteit en de oplosbaarheid in waterige oplossing) van de azaborine ligand (5) maakt het mogelijk de complexatie met de voorgevormde eiwitkristallen via dampdiffusie methode.
      3. Breng de kristallen met een cryogene slang gevormd tot een lus om een ​​glasplaatje met een druppel N-Paratone voorafgaand aan flash-bevriezen in vloeibare stikstof. Pluk het kristal beschermd met N-Paratone en snel flash-vries door kelderen het kristal oplus in een Dewar met vloeibare stikstof. Monteer het kristal op lus door het gebruik van een cryogene tong.
      4. Verzamel data sets van een enkel kristal met behulp van synchrotronstraling. Voer moleculaire vervanging met behulp van gepubliceerde structuren 20, 24; verificatie van het bestaan ​​van ligand in het eiwit bindingsplaats door een niet-gemodelleerd blob van elektronendichtheid.

    figuur 5
    Figuur 5: Atomic modellen van T4 lysozym mutant L99A bindingsplaats met elektronendichtheid. A) L99A holte met een VN-gemodelleerd elektronendichtheid blob in de bindingsplaats. B) L99A holte met de gemodelleerde azaborine ligand 5 in twee alternatieve conformeren. Gelieve click hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het schema syntheseweg voor 1,2-azaborines wordt weergegeven in figuur 1. Dit protocol is van toepassing op de synthese van vijf verschillende boor-stikstof bevattende moleculen. Figuur 2 11 B NMR-spectra gemeten tijdens stap 1,3 om de vorming van het gewenste product (3) te controleren. Eiwitzuivering werd uitgevoerd door het gebruik van lage-druk chromatografie systeem en een representatief chromatogram wordt getoond in figuur 3. De zuiverheid van de verzamelde fracties werd door SDS-PAGE. Kristallen van T4 lysozym mutant L99A zijn afgebeeld in Figuur 4. Figuur 5 toont de L99A bindingsplaats met-un gemodelleerde elektronendichtheid en de binding holte na verfijning met het ligand 5 gebonden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In het eerste deel van dit protocol beschreven we een gemodificeerde synthese van 1,2-azaborines gebaseerd op eerder beschreven werkwijzen 12, 13. Triallylborane 22 werd gebruikt als een substituut voor de routes met behulp van allyltriphenyl tin of kalium allyltrifluoroborate te bereiden N -allyl- N -TBS- B allyl chloride adduct (1). Deze methode zorgt voor een meer atoom-zuinige en milieuvriendelijke aanpak. Voor de synthese van N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3), één-pot, tweestaps sequentie (ringsluitingsmetathese gevolgd door oxidatie) werd gebruikt, hetgeen resulteerde in hogere geïsoleerde opbrengst dan de vorige werkwijze die isolatie van het tussenproduct (2) (52% vs. 29% over twee stappen). (Afhankelijk van de zuiverheid van het adduct (1) isolatie van het ringgesloten product voor oxidatiestapkan nodig zijn middels vacuümdestillatie. In dit geval, met dichloormethaan als oplosmiddel in plaats van tolueen vermindert de tijd voor het verwijderen van vluchtige stoffen voorafgaand aan destillatie.) Controle 11 B NMR (Figuur 2) gedurende de oxidatiestap tevens voordelen in vermindering van de totale hoeveelheid Pd / C in deze reactie (7 mol% vs 15 mol%).

Synthese van N -H- B ethyl-1,2-azaborine (5) werd uitgevoerd in twee stappen van 4 ethyllithium gebruiken in plaats van de eerder gerapporteerde sequentie 16 multistep dat het gebruik van een chroomcomplex vereist. De isolatie vereiste nauwkeurige temperatuurregeling en verzwakt vacuüm manipulatie als gevolg van de volatiliteit van het product. De technieken die in dit protocol kan ook worden toegepast op de zuivering van andere vluchtige stoffen.

In het tweede deel, we aangetoond eiwitzuivering en kristal complexeringT4 lysozym mutanten L99A en L99A / M102Q. Een standaard eiwitexpressie in E. coli RR1 stam en inductie via IPTG, gevolgd door chemische cellysis verschafte isolatie van het gewenste eiwit. Het is aangeraden om SDS-PAGE lopen na eiwit expressie en cellysis aan het succes van elke stap te bevestigen of te identificeren het mislukte proces. Voor de L99A T4 lysozym, kan het tot expressie gebrachte eiwit in zowel de supernatant en pellet door zijn activiteit bacteriële cellen te lyseren. In dit geval kunnen eiwit in de supernatant gedialyseerd tegen 20 mM natriumfosfaat buffer en gecombineerd met lysaat van cellysis voor kolomzuivering. Inductiecondities kan worden aangepast aan hogere temperatuur en een kortere tijd (van 21 uur bij 25 ° C 2-3 uur bij 37 ° C). Cellysis kan ook worden uitgevoerd door sonicatie met een ijsbad om oververhitting te voorkomen. Carboxymethyl ionenwisselaarkolom met 300 mM NaCl lineaire gradiënt werd gebruikt voor eiwitzuivering. Slechts> 95% zuiver (gebaseerd op SDS-PAGE) eiwitfracties werden verzameld en gebruikt in eiwitkristallisatie.

Vóór concentreren van de eiwitoplossing, toevoeging van 2-mercaptoethanol (eindconcentratie van 5 mM) (stap 2.2.2) aan de gedialyseerde eiwit was noodzakelijk om de spontane precipitatie te voorkomen, vooral voor L99A / M102Q eiwitten die de neiging gemakkelijk precipiteren bij hoge concentratie. Zoals eiwit complexering met 5 vereist een lucht-atmosfeer, werd het eiwit-ligand-complex bereid in een handschoenenkast. De materialen bereid in dit protocol werden gebruikt in bindingsstudies 1,2-azaborines in een biologisch modelsysteem: cavity bearingT4 lysozym mutanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% Sigma Aldrich 34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free Sigma Aldrich 309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) Fisher D37-20
Toluene Fisher T290-4
Pentane, HPLC Fisher P399-4
Acetonitrile Fisher A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% Sigma Aldrich 208027 Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd Strem 46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane Sigma Aldrich 211249 Highly toxic/Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5% Sigma Aldrich 471283
Grubbs 1st generation catalyst  materia C823
Acetamide Sigma Aldrich A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane Sigma Aldrich 561452 Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O Sigma Aldrich 455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% Sigma Aldrich 277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) ATCC 31343
T4 lysozyme WT* (L99A) Addgene 18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) Addgene 18477
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Invitrogen AM9464
Sodium phosphate monobasic anhydrous Fisher BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher BP332
Sodium chloride Fisher S642212 
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BP118
Magnesium chloride Sigma Aldrich M4880 Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI Fisher PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media Fisher 45-002-931
Tris-base Fisher BP152-500 
Sodium azide TCI S0489 Highly toxic
2-Mercaptoethanol Fisher ICN806443 
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators Fisher 14-558-501
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
2-Hydroxyethyl disulfide Sigma Aldrich 380474
N-paratone  Hampton Research HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO  Fisher 08-667E
 CryoLoop Hampton Research cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong Thermo Fisher cryogenic tong
Coot Electron density images are generated from the software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

Tags

Biochemistry azaborine heteroringen synthese eiwitkristallisatie T4 lysozym dampdiffusie opknoping druppel eiwit-ligand-complex röntgendiffractie bindingsinteractie
Synthese van 1,2-Azaborines en de voorbereiding van hun eiwitcomplexen met T4 lysozym Mutanten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis ofMore

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants. J. Vis. Exp. (121), e55154, doi:10.3791/55154 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter