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Biochemistry

Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants

Published: March 25, 2017 doi: 10.3791/55154
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Boston College

Introduction

Bor-Stickstoff - haltige Heterocyclen (dh 1,2-azaborines) wurden kürzlich große Aufmerksamkeit als Isostere von Arene gezogen. Diese Isosterie kann zur Diversifizierung der bestehenden Strukturmotive führen die chemischen Raum 2, 3, 4 zu erweitern. Azaborines haben potentielle Brauchbarkeit für die Anwendung in der biomedizinischen Forschung 5, 6, 7, 8, vor allem im Bereich der medizinischen Chemie in denen Chemiker strukturell Synthese von Bibliotheken durchzuführen und funktionell relevante Moleküle. Bezeichnenderweise jedoch während zahlreiche gut entwickelte Synthesewege zur Verfügung Aren enthaltenden Molekülen gibt es nur eine begrenzte Anzahl von Verfahren für die Synthese von azaborines 9 gemeldet wurden, 10, 11, 12, 13. Dies ist vor allem auf eine begrenzte Anzahl von Optionen für die Bor-Quelle und die luft- und feuchtigkeitsempfindlichen Natur des Moleküls in der frühen Phase der Synthesesequenz.

Im ersten Teil dieses Artikels, werden wir eine Multi-Gramm - Maßstab Synthese von N -TBS- B -Cl-1,2-Azaborins (3) unter Verwendung von Standardluftfreien Techniken beschreiben. Diese Verbindung dient als vielseitiges Zwischenprodukt , das weiter funktionalisiert werden kann 14 bis strukturell komplexeren Molekülen, 15. Ausgehend von 3, die Synthese und Reinigung von N -H- B -ethyl-1,2-Azaborins (5) zur Verwendung in Protein - Bindungsstudien beschrieben. Aufgrund der Volatilität von 5, erfordert die effiziente Isolierung eine präzise Steuerung der Reaktionstemperatur, Zeit und distillation Bedingungen.

Im zweiten Teil, Protokolle für die Proteinexpression und Isolierung von T4 - Lysozym - Mutanten (L99A und L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 wird durch die Proteinkristallisation und Herstellung von Protein-Ligand - Kristallkomplexe dargestellt werden, gefolgt. T4 - Lysozym - Mutanten L99A und L99A / M102Q wurden als biologische Modellsysteme ausgewählt , um die Wasserstoffbindungsfähigkeit von NH enthält Azaborins Moleküle 17 zu untersuchen. Mit einem Standard - Molekularbiologie - Protokoll wird das Protein in Escherichia coli RR1 - Stamm exprimiert und induziert mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). Proteinreinigung wird Ionenaustausch-Säulenchromatographie durchgeführt werden. Protein Kristallisation wird mit hochkonzentrierten gereinigte Proteinlösung (> 95% Reinheit durch Gelelektrophorese) durchgeführt unter Verwendung des HängeDrop Dampfdiffusionsverfahren. Wegen der Empfindlichkeit dieser Studie Liganden an Sauerstoff, die Protein-Ligand-Komplexe werden unter luftfreien Bedingungen hergestellt.

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Protocol

HINWEIS: Alle sauerstoff- und feuchtigkeitsempfindlichen Manipulationen wurden unter einer inerten Atmosphäre (N 2) entweder Standard luftfreie Techniken oder ein Handschuhfach mit. THF (Tetrahydrofuran), Et 2 O (Diethylether), CH 2 Cl 2 (Dichlormethan), Toluol und Pentan wurden durch Hindurchleiten durch eine neutrale Aluminiumoxidsäule unter Argon gereinigt. Acetonitril wurde über CaH 2 getrocknet (Calciumhydrid) und destilliert unter einer Stickstoffatmosphäre vor der Verwendung. Pd / C (Palladium auf Kohle) wurde 12 h bei 100 ° C unter Hochvakuum erwärmt, vor der Verwendung. Kieselgel (230-400 mesh) wurde unter Hochvakuum bei 180 ° C für 12 h getrocknet. Flash-Chromatographie wurde mit diesem Kieselgel unter einer inerten Atmosphäre durchgeführt wird. Alle anderen Chemikalien und Lösungsmittel wurden gekauft und wie erhalten verwendet.

HINWEIS: Achtung, bitte alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor der Verwendung zu konsultieren. Einige der Chemikalien in der Synthese a verwendetre akut giftig und krebserregend.

1. Herstellung von 1,2-Azaborines

HINWEIS: Charakterisierungsdaten aller Verbindungen , die in dieser Studie wurden zuvor 12 gemeldet, 13, 16.

Abbildung 1
Abbildung 1: Syntheseschema von 1,2-azaborines. Detaillierte Protokolle für die Synthese von jeder Verbindung (1-5) in dem Protokollabschnitt beschrieben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Herstellung von N -allyl- N -TBS- B -allyl Chlorid - Addukt (1)
    1. In einem Handschuhkasten, ausmessen 6,70 g (50,0 mmol) triallylborane 22 in einen ofengetrockneten 24/40 1 - l - Rundkolben , der mit einem Rührstab und 250 ml Dichlormethan. Der Kolben wird mit einer Gummimembran. Außerhalb der Box, die Lösung auf -78 ° C unter einer Stickstoffatmosphäre auf einem Vakuumgasverteiler.
    2. 100 ml 1,00 M Bortrichlorid-Lösung (100 mmol) in Hexan zu der triallylborane Lösung bei -78 ° C über eine Kanüle zu übertragen. Ließ das Reaktionsgemisch rühren bei dieser Temperatur für 4 h.
      HINWEIS: Vorsicht, Bortrichlorid ist mit Wasser hochreaktiv.
    3. In einem separaten 100 - ml - Kolben, ausmessen 25,7 g N - (t - Butyldimethylsilyl) - N -allylamine (150 mmol) und fügen 20,0 ml Dichlormethan. Zum 1 Reaktionskolben L, fügen Sie diese Lösung über eine Kanüle Übertragung, um die Reaktionstemperatur bei -78 ° C gehalten wird.
    4. Hinzufügen 21,0 ml Triethylamin (150 mmol) zu der Reaktion. Pflegen Sie unter einem positiven Stickstoffstrom gerührt und lassen es allmählich warm room Temperatur über Nacht.
    5. Nach 18 h Rühren entfernen etwa eine Hälfte des Lösungsmittels durch ein Vakuumgasverteiler mit einer Falle mit flüssigem Stickstoff unter Verwendung von Hochvakuum (300-500 mTorr).
    6. Nehmen Sie den Reaktionskolben in einem Handschuhkasten und filtern das weiße Salz gebildet, in dem Reaktionsgemisch durch einen ofengetrockneten mittlerer Porosität Fritte ausgestattet mit einem 24/40 Vakuumadapter und einem 24/40 500-ml-Rundkolben, der mit einem Aufsehen aus Bar. Verwenden Sie Dichlormethan alle übrigen Materialien zu übertragen.
    7. Entfernen Sie alle restlichen flüchtigen Bestandteile aus dem Filtrat außerhalb der Box ein Vakuumgasverteiler mit Hochvakuum mit.
    8. In einem Handschuhkasten, übertragen Sie die konzentrierte Reaktionsgemisch in einen ofengetrockneten 14/20 100-ml-Rundkolben, der mit einem Rührstab für die Destillation vorzubereiten. Kappe den Kolben mit einem Septum.
    9. Unter einem Stickstoffstrom, schnell das Septum öffnen und 200 mg Calciumhydrid als Trocknungsmittel hinzufügen.
    10. Richten Sie Destillationsapparatur durch eine Ofen- passendgetrocknet 14/20 Destillationskopf mit einem Thermometer angebracht, eine Seite mit einem Aufnahme 14/20 50 ml luftfreien Speicherkolben und die andere Seite mit dem 100-ml-Kolben Rohprodukt enthält. Bestücken Sie die Destillationskopf mit gekühltem Wasser. (Verwenden Sie Fett für alle Gelenke der Destillationsapparatur.)
      HINWEIS: Das Produkt beginnt zu destillieren, wenn die Dampftemperatur 60 ° C erreicht, bei 300 mTorr.
    11. Das Produkt weiter zu sammeln, indem die Temperatur des Ölbads erhöht, bis die Destillationskopfthermometer 75 ° C anzeigt.
      HINWEIS: Das Produkt ist eine klare, farblose Flüssigkeit.
    12. Stoppen Destillation von der Wärmequelle entfernt und das Gerät auf Raumtemperatur vor der Lagerung abkühlen. Nach dem Abkühlen wird die Apparatur mit Stickstoff wieder unter und schließen dicht das Kegelventil auf dem luftfreien Vorratsflasche. Bewahren Sie das isolierte Produkt in einem Handschuhkasten mit Gefrierfach.
      HINWEIS: Die Ausbeute kann von 65% bis 84% ​​variieren.
  2. Herstellung von N B -Cl Ringschlussprodukt (2)
    1. In einem Handschuhkasten, ausmessen 56,0 g N -allyl- N -TBS- B allyl Chlorid - Addukt (1) (217 mmol) in einen ofengetrockneten 24/40 1 - l - Rundkolben , der mit einem Rührstab und fügen 500 mL Toluol.
    2. Messen Sie 1,79 g Grubbs 1. Generation Katalysator (2,17 mmol).
    3. Fügen Sie den Katalysator portionsweise zu der gerührten Lösung von 1 bei Raumtemperatur in einem Handschuhkasten. Spülen Sie die Box während der Zugabe von Ethylengas aus der Reaktion gebildet zu entfernen.
      HINWEIS: Die Reaktion innerhalb von 30 Minuten nach Beendigung der Gasentwicklung typischerweise abgeschlossen ist. Als weiterer Indikator der Fertigstellung wird sich die Reaktionsfarbe vollständig von seiner anfänglichen violett bis braun geändert. An diesem Punkt kann das Produkt Vakuumdestillation isoliert werden verwendet; siehe Referenz 12 für weitere Einzelheiten. In diesem Protokoll wird ein Ein-Topf - Zwei-Schritt - Verfahren für die direkte Synthese von 3 beschrieben.
    4. Herstellung von N -TBS- B -Cl-1,2-Azaborins (3)
      1. Zu der Reaktionslösung des ringgeschlossenen Produkts (2) in Toluol hinzu 14,0 g Palladium auf Kohle (10 Gew% Pd, 13,2 mmol).
      2. Entfernen Sie den Kolben aus dem Kasten und passen sie mit einem ofengetrockneten 24/40 Rückflußkühler, der mit gekühltem Wasser mit Stickstoff und ausgestattet gespült wurde.
      3. Das Reaktions eines Ölbads auf einem kräftigen Rückfluss bei 135 ° C unter Verwendung von Rühren.
      4. Nach 16 h unter Rückfluss gehalten wird, kühlen die Reaktion durch den Kolben aus dem Ölbad entfernt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur zurückziehen um eine 0,5-ml-Aliquot aus dem Reaktionsgemisch mit einer Spritze, ausgestattet mit einem Ofen getrocknet Luer-Lock-Nadel. Übertragen Sie die 0,5 - ml - Aliquot auf einem Schraubdeckel-NMR - Röhrchen über 11 B - NMR - 12 zu analysieren.
        HINWEIS: Das gewünschte Produkt Peak bei ca. erscheint 35,5 ppm 12, während die Ausgangs material Peak erscheint bei ca. 42,9 ppm 12. Gewöhnlich an dieser Stelle 11 B - NMR zeigt die Reaktion unvollständig ist, mit einer geringen Ausgangsmaterial Spitze zu bleiben.
      5. Falls die Reaktion unvollständig ist, bringen den Reaktionskolben in einer Glovebox, und fügen einen zusätzlichen 3,00 g Palladium auf Kohle (10 Gew% Pd, 2,82 mmol).
      6. Resubject den Reaktionsbedingungen zum Rückfluss, wie in 1.3.2 und 1.3.3 beschrieben.
      7. Nach weiteren 24 h unter Rückfluss, zu analysieren ein weiteres Aliquot der Reaktion durch 11 B NMR. An diesem Punkt sollte die Reaktion vollständig.
      8. Übertragen Sie die Reaktionskolben auf dem Handschuhfach und übergeben Sie die Reaktionsmischung durch eine Einweg-Flash-Chromatographie-Säule mit Papiertüchern verpackt. Das Filtrat durch Waschen mit 50,0 ml Toluen.
      9. Entfernen Sie alle flüchtigen Bestandteile aus dem Filtrat außerhalb der Box auf einem Vakuumgasverteiler mit Hochvakuum ausgestattet.
        HINWEIS: Das Entfernen der flüchtigen Bestandteile kann 40 min t nehmeno 90 min je nach Vakuumdruck. Wenn das Vakuummeter Maximaldruck liest, zeigt es an, dass die Entfernung des Lösungsmittels abgeschlossen ist. Während Lösungsmittel zu entfernen, stellen Sie sicher, dass das Wasserbad unter dem Kolben für die Wärmeableitung bei Raumtemperatur bleibt.
      10. In einem Handschuhkasten, übertragen Sie die konzentrierte Reaktionsgemisch in einen ofengetrockneten 24/40 250-ml-Rundkolben, der mit einem Rührstab. Kappe den Kolben mit einem Septum.
      11. Schnell das Septum zu entfernen und 200 mg Calciumhydrid als Trocknungsmittel hinzufügen.
      12. Richten Sie Destillationsapparatur durch Anbringen eines ofengetrockneten 24/40 Destillationskopf mit einem Thermometer angebracht, eine Seite mit einem Aufnahme 24/40 100 ml luftfreien Speicherkolben und die andere Seite mit dem 100-ml-Kolben Rohprodukt enthält. Bestücken Sie die Destillationskopf mit gekühltem Wasser. Verwenden Sie Fett für alle Gelenke der Destillationsapparatur.
        HINWEIS: Das Produkt beginnt zu destillieren, wenn die Dampftemperatur 65 bis 70 ° C bei 1000 mTorr erreicht mit einem ÖlBadtemperatur zwischen 90-100 ° C. Das Produkt ist eine klare, farblose Flüssigkeit.
      13. Stoppen Destillation von der Wärmequelle entfernt und das Gerät auf Raumtemperatur vor der Lagerung abkühlen. Nach dem Abkühlen wird die Apparatur mit Stickstoff wieder unter und schließen dicht das Kegelventil auf dem luftfreien Vorratsflasche. Speichern das isolierte Produkt in einem Handschuhkasten Gefrierschrank bei -30 ° C.
        HINWEIS: Die Ausbeute für die Ein-Topf, zweistufigen Verfahren beträgt 52%.

    Figur 2
    Abbildung 2: 11 B - NMR - Spektren für die Überwachung der Bildung von N -TBS- B -Cl-1,2-Azaborins (3). A) N -Allyl- N -TBS-B-Allylchlorid - Addukts (1), Ausgangsmaterial für Ringschlussmetathese. B) Oxidation nach 16 h. (Nicht umgesetztes N -TBS- B -Cl Ring geschlossen Produkt (2) und isomerisiert B -vinyl ringgeschlossene Produkt (2 ') zusammen mit N-TBS-B-Cl-1,2-Azaborins (3) gezeigt.) C) Oxidation nach weiteren 24 h. D) isolierte Produkt (3) nach der Reinigung durch Vakuumdestillation. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    1. Herstellung von N -H- B -OBu-1,2-Azaborins (4)
      1. In einem Handschuhkasten, ausmessen 4,00 g N- TBS -B- Cl-1,2-Azaborins (3) (17,6 mmol) in einen ofengetrockneten 100 - ml - Rundkolben , der mit einem Rührstab und 35 ml Acetonitril. Messen Sie 1,14 g acetamid (19,3 mmol) und Transfer in den Reaktionskolben. Der Kolben wird mit einer Gummimembran.
      2. Entfernen Sie den Reaktionskolben aus dem Kasten und passen mit einem O24/40 Rückflußkühler ven getrocknet, der mit Stickstoff und ausgestattet mit gekühltem Wasser gespült wurde.
      3. Die Reaktion wird bei 85 ° C in einem Ölbad unter Rühren auf Rückfluß erhitzt.
      4. Nach 3 h am Rückfluß, kühlt die Reaktion durch die Kolben aus dem Ölbad entfernt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur, das Lösemittel wird auf einem Vakuumgasverteiler mit Hochvakuum ausgestattet.
      5. die flüchtigen Bestandteile unter Vakuum, abgeblasen, und der Reaktionsrückstand in 15,0 ml THF Nach dem Entfernen. Zu dieser Lösung hinzufügen 3,21 ml n - Butanol (35,1 mmol).
      6. Rühre das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 1 h.
      7. Entfernen des Lösungsmittels am Vakuum-Gasverteiler mit Hochvakuum ausgestattet, um das Rohprodukt zu erhalten.
      8. In einem Handschuhkasten, isolieren das Produkt über Silikagel-Säulenchromatographie mit einer Mischung von Pentan und Diethylether (5: 1) als Elutionsmittel gereinigt. Entfernen flüchtiger Bestandteile aus den produkthaltigen Fraktionen ein Vakuumgasverteiler mit Hochvakuum ausgestattet war das reine Produkt zu erhalten, wieein weißer Feststoff.
        HINWEIS: Die Ausbeute kann von 82% bis 87% variieren.
    2. Herstellung von N -H- B -ethyl-1,2-Azaborins (5)
      1. In einem Handschuhkasten, ausmessen 1,00 g N- H -B- OBu-1,2-Azaborins (4) (6,62 mmol) in einen ofengetrockneten 100 - ml - Rundkolben , der mit einem Rührstab und 25 ml Et 2 O. der Kolben wird mit einer Gummimembran und unter N 2 auf einem Vakuumgasverteiler.
      2. In einem separaten ofengetrockneten 100-ml-Rundkolben, fügen 26,5 ml Ethyllithium-Lösung (0,5 M in Benzol / Cyclohexan, 13,2 mmol) unter einer Stickstoffatmosphäre. Entfernen der Mischung aus dem Lösungsmittel (Benzol / Cyclohexan) aus dem Ethyllithium Reagenz Probleme zu vermeiden mit den gewünschten Azaborins Produkt isoliert. Abgeblasen , und der feste Ethyllithium in 13,0 ml Et 2 O
        HINWEIS: Achtung: Organolithiumreagentien sind pyrophor (zündfähigen bei Kontakt mit Luft oder Wasser). Das gewünschte Produkt (5
      3. Kühlen des Reaktionskolbens 4 bis -30 ° C mit einem Kühlbad enthält.
      4. Fügen Sie die Ethyllithium-Lösung in den Reaktionskolben über eine Kanüle Übertragung bei -30 ° C. Halten bei dieser Temperatur für 1 h gerührt und lassen es langsam auf Raumtemperatur erwärmen.
      5. Überwachen Sie die Reaktion durch 11 B - NMR. (Die gewünschte Zwischen Peak erscheint bei ca. 39,8 ppm.)
      6. Nach Beendigung der Reaktion Die Reaktion wird auf -30 ° C gekühlt und 6,62 ml HCl - Lösung (2,0 M in Et 2 O, 13,2 mmol). Rühre das Reaktionsgemisch 1 h und ermöglicht es langsam auf Raumtemperatur erwärmen.
      7. Entfernen Sie das Lösungsmittel auf einem Vakuumgasverteiler mit niedrigem Vakuum ausgestattet (20-25 Torr) das rohe Produktmischung zu erhalten.
      8. In einem Handschuhkasten,Isolieren des Produkts durch Silicagel-Säulenchromatographie, 2-Methylbutan als Elutionsmittel. Entfernen Sie die flüchtigen auf einem Vakuumgasverteiler mit einem abgeschwächten Vakuum ausgestattet, um das reine Produkt als farblose Flüssigkeit zu erhalten.
        HINWEIS: Die Ausbeute 56% ist.

    2. Protein Herstellung und Kristallisation von T4 Lysozym Mutants

    1. Protein Expression und Reinigung
      1. Wachsen E. coli RR1 transformiert Zellen mit den Plasmiden subkloniert (L99A oder L99A / M102Q) 17, 20 in 200 ml LB (LB-Medium) -Medium , ergänzt mit 40,0 mg Ampicillin bei 37 ° C für 12 h.
        HINWEIS: Die Zusammensetzung des LB - Medium 12 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g Natriumchlorid und 1 g Glucose pro 1 l H 2 O.
      2. Impfen 4,00 L LB-Medium (ergänzt mit 800 mg Ampicillin) mit 160 ml der Übernachtkultur und Inkubation bei 240 Umdrehungen pro Minute mit einem filtere bei 37 ° Cd Luftzufuhr.
      3. Wenn die optische Dichte 0,7 bei 600 nm erreicht hat, kühlt die Bakterienkultur auf Raumtemperatur, indem sie es aus dem Inkubator entfernt.
      4. Abmessen 695 mg Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) (Endkonzentration 0,7 mM) in einem konischen Zentrifugenröhrchen und 4 ml LB-Medium zu lösen.
      5. Fügen Sie die IPTG-Lösung zu dem Kulturproteinexpression zu induzieren. Inkubieren der Kulturen bei 110 Upm für 21 h bei 25 ° C.
      6. Zentrifugieren der Kultur bei 4412 × g für 30 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und das Pellet in 300 ml 0,1 M Natriumphosphat (pH 6,6), 0,2 M NaCl und füge 30,0 ml 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 8,0). Rühre die Suspension 17 h bei 4 ° C.
      7. Hinzufügen , 30,0 ml 1,0 M MgCl 2 und 0,500 ml Desoxyribonuclease I (DNase I) zu der Suspension und rührt bei Raumtemperatur 8 h.
      8. Zentrifugieren der lysierten Zellsuspension bei 30.913 × g für 30 min bei 4 76; C. Die überstehende Flüssigkeit exprimierte Protein enthält, und das Pellet verwerfen.
      9. Dialysieren das Lysat gegen 20 mM Natriumphosphat (pH 6,5 L99A und pH 6,3 für L99A / M102Q) bei 4 ° C über Nacht.
      10. Waschen und 20,0 ml carboxymethyl Ionenaustauscherkügelchen mit Äquilibrierungspuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7,3)) in eine Säule äquilibriert. Laden Sie die Lösung, die Protein auf die Kügelchen und waschen Sie die Säule mit 100 ml Äquilibrierungspuffer. Eluieren der Säule mit einem 600 ml linearen Gradienten von 300 mM NaCl im Äquilibrierungspuffer.
      11. Verwenden Sie ein Niederdruck-Chromatographie-System für die Säulenreinigung. Verwenden Sie eine Pumprate von 1 ml / min und sammeln Fraktionen von 10 ml. Sammeln Sie die Fraktionen, die reines Protein.
        HINWEIS: Bei der Elution, überwachen die optische Dichte (OD) bei 280 nm Anwesenheit des Proteins zu verifizieren. Bestimmen Sie die Reinheit jeder Fraktion durch SDS-PAGE und sammeln nur die reinsten Fraktionen.
    "Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Abbildung 1
    Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse für die Proteinreinigung von T4 - Lysozym - Mutante L99A / M102Q. A) Chromatogramm zeigt die gemessene UV - Absorption in AU bei 280 nm (blaue Linie) und Leitfähigkeit in mS / cm (rote Linie). Fraktionen 20-23 wurden vereinigt und die Reinheit wurde durch SDS-PAGE bestimmt. B) 15% SDS-PAGE - Gel , das Vorhandensein von gereinigtem Protein der Fraktionen 20-23 bei 18,6 kDa zeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    1. Proteinkristallisation
      1. Übertragen, um die gereinigte Proteinlösung auf eine Dialysemembran-Schlauch (12.000 bis 14.000 MWCO). Platzieren Sie den Dialyseschlauch in ein Becherglas mit 4,00 L von 100 mM Natriumphosphat, 550 mM NaCl, 0,02% NaN 3 (pH 6,5 L99A und pH 6,3 für L99A / M102). Rühren Sie die 4 l Lösung über Nacht bei 4 ° C.
      2. Fügen Sie 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration 5 mM) in die dialysierte Probe und Konzentrat auf ~ 40,0 mg / mL eine zentrifugale Konzentrators (10.000 MWCO). Bestimmung der Proteinkonzentration durch Absorption bei 280 nm gemessen wird. Entfernen Sie alle Niederschlag durch vor der Kristallisation Spinnen.
      3. Verwenden Sie die Dampfdiffusions hanging-Drop-Methode für die Proteinkristallisation. Mischungs 5,00 & mgr; l der konzentrierten Proteinlösung mit 5,00 & mgr; l der Reservoirlösung (2,0-2,2 M Natrium- / Kaliumphosphat, pH 6,7-7,1, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 50 mM 2-Hydroxyethyldisulfid) auf einem silikonisierten Glasabdeckung Folie.
      4. Äquilibrieren der Mischung Tropfen gegen 1,00 ml der Vorratslösung durch die Abdeckschlitten der Oberseite nach unten auf der Oberseite des jeweils gut haltigen Reservoirlösung platzieren. Verwenden Sie Fett zu eng jede Dichtung gut mit der Folie. verschiedenen Bedingungen unter Verwendung einer 24-Well-Platte mit Reservoirlösung in 2.2.3 erwähnt einrichten.Lagern Sie die Platte bei 4 ° C für das Kristallwachstum.
        HINWEIS: Kristalle normalerweise innerhalb von 1-2 Wochen in dem äquilibrierten Puffer auf dem Abdeckschlitten wachsen. Sofortige Fällung Proteinlösung mit der Reservoirlösung in Schritt 2.2.3 beim Mischen zeigt Versagen der Kristallisation.

    Abbildung 4
    Abbildung 4: Repräsentative Bild von Kristallen von T4 - Lysozym - Mutante L99A vor mit Liganden Komplexierung. Kristalle sind in der Mutterlauge (2,1 M Natrium- / Kaliumphosphat, pH 6,9, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 50 mM 2-Hydroxyethyldisulfid). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    1. Komplexe Vorbereitung
      1. Wählen Sie die Kristalle mit einer kryogenen Schlauch mit geformt in einer Schleife (siehe Materialliste) undlegen Sie sie in einem 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 50,0 & mgr; l der Mutterlösung zu dem Rohr Trockenheit zu vermeiden und um die Kristalle zu erhalten.
        HINWEIS: Einkristall Auswahl wird unter Verwendung eines Mikroskop unterstützt.
      2. Übertragen Sie die Röhre Kristalle in einer Glove-Box enthält. Nehmen 5,00 ul der Azaborins Ligand (5) und im Inneren der Schnappkappe des Rohres. Cap und speichern Sie die Röhre in einem Kühlschrank (4 ° C) im Inneren des Handschuhfach für 2-7 Tage zur Äquilibrierung durch Dampfdiffusion.
        HINWEIS: Die physikalischen Eigenschaften (hohe Volatilität und die Löslichkeit in wässriger Lösung) des Azaborins Ligand (5) ermöglicht die Komplexbildung mit den vorgeformten Proteinkristallen über Dampfdiffusionsverfahren.
      3. Übertragen Sie die Kristalle mit einer kryogenen Schlauch geformt in einer Schleife zu einem Glasträger ein Tröpfchen von N-Paratone mit enthalten, bevor sie in flüssigem Stickstoff Flash-gefriert. Suchen Sie sich die Kristall geschützt mit N-Paratone und schnell Flash-Freeze durch den Kristall stürzen aufSchleife in einen Dewar mit flüssigem Stickstoff enthält. Montieren Sie den Kristall auf Schleife durch eine kryogene Zange verwenden.
      4. Sammeln Sie Datensätze aus einem Einkristall mit Synchrotronstrahlung. Führen molekularen Ersatz mit veröffentlichten Strukturen 20, 24; die Existenz von Ligand in der Proteinbindungsstelle durch eine nicht modellierte Klecks Elektronendichte überprüfen.

    Abbildung 5
    Abbildung 5: Atomic Modelle von T4 - Lysozym - Mutante L99A Bindungstasche mit der Elektronendichte. A) L99A Hohlraum mit einer nicht modellierte Elektronendichte Klecks in der Bindungsstelle. B) L99A Hohlraum mit dem modellierten Azaborins Ligand 5 in zwei alternativen Konformationen. Bitte click hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Representative Results

Die schematische Syntheseweg für 1,2-azaborines ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll gilt für die Synthese von fünf verschiedenen Bor-Stickstoff-enthaltende Moleküle. 2 stellt 11 B - NMR - Spektren im Verlauf von Schritt 1.3 gemessen , um die Bildung des gewünschten Produkts (3) zu überwachen. Proteinreinigung wurde unter Verwendung von Niederdruck - Chromatographie - System durchgeführt , und ein repräsentatives Chromatogramm ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Reinheit der gesammelten Fraktionen wurde durch SDS-PAGE bestimmt. Kristalle von T4 Lysozym mutant L99A sind in Abbildung 4 dargestellt. Abbildung 5 zeigt die L99A Bindungstasche mit nicht modellierte Elektronendichte und die Bindung Höhle nach Verfeinerung mit dem Liganden 5 gebunden.

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Discussion

Im ersten Teil dieses Protokolls, beschrieben wir eine modifizierte Synthese von 1,2-azaborines basierend auf zuvor beschriebenen Verfahren 12, 13. Triallylborane 22 wurde als Ersatz für die Strecken verwendet allyltriphenyl Zinn oder Kalium allyltrifluoroborate Verwendung zur Herstellung von N -allyl- N -TBS- B allyl Chlorid - Addukt (1). Diese Methode ermöglicht eine atomökonomische und umweltfreundlichen Ansatz. Für die Synthese von N -TBS- B -Cl-1,2-Azaborins (3), eine Ein-Topf - Zweischrittfolge (Ring Metathese , gefolgt von Oxidation Schließen) verwendet, die in höheren isolierte Ausbeute als die vorherige ergab Verfahren , das die Isolierung der Zwischenstufe (2) (52% vs. 29% über zwei Stufen). (Jedoch, abhängig von der Reinheit des Addukts (1), Isolierung des ringgeschlossenen Produkts vor Oxidationsschrittkönnte notwendig sein, Vakuumdestillation verwendet wird. In diesem Fall verringert unter Verwendung von Dichlormethan als Lösungsmittel anstelle von Toluol Zeit zur Entfernung der flüchtigen Bestandteile vor der Destillation.) Überwachung 11 B - NMR (Figur 2) während des Oxidationsschrittes auch Vorteile bei der Reduktion in den Gesamtmengen von Pd / C in benutzten Reaktion (7 Mol-% vs 15 mol%).

Synthese von N -H- B -ethyl-1,2-Azaborins (5) wurde in zwei Schritten aus 4 unter Verwendung von Ethyllithium anstelle der zuvor berichteten Sequenz vielstufige 16 erreicht , die Verwendung eines Chromkomplexes erforderlich. Die Isolierung präzise Temperaturregelung und gedämpft Vakuum Manipulation erforderlich aufgrund der Volatilität des Produkts. Die Techniken, die in diesem Protokoll vorgestellt kann auch zur Reinigung von anderen flüchtigen Verbindungen angewendet werden.

Im zweiten Teil haben wir gezeigt, Proteinreinigung und Kristall Komplexvon T4-Lysozym-Mutanten L99A und L99A / M102Q. Ein Standard - Proteinexpression in E. coli RR1 - Stamm und Induktion IPTG unter Verwendung von chemischen Zelllyse ergab die Isolierung des gewünschten Proteins verfolgt wird . Es wird empfohlen, SDS-PAGE nach Proteinexpression und Zell-Lyse zu bestätigen den Erfolg eines jeden Schrittes oder identifizieren Sie den ausgefallenen Prozess ausgeführt. Für die L99A T4 Lysozym, kann das exprimierte Protein in dem Überstand und Pellet sowohl aufgrund seiner Aktivität gefunden werden, um Bakterienzellen zu lysieren. In diesem Fall Protein in dem Überstand gegen 20 mM Natriumphosphatpuffer dialysiert und mit Lysat aus Zelllyse für Säulenreinigung kombiniert. Induktionsbedingungen (bei 25 ° C 2-3 h bei 37 ° C von 21 h) zu einer höheren Temperatur und kürzerer Zeit eingestellt werden. Zell-Lyse kann auch durch Verwendung Beschallung mit einem Eisbad Hitzen zu verhindern durchgeführt werden. Carboxymethyl-Ionenaustauschsäule mit einem 300 mM NaCl linearer Gradient wurde für die Proteinreinigung verwendet. Nur> 95% rein (basierend auf SDS-PAGE) Proteinfraktionen wurden in Proteinkristallisation gesammelt und verwendet wird.

Vor der Proteinlösung zu konzentrieren, Zugabe von 2-Mercaptoethanol (Endkonzentration 5 mM) (Schritt 2.2.2) zu dem dialysierten Protein war notwendig, seine spontane Ausfällung zu verhindern, insbesondere für L99A / M102Q-Protein, das leicht bei hoher auszufällen neigt Konzentration. Als Proteinkomplexbildung mit 5 eine luftfreie Atmosphäre erforderlich, das Protein-Ligand - Komplex wurde in einem Handschuhkasten hergestellt. Hohlraum-bearingT4 Lysozym Mutanten: Die Materialien in diesem Protokoll vorbereitet wurden in Bindungsstudien von 1,2-azaborines in einem biologischen Modellsystem verwendet.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% Sigma Aldrich 34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free Sigma Aldrich 309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) Fisher D37-20
Toluene Fisher T290-4
Pentane, HPLC Fisher P399-4
Acetonitrile Fisher A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% Sigma Aldrich 208027 Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd Strem 46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane Sigma Aldrich 211249 Highly toxic/Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5% Sigma Aldrich 471283
Grubbs 1st generation catalyst  materia C823
Acetamide Sigma Aldrich A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8% Sigma Aldrich 281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane Sigma Aldrich 561452 Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O Sigma Aldrich 455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% Sigma Aldrich 277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) ATCC 31343
T4 lysozyme WT* (L99A) Addgene 18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) Addgene 18477
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Invitrogen AM9464
Sodium phosphate monobasic anhydrous Fisher BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous Fisher BP332
Sodium chloride Fisher S642212 
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BP118
Magnesium chloride Sigma Aldrich M4880 Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI Fisher PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media Fisher 45-002-931
Tris-base Fisher BP152-500 
Sodium azide TCI S0489 Highly toxic
2-Mercaptoethanol Fisher ICN806443 
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators Fisher 14-558-501
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
2-Hydroxyethyl disulfide Sigma Aldrich 380474
N-paratone  Hampton Research HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO  Fisher 08-667E
 CryoLoop Hampton Research cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong Thermo Fisher cryogenic tong
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References

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Biochemistry Heft 121 Azaborins Heterocyclen Synthese Proteinkristallisation T4 Lysozym Dampfdiffusion Hängetropfen Protein-Ligand-Komplex Röntgenbeugung Bindungs-Wechselwirkung
Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants
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Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of… More

Lee, H., Liu, S. Y. Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants. J. Vis. Exp. (121), e55154, doi:10.3791/55154 (2017).

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