סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4

Introduction

בורון-חנקן המכיל heterocycles (כלומר 1,2-azaborines) משך תשומת לב משמעותית לאחרונה isosteres של ארנס. Isosterism זה יכול להוביל גיוון של מוטיבים מבניים קיימים כדי להרחיב את השטח הכימי ^{2, 3, 4.} יש Azaborines שירות פוטנציאל היישום במחקר ביו ^{5, 6, 7, 8,} במיוחד בתחום של כימיה רפואית שבה כימאים לבצע סינתזה של ספריות של מבנית ומולקולות רלוונטיות מבחינה תפקודית. ראוי לציין, עם זאת, בעוד ישנם מסלולים סינטטיים מפותחים רבים למולקולות arene המכיל זמינות, רק מספר מצומצם של שיטות לסינתזה של azaborines דווח ^{9, 10, 11, 12, 13.} זאת בעיקר בשל מספר מצומצם של אפשרויות עבור מקור בורון ואת האוויר והטבע רגיש לחות של המולקולה בשלב המוקדם של רצף סינטטי.

בחלקו הראשון של מאמר זה, נתאר סינתזה סולם רב-גרם של N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) תוך שימוש בטכניקות אוויר ללא תקן. תרכובת זו משמשת ביניים צדדיים שיכול להיות פונקציונלי נוסף למולקולות מורכבות יותר מבחינה מבנית ^{14, 15.} החל מ 3, סינתזה וטיהור N -H- B -ethyl-1,2-azaborine (5) לשימוש במחקרים חלבון מחייב יתוארו. בשל התנודתיות של 5, הבידוד היעיל שלה דורש שליטה מדויקת של טמפרטורת תגובה, זמן, distillation תנאים.

בחלק השני, פרוטוקולים עבור ביטוי חלבון ובידוד של מוטציות ליזוזים T4 (L99A ו L99A / M102Q) ^{17, 18, 19, 20} יוצגו, ואחריו התגבשות חלבון והכנת מתחמי קריסטל חלבון-ליגנד. מוטציות ליזוזים T4 L99A ו L99A / M102Q נבחרו כמערכות מודל ביולוגי לבחון את יכולת מליטה המימן של NH המכיל מולקולות azaborine ^17. באמצעות פרוטוקול ביולוגיה מולקולרית סטנדרטי, החלבון מתבטא המתח Escherichia coli RR1 המושרה עם איזופרופיל- β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). טיהור חלבון מתבצעת באמצעות כרומטוגרפיה טור-חילוף יונים. התגבשות חלבון מתבצעת עם פתרון חלבון מטוהר מרוכז מאוד (> טוהר 95% על ידי ג'ל אלקטרופורזה) באמצעות התלייהטיפת שיטת דיפוזיה אדי. בשל הרגישות של ליגנדים של מחקר זה לחמצן, המתחמים ליגנד החלבון מוכנים בתנאי אוויר חינם.

Protocol

הערה: כל מניפולציות החמצן ולחות רגישה בוצעו תחת אווירת אינרטי (N ₂₎ או באמצעות טכניקות אוויר ללא רמה או תא הכפפות. THF (tetrahydrofuran), Et ₂ O (אתר diethyl), ₂ CH ₂ Cl (dichloromethane), טולואן, ו פנטן היו מטוהרים על ידי עובר דרך טור אלומינה נייטרלי תחת ארגון. אצטוניטריל היה מיובש על CAH ₂ (הידריד סידן) ומזוקק תחת אווירה חנקן לפני השימוש. Pd / C (פלדיום על פחמן) היה מחומם תחת ואקום גבוה ב -100 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפני השימוש. ג'ל סיליקה (230-400 רשת) היה מיובש במשך 12 שעות ב 180 ° C תחת ואקום גבוה. כרומטוגרפיה פלאש בוצעה עם ג'ל סיליקה זה תחת אווירה אינרטי. כל הכימיקלים וממסים אחרים נרכשו ושימש קבלו.

הערה: שימו לב, יש להתייעץ עם כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. כמה מן הכימיקלים המשמשים סינתזהמחדש בחריפות רעילים ומסרטנים.

1. הכנת 1,2-Azaborines

הערה: נתוני אפיון של כל התרכובות במחקר זה דווחו בעבר ^{12, 13, 16.}

איור 1: ערכה סינטתית של 1,2-azaborines. פרוטוקולים מפורטים לסינתזה של כל מתחם (1-5) מתוארים בסעיף בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. הכנת N -allyl- N -TBS- B adduct כלוריד -allyl (1)
   1. בתוך תא הכפפות, למדוד את 6.70 גרם (50.0 mmol) triallylborane ²² לתוך בקבוק בתנור יבש 24/40 1 L מסביב לתחתית מצויד בבר מערבב ומוסיף 250 dichloromethane מיליליטר. חותם את הבקבוק עם מחצה גומי. מחוץ לקופסה, מגניב הפתרון -78 ° C תחת חנקן אווירה על סעפת גז ואקום.
   2. הוספת 100 מ"ל של 1.00 M פתרון Trichloride בורון (100 מילימול) בהקסן לפתרון triallylborane ב- C ° -78 באמצעות העברה צינורית. תן ומערבבים לתערובת תגובה בטמפרטורה זו במשך 4 שעות.
      הערה: שימו לב, Trichloride בורון הוא מאוד תגובתי עם מים.
   3. בבקבוק 100 מ"ל נפרד, למדוד החוצה 25.7 גרם N - (-butyldimethylsilyl t) - N -allylamine (150 מילימול) ולהוסיף 20.0 dichloromethane מ"ל. אל בקבוק תגובת 1 L, להוסיף את הפתרון הזה באמצעות העברת צינורית בשמירה על טמפרטורת התגובה על -78 מעלות צלזיוס.
   4. הוסף 21.0 מ"ל triethylamine (150 מילימול) לתגובה. לשמור על תנודות מתחת תזרים חיובי של חנקן ולאפשר לו חם בהדרגה roלילה טמפרטורת אום.
   5. לאחר 18 שעות של ערבובים להסיר כמחצית של ממס דרך סעפת גז ואקום באמצעות ואקום גבוה (300-500 mTorr) עם מלכודת חנקן נוזלי.
   6. קח את בקבוק התגובה לתוך תא כפפות ולסנן את מלח לבן נוצר מתערובת התגובה באמצעות frit הנקבובית-בינוני מיובש בתנור מצויד מתאם 24/40 ואקום בבקבוק 24/40 500 מיליליטר מסביב לתחתית עם ומערבבים בָּר. השתמש dichloromethane להעביר את כל החומרים הנותרים.
   7. הסר כל נדיפים שנותרו מן התסנין מחוץ לקופסא באמצעות סעפת גז ואקום עם ואקום גבוה.
   8. בתוך תא הכפפות, להעביר את תערובת התגובה המרוכזת לתוך מיליליטר בתנור יבש 14/20 100 בקבוק מסביב לתחתית עם בר ומערבב להתכונן זיקוק. כיסוי או הבקבוק עם מחצה.
   9. תחת זרם של חנקן, לפתיחה מהירה של מחצה ולהוסיף הידריד סידן 200 מ"ג כסוכן ייבוש.
   10. הגדרת מנגנון זיקוק ידי התאמת oven-יבשי 14/20 ראש הזיקוק מצורף עם מדחום, צד אחד עם בקבוק אחסון אוויר ללא מיליליטר קבלת 14/20 50 ואת הצד השני עם בקבוק המ"ל 100 מוצר המכיל גולמי. צייד את ראש הזיקוק במים צוננים. (השתמש גריז לכל המפרקים של מנגנון הזיקוק.)
       הערה: המוצר מתחיל לזקק כאשר הטמפרטורה אדי מגיע 60 מעלות צלזיוס ב 300 mTorr.
   11. המשך איסוף המוצר על ידי העלאת הטמפרטורה של אמבט שמנים עד מדחום ראש הזיקוק קורא 75 ° C.
       הערה: המוצר הוא נוזל חסר צבע ברור.
   12. עצור זיקוק על ידי הסרת מקור חום לקרר את המנגנון לטמפרטורת החדר לפני האחסון. לאחר קירור, repressurize המנגנון עם חנקן בשר ומהדקים שסתומים תקע על בקבוק אחסון חינם-האוויר. אחסן את המוצר המבודד במקפיא תא הכפפות.
       הערה: התשואה יכולה לנוע בין 65% ל -84%.
2. הכנת N B -Cl-סגור טבעת מוצר (2)
   1. בתוך תא הכפפות, למדוד החוצה 56.0 גרם N -allyl- N adduct כלוריד -allyl -TBS- B (1) (217 מילימול) בתוך הבקבוק בתנור יבשים 24/40 1 L מסביב לתחתית עם בר ומערבבים ולהוסיף 500 טולואן מ"ל.
   2. מדוד את 1.79 גרם גרובס 1 זרז הדור ^st (2.17 מילימול).
   3. מוסיפים את הזרז חלק-חכם הפתרון ערבוב של 1 בטמפרטורת החדר בתוך תא הכפפות. טהר את התיבה לפני התוספת להסיר גז אתילן נוצר מן התגובה.
      הערה: התגובה היא בדרך כלל מלאה תוך 30 דקות של הפסקת אבולוצית גז. כפי אינדיקטור נוסף השלמה, צבע התגובה יהיה השתנה לחלוטין מסגול הראשוני שלה להשחים. בשלב זה, המוצר ניתן לבודד באמצעות זיקוק ואקום; ראה התייחסות 12 לפרטים. בפרוטוקול זה, הליך בסיר אחד, שני שלבים לסינתזה הישירה של 3 מתואר.
   4. הכנת N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
      1. כדי פתרון התגובה של מוצר הטבעת סגורה (2) טולואן, להוסיף 14.0 גרמו פלדיום על פחם (10% WT Pd, 13.2 mmol).
      2. הסר את הבקבוק מהקופסה להתאים אותו עם מעבה בתנור יבש 24/40 ריפלוקס כי כבר מטוהרת עם חנקן ומצוידי מים צוננים.
      3. מחמם את התגובה באמצעות אמבט שמנים על ריפלוקס נמרץ ב 135 ° C תוך ערבוב.
      4. לאחר שמירה על ריפלוקס במשך 16 שעות, לקרר את התגובה על ידי הסרת הבקבוק מהאמבטיה השמנה. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, לסגת aliquot 0.5 מ"ל מתערובת התגובה באמצעות מזרק מצויד במחט מנעול Luer מיובש בתנור. מעבירים את aliquot 0.5 מ"ל לצינור NMR הברגה לנתח באמצעות ¹¹ B תמ"ג ^12.
         הערה: שיא המוצר הרצוי בחברת CA. 35.5 ppm ^12, בעוד מאטר מתחילשיא ial מופיע ca. 42.9 ppm ^12. בדרך כלל בשלב זה ¹¹ B התמ"ג מציין את התגובה אינה שלמה, עם שיא חומר המוצא קטין נותר.
      5. אם התגובה אינה מלאה, להביא את בקבוק התגובה לתוך תא כפפות ולהוסיף פלדיום 3.00 גרם נוסף על פחמן (10% WT Pd, 2.82 מילימול).
      6. Resubject התגובה לריפלוקס תנאי כמתואר 1.3.2 ו 1.3.3.
      7. לאחר 24 שעות נוספות על ריפלוקס, לנתח aliquot אחר של התגובה על ידי ¹¹ B תמ"ג. בשלב זה, התגובה צריכה להיות מוחלטת.
      8. מעביר את הבקבוק בתגובת תא הכפפות ולהעביר את תערובת התגובה דרך עמודת כרומטוגרפיה פלאש הפנויה ארוזה עם מגבוני נייר. אסוף את תסנין ידי שטיפה עם 50.0 מ"ל של טולואן.
      9. הסר כל נדיפים מן התסנין מחוץ לקופסא על סעפת גז ואקום מצוידת ואקום גבוה.
         הערה: הסרת נדיפים יכול לקחת 40 דקות to 90 דקות תלויות בלחץ הוואקום. כאשר מד הוואקום קורא לחץ מקסימאלי, הוא מציין כי הסרת הממס הושלמה. תוך הסרת ממס, לוודא כי באמבט מים מתחת הבקבוק נשאר בטמפרטורת החדר למשך פיזור חום.
      10. בתוך תא הכפפות, להעביר את תערובת התגובה המרוכזת לתוך מיליליטר בתנור יבש 24/40 250 בקבוק מסביב לתחתית עם בר ומערבב. כיסוי או הבקבוק עם מחצה.
      11. להסיר במהירות את מחצה ולהוסיף הידריד סידן 200 מ"ג כסוכן ייבוש.
      12. הגדרת מנגנון זיקוק ידי התאמת ראש זיקוק בתנור יבש 24/40 מצורף עם מדחום, צד אחד עם בקבוק אחסון אוויר ללא מיליליטר קבלת 24/40 100 ואת הצד השני עם 100 המ"ל בבקבוק המכיל מוצר גולמי. צייד את ראש הזיקוק במים צוננים. השתמש גריז לכל המפרקים של מנגנון הזיקוק.
          הערה: המוצר מתחיל לזקק כאשר הטמפרטורה אדי לגיל 65 עד 70 מעלות צלזיוס ב 1000 mTorr עם שמןהטמפרטורה באמבטיה בין 90-100 מעלות צלזיוס. המוצר הינו נוזל חסר צבע ברור.
      13. עצור זיקוק על ידי הסרת מקור חום לקרר את המנגנון לטמפרטורת החדר לפני האחסון. לאחר קירור, repressurize המנגנון עם חנקן בשר ומהדקים שסתומים תקע על בקבוק אחסון חינם-האוויר. אחסן את המוצר המבודד במקפיא תא הכפפות ב- C -30 °.
          הערה: התשואה עבור ההליך בסיר אחד, שני שלבים הוא 52%.

   
   איור 2: ספקטרום NMR ¹¹ B ליצירת ניטור של N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). א) N -Allyl- N -TBS-B-allyl adduct כלוריד (1), חומר המוצא עבור metathesis סגירת טבעת. B) חמצון לאחר 16 שעות. (Unreacted N -TBS- B -Cl-סגור טבעת המוצר (2) ו isomerized B -vinyl טבעת סגורה מוצר (2 ') יחד עם N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine (3) מוצגים.) C) חמצון לאחר 24 שעות נוספות. D) מוצר מבודד (3) לאחר טיהור ידי זיקוק ואקום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

   4. הכנת N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
      1. בתוך תא הכפפות, למדוד את 4.00 גרם N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17.6 mmol) בתוך הבקבוק בתנור יבשים 100 מ"ל מסביב לתחתית עם בר ומערבבים ולהוסיף 35 אצטוניטריל מ"ל. מדוד את 1.14 גרם acetamide (19.3 mmol) ולהעביר את בקבוק התגובה. חותם את הבקבוק עם מחצה גומי.
      2. הסר את בקבוק התגובה מהתיבה ולהשתלב עם oven מיובש 24/40 קבל ריפלוקס כי כבר מטוהר עם חנקן ומצוידי מים צוננים.
      3. מחממים את התגובה לריפלוקס ב 85 מעלות צלזיוס באמבט שמן עם ערבוב.
      4. אחרי 3 שעות ב ריפלוקס, לצנן את התגובה על ידי הסרת הבקבוק מהאמבטיה השמנה. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להסיר את הממס על סעפת גז ואקום מצויד ואקום גבוה.
      5. לאחר הסרת נדיפים תחת ואקום, redissolve שאריות התגובה THF 15.0 מ"ל. לפתרון זה להוסיף 3.21 מ"ל של n -butanol (35.1 mmol).
      6. מערבבים את התגובה בטמפרטורת החדר 1 ח.
      7. הסר את הממס על סעפת גז ואקום מצוידת ואקום גבוה כדי להשיג את המוצר הגולמי.
      8. בתוך תא הכפפות, לבודד את המוצר באמצעות כרומטוגרפיה סיליקה ג'ל טור, באמצעות תערובת של פנטן ואתר diethyl (5: 1) כמו eluent. הסר נדיפים מן השברים המכילים תוצר הלוואי באמצעות סעפת גז ואקום מצוידת ואקום גבוה כדי לקבל את המוצר הטהור כמולבן מוצק.
         הערה: התשואה יכולה לנוע בין 82% ל -87%.
   5. הכנת N -H- B -ethyl-1,2-azaborine (5)
      1. בתוך תא הכפפות, למדוד את 1.00 גרם N- H -B- אובו-1,2-azaborine (4) (6.62 מילימול) בתוך הבקבוק בתנור יבשים 100 מ"ל מסביב לתחתית עם בר ומערבבים ולהוסיף 25 מ"ל Et ₂ O. חותם את הבקבוק עם מחצה גומי ומקום תחת N ₂ על סעפת גז ואקום.
      2. בבקבוק תחתית עגולה 100 מ"ל בתנור יבשים נפרד, להוסיף 26.5 מ"ל של תמיסת ethyllithium (0.5 M ב בנזן / cyclohexane, 13.2 mmol) תחת אווירה חנקן. הסר את התערובת של הממס (בנזין / cyclohexane) מן מגיב ethyllithium כדי למנוע בעיות עם בידוד המוצר azaborine הרצוי. Redissolve ethyllithium מוצק 13.0 מ"ל Et ₂ O.
         הערה: שים לב: ריאגנטים Organolithium הם pyrophoric (דליקים במגע עם אוויר או מים). המוצר הרצוי (5
      3. מצנן את בקבוק התגובה המכיל 4 עד -30 ° C עם אמבטית קירור.
      4. מוסיף את פתרון ethyllithium אל בקבוק התגובה באמצעות העברת צינורית ב -30 ° C. שמור ערבוב בטמפרטורה זו במשך 1 שעות ולאפשר לו חם לאט לטמפרטורת החדר.
      5. צג את התגובה על ידי ¹¹ B תמ"ג. (שיא הביניים הרצוי בחברת CA. 39.8 ppm.)
      6. עם השלמת התגובה, לקרר את התגובה -30 ° C ולהוסיף 6.62 מ"ל פתרון HCl (2.0 M ב Et ₂ O, 13.2 mmol). מערבבים את התגובה של 1 ש 'אך מאפשרים לה חם לאט לטמפרטורת החדר.
      7. הסר את הממס על סעפת גז ואקום מצוידת ואקום נמוך (20-25 Torr) עד לקבלת המוצר הגולמית.
      8. בתוך תא הכפפות,לבודד את המוצר באמצעות כרומטוגרפיה בעמודה סיליקה ג ', באמצעות כפי eluent 2-methylbutane. הסר את נדיפים על סעפת ואקום גז מצויד ואקום מוחלש כדי לקבל את המוצר הטהור כמו נוזל חסר צבע.
         הערה: התשואה היא 56%.

   2. הכנת חלבון התגבשות של מוטאנטים ליזוזים T4

   1. ביטוי חלבון וטיהור
      1. לגדל תאים E. coli RR1 הפך עם פלסמידים subcloned (L99A או L99A / M102Q) ^{17, 20} ב 200 מ"ל LB (מרק lysogeny) התקשורת השלימו עם אמפיצילין 40.0 מ"ג ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
         הערה: הרכב מדיה LB הוא tryptone 12 גרם, 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם נתרן כלורי, ו 1 גלוקוז גרם לכל 1 LH ₂ O.
      2. לחסן 4.00 מדיה L LB (בתוספת אמפיצילין 800 מ"ג) עם 160 מ"ל של תרבות לילה לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 240 סל"ד עם filtereאספקת אוויר ד.
      3. כאשר הצפיפות האופטית מגיעה 0.7 ב 600 ננומטר, לקרר את תרבית החיידקים לטמפרטורת חדר על ידי הסרתו מן החממה.
      4. מדוד את 695 מ"ג של איזופרופיל- β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (ריכוז סופי של 0.7 מ"מ) בצינור צנטריפוגה חרוטים ולהוסיף 4 מיליליטר תקשורת LB לפזר.
      5. מוסיפים את פתרון IPTG לתרבות להשרות ביטוי חלבון. דגירת התרבויות ב 110 סל"ד במשך 21 שעות ב 25 מעלות צלזיוס.
      6. צנטריפוגה התרבות ב 4,412 XG במשך 30 דקות ב 4 °. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 300 מ"ל של 0.1 M פוספט נתרן (pH 6.6), 0.2 M NaCl ולהוסיף 30.0 מ"ל של 0.5 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (pH 8.0). מערבבים את ההשעיה עבור 17 שעות ב 4 ° C.
      7. הוסף 30.0 מ"ל של 1.0 M MgCl ₂ ו 0.500 מ"ל של deoxyribonuclease אני (DNase אני) על השעיית ומערבבים בטמפרטורת החדר למשך 8 שעות.
      8. צנטריפוגה השעית תא lysed ב 30,913 XG במשך 30 דקות ב 4 76; C. אסוף את supernatant המכיל חלבון הביע וזורק את הכדור.
      9. Dialyze את lysate נגד פוספט נתרן 20 מ"מ (pH 6.5 עבור L99A ו- pH 6.3 עבור L99A / M102Q) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      10. לשטוף לאזן 20.0 מ"ל של חרוזים חילוף יונים carboxymethyl עם חיץ איזון (50 מ"מ טריס, 1 mM EDTA (pH 7.3)) בטור. טען את חלבון המכיל הפתרון על חרוזים לשטוף את העמודה עם 100 מ"ל של חיץ איזון. Elute את העמודה עם שיפוע ליניארית מ"ל 600 של 300 מ"מ NaCl בתוך חיץ איזון.
      11. השתמש במערכת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך לטיהור העמודה. השתמש שיעור משאבת של 1 מ"ל / דקה לאסוף שברים של 10 מ"ל. אסוף שברים המכיל חלבון טהור.
          הערה: במהלך elution, לפקח על הצפיפות האופטית (OD) ב 280 ננומטר לאמת נוכחות של החלבון. לקבוע את הטוהר של כל חלק על ידי SDS-PAGE ולאסוף את השברים הטהורים בלבד.
   "FO: keep-together.within-page =" 1 ">
   איור 3: נציג תוצאות עבור טיהור החלבונים של L99A מוטציה ליזוזים T4 / M102Q. א) chromatogram מראה את ספיגת UV שנמדדה AU ב 280 ננומטר (הקו הכחול) ומוליכות ב- MS / ס"מ (קו אדום). שברי 20-23 אוחדו הטוהר נקבע על ידי SDS-PAGE. B) 15% SDS-PAGE ג'ל מראה נוכחות של חלבון מטוהרים של שברים 20-23 ב 18.6 kDa. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
   2. התגבשות חלבון
      1. מעבירים את הפתרון חלבון מטוהרים על צינורות קרום דיאליזה (12,000 ל -14,000 MWCO). מניחים את צינורות דיאליזה לתוך מבחנה המכילה 4.00 ליטר של פוספט נתרן 100 מ"מ, 550 מ"מ NaCl, 0.02% NaN ₃ (pH 6.5 עבור L99A ו- pH 6.3 עבור L99A / M102). מערבבים את הפתרון L 4 לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      2. מוסיפים 2-mercaptoethanol (ריכוז סופי של 5 מ"מ) המדגם dialyzed ולהתרכז כדי ~ 40.0 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות concentrator צנטריפוגלי (10,000 MWCO). קביעת ריכוז החלבון על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר. הסר את כל המשקע על ידי ספינינג לפני התגבשות.
      3. השתמש בשיטת תליית ירידת אדי דיפוזיה עבור התגבשות חלבון. מערבבים 5.00 μL של פתרון חלבון מרוכז עם 5.00 μL של פתרון המאגר (2.0-2.2 M נתרן / אשלגן זרחתי, pH 6.7-7.1, 50 מ"מ 2-mercaptoethanol, 50 מ"מ דיסולפיד 2-hydroxyethyl) בשקופית מכסה זכוכית siliconized.
      4. לאזן את הירידה תערובת נגד 1.00 מ"ל של הפתרון למאגר על ידי הצבת את השקופית לכסות במהופך על גבי פתרון מאגר המכיל כל טוב. השתמש גריז לאטום הרמטית כל טוב עם שקופיות. הגדרת תנאים שונים באמצעות צלחת 24 גם עם פתרון מאגר מוזכר 2.2.3.אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס במשך צמיחת קריסטל.
         הערה: קריסטלים בדרך כלל לגדול בתוך 1-2 שבועות למאגר equilibrated בשקופית לכסות. ממטרים מיידיים במהלך ערבוב פתרון חלבון עם פתרון המאגר בשלב 2.2.3 מצביע על כשל של התגבשות.

   
   איור 4: תמונה מייצגת של גבישים של L99A מוטציה ליזוזים T4 לפני complexation עם הליגנדים. קריסטלים נמצאים המשקאות אמא (2.1 M נתרן / אשלגן זרחתי, pH 6.9, 50 מ"מ 2-mercaptoethanol, 50 מ"מ דיסולפיד 2-hydroxyethyl). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

   3. הכנת Complex
      1. בחר את הגבישים באמצעות צינורות קריוגני בצורה ללולאה (ראה רשימת חומרים) ולמקם אותם בתוך שפופרת 0.6 מ"ל microcentrifuge. להוסיף 50.0 μL של ליקר אמא אל הצינור כדי למנוע יובש ולשמר את הגבישים.
         הערה: בחירת גביש יחידה נעזרה באמצעות מיקרוסקופ.
      2. מעבירים את שפופרת המכילה גבישים לתוך תא הכפפות. קח 5.00 μL של ליגנד azaborine (5) ומניחים בתוך ה- Snap-כובע של הצינור. שווי ולאחסן את הצינורית מקרר (4 ° C) בתוך תא הכפפות עבור 2-7 ימים עבור איזון על ידי דיפוזיה אדי.
         הערה: התכונות הפיסיקליות (תנודתיות גבוהה מסיס בתמיסה מימית) של ליגנד azaborine (5) מאפשרת complexation עם גבישי החלבון מתבצעים דרך שיטת דיפוזיה אדי.
      3. מעביר את הגבישים באמצעות צינורות קריוגני בצורה ללולאה לשקופית זכוכית המכילה טיפה של N-paratone לפני פלאש-ההקפאה בחנקן נוזלי. פיק הגביש מוגן עם N-paratone במהירות להקפיא פלאש באמצעות תקיעת הקריסטל עללולאה לתוך דיואר המכיל חנקן נוזלי. הר הגביש על לולאה באמצעות טונג קריוגני.
      4. אסוף ערכות נתונים של גביש יחיד באמצעות קרינת synchrotron. בצע החלפה מולקולרית באמצעות מבנים פרסמו ^{20, 24;} לאמת את קיומו של ליגנד בתוך אתר החלבון מחייב על ידי כתם בלתי הדגם של צפיפות אלקטרונים.

   
   איור 5: מודלים אטומיים של L99A מוטציה ליזוזים T4 מחייבים כיס עם צפיפות אלקטרונים. א) L99A חלל עם בועת צפיפות אלקטרונים-פי דגם של האו"ם אתר הקישור. B) L99A חלל עם ליגנד azaborine הדגם 5 בשני conformers חלופי. אנא CLאיכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Representative Results

המסלול סינתטי סכמטי עבור 1,2-azaborines מוצג באיור 1. פרוטוקול זה חל על סינתזה של חמש מולקולות המכילות חנקן בורון שונים. איור 2 מייצג ¹¹ ספקטרום B התמ"ג נמדד במהלך הצעד 1.3 לפקח על היווצרות של המוצר הרצוי (3). טיהור חלבון בוצעה באמצעות מערכת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך ו הכרומתוגרמה נציג מוצגת באיור 3. הטוהר של השברים שנאספו נקבע על ידי SDS-PAGE. קריסטלים של L99A מוטציה ליזוזים T4 מתוארים באיור 4. איור 5 מראה בכיס מחייב L99A עם צפיפות אלקטרונים-פי דגם של האו"ם ואת החלל מחייב לאחר עידון עם ליגנד 5 כבול.

Discussion

בחלקו הראשון של פרוטוקול זה, תארנו סינתזה שונה של 1,2-azaborines מבוסס על שיטות שדווחו בעבר ^{12, 13.} Triallylborane ²² שימש כתחליף המסלולים באמצעות allyltriphenyl allyltrifluoroborate פח או אשלגן להכין N -allyl- N adduct כלוריד -allyl -TBS- B (1). שיטה זו מאפשרת גישה אטומה-חסכונית וידידותית לסביבה יותר. לסינתזה של N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3), רצף בסיר אחד, שני שלבים (טבעת סגירת metathesis ואחריו חמצון) הועסקה, אשר הביאה תשואה מבודדת גבוה יותר מאשר הקודם שיטה המעורבת בידוד של ביניים (2) (52% לעומת 29% מעל שני צעדים). (עם זאת, בהתאם לטוהר של adduct (1), בידוד של המוצר עצום הטבעת לפני שלב חמצוןייתכן שיהיה צורך להשתמש זיקוק ואקום. במקרה זה, באמצעות dichloromethane ממס במקום טולואן מקטין את זמן להסרת נדיפים לפני זיקוק.) ניטור ¹¹ B תמ"ג (איור 2) במהלך השלב חמצון גם הטבות הפחתת סך כל Pd / C בשימוש זה תגובה (% mol 7 לעומת 15% mol).

סינתזה של N -H- B -ethyl-1,2-azaborine (5) הושג בשני שלבים מ -4 באמצעות ethyllithium במקום רצף רב שלבי שדווח בעבר ¹⁶ כי נדרש שימוש קומפלקס כרום. הבידוד הנדרש בקרת טמפרטורה מדויקת ומניפולציה ואקום נחלש בשל התנודתיות של המוצר. הטכניקות שהוצגו בפרוטוקול זה יכול להיות מיושמות גם טיהור של תרכובות נדיפות אחרות.

בחלק השני, הראינו טיהור חלבונים complexation קריסטלשל מוטציות ליזוזים T4 L99A ו L99A / M102Q. ביטוי חלבון סטנדרטי זן E. coli RR1 ואינדוקציה באמצעות IPTG, ואחריו בידוד מוענק תמוגה תא הכימי של החלבון הרצוי. מומלץ לרוץ SDS-PAGE לאחר ביטוי חלבון ו תמוגה התא כדי לאשר את ההצלחה של כל שלב או לזהות את התהליך נכשל. עבור ליזוזים T4 L99A, החלבון הביעו ניתן למצוא הן את supernatant ו גלולה בשל פעילותה lyse תאים חיידקיים. במקרה זה, החלבון supernatant ניתן dialyzed נגד חיץ פוספט נתרן 20 מ"מ בשילוב עם lysate מן תמוגה התא לטיהור העמודה. תנאי אינדוקציה יכולים להיות מותאמים לטמפרטורה גבוהה וזמן קצר יותר (מ -21 שעות ב -25 ° C עד 2-3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס). תמוגה התא יכול להיות גם ביצע באמצעות sonication עם אמבט קרח כדי למנוע התחממות יתר. טור חילוף יונים carboxymethyl עם שיפוע ליניארית 300 מ"מ NaCl שימש טיהור חלבונים. רק> 95% טהורים (מבוסס על SDS-עמוד) שברי חלבון נאספו המשמש התגבשות חלבון.

לפני להתרכז פתרון החלבון, תוספת של 2-mercaptoethanol (ריכוז סופי של 5 מ"מ) (שלב 2.2.2) לחלבון dialyzed הייתה צורך למנוע המשקעים שלה ספונטניים, במיוחד עבור L99A / חלבון M102Q הנוטה לזרז בהישג גבוה ריכוז. כפי complexation חלבון עם 5 נדרש אווירה אוויר חינם, מורכב החלבון ליגנד הוכן תא הכפפות. החומרים שהוכנו בפרוטוקול זה שמשו מחייב מחקרים של 1,2-azaborines במערכת מודל ביולוגית: מוטציות ליזוזים החלל-bearingT4.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9%	Sigma Aldrich	34865
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free	Sigma Aldrich	309966
Methylene chloride  (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS)	Fisher	D37-20
Toluene	Fisher	T290-4
Pentane, HPLC	Fisher	P399-4
Acetonitrile	Fisher	A21-4
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	208027	Pyrophoric
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd	Strem	46-1900
1.0 M Boron trichloride solution in hexane	Sigma Aldrich	211249	Highly toxic/Pyrophoric
Triethylamine, ≥99.5%	Sigma Aldrich	471283
Grubbs 1st generation catalyst	materia	C823
Acetamide	Sigma Aldrich	A0500
n-Butanol, anhydrous, 99.8%	Sigma Aldrich	281549
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane	Sigma Aldrich	561452	Highly toxic/ Pyrophoric
HCl solution, 2.0 M in Et2O	Sigma Aldrich	455180
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99%	Sigma Aldrich	277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™)	ATCC	31343
T4 lysozyme WT* (L99A)	Addgene	18476
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D)	Addgene	18477
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A0166
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Invitrogen	AM9464
Sodium phosphate monobasic anhydrous	Fisher	BP329
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher	BP332
Sodium chloride	Fisher	S642212
Ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher	BP118
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M4880	Corrosive
Thermo scientific pierce DNaseI	Fisher	PI-90083
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media	Fisher	45-002-931
Tris-base	Fisher	BP152-500
Sodium azide	TCI	S0489	Highly toxic
2-Mercaptoethanol	Fisher	ICN806443
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators	Fisher	14-558-501
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
2-Hydroxyethyl disulfide	Sigma Aldrich	380474
N-paratone	Hampton Research	HR2-643
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO	Fisher	08-667E
CryoLoop	Hampton Research		cryogenic tubing shaped into a loop
CryoTong	Thermo Fisher		cryogenic tong
Coot			Electron density images are generated from the software