Introduction
Boro-azoto contendo heterociclos (ou seja, 1,2-azaborines) têm atraído recentemente a atenção significativa como is�teros de arenes. Este isosterism pode levar a diversificação dos motivos estruturais existentes para expandir o espaço químico 2, 3, 4. Azaborines ter utilidade potencial para aplicação na investigação biomédica 5, 6, 7, 8, especialmente na área da química medicinal, em que os químicos realizar a síntese de bibliotecas de moléculas estruturalmente e funcionalmente relevantes. Significativamente, no entanto, embora existam inúmeras vias sintéticas bem desenvolvidos para moléculas contendo areno disponíveis, apenas um número limitado de métodos para a síntese de azaborines foram relatados 9, 10, 11, 12, 13. Isto é principalmente devido a um número limitado de opções para a fonte de boro e do ar e da natureza sensível à humidade da molécula na fase inicial da sequência sintética.
Na primeira parte deste artigo, iremos descrever uma síntese escala multi-grama de N -TBS- B Cl-1,2-azaborine (3) utilizando técnicas livre de ar padrão. Este composto serve como um intermediário versátil que pode ser adicionalmente funcionalizado para moléculas estruturalmente mais complexo 14, 15. A partir de 3, será descrita a síntese e purificação de N -H- B -etil-1,2-azaborine (5) para utilização em estudos de ligação de proteína. Devido à volatilidade de 5, o seu isolamento eficiente requer um controlo preciso da temperatura de reacção, tempo, e distilação condições.
Na segunda parte, os protocolos para a expressão da proteína e o isolamento de mutantes de T4 lisozima (L99A e L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 irá ser apresentada, seguido por cristalização de proteínas e preparação de complexos de cristais de proteína-ligando. Mutantes lisozima T4 e L99A L99A / M102Q foram escolhidos como sistemas modelo biológicos para examinar a capacidade de ligação de hidrogénio de moléculas contendo NH azaborine 17. Usando um protocolo padrão de biologia molecular, a proteína é expressa na estirpe Escherichia coli RR1 e induzidas com isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). purificação de proteínas é realizada utilizando cromatografia em coluna de permuta iónica. cristalização de proteínas é realizada com uma solução altamente concentrada de proteína purificado (> 95% de pureza por electroforese em gel) usando a suspensãosoltar método de difusão de vapor. Devido à sensibilidade de ligandos deste estudo a oxigénio, os complexos proteína-ligando são preparados sob condições isentas de ar.
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Protocol
NOTA: Todas as manipulações oxigênio e sensível à humidade foram realizadas sob uma atmosfera inerte (N2), utilizando tanto técnicas livre de ar padrão ou uma caixa de luvas. THF (tetra-hidrofurano), Et2O (éter dietílico), CH 2 Cl 2 (diclorometano), tolueno, pentano e foram purificados por passagem através de uma coluna de alumina neutra, sob árgon. O acetonitrilo foi seca sobre CaH 2 (de hidreto de cálcio) e destilou-se sob atmosfera de azoto antes de ser utilizado. Pd / C (paládio sobre carbono) foi aquecida sob alto vácuo a 100 ° C durante 12 h antes da utilização. gel de sílica (230-400 mesh) foi seco durante 12 h a 180 ° C sob alto vácuo. A cromatografia flash foi realizada com este gel de sílica, sob uma atmosfera inerte. Todos os outros produtos químicos e solventes foram adquiridos e utilizados como recebidos.
NOTA: Cuidado, consulte todas as fichas de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Muitos dos produtos químicos utilizados na síntese de umre altamente tóxico e cancerígeno.
1. Preparação de 1,2-Azaborines
NOTA: Os dados de caracterização de todos os compostos deste estudo foram relatados 12, 13, 16.
Figura 1: Esquema de síntese de 1,2-azaborines. Os protocolos detalhados para a síntese de cada composto (1-5) encontram-se descritos na secção protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Preparação de N -allyl- N -TBS- B cloreto de alil aducto (1)
- Numa caixa de luvas, medir 6,70 g (50,0 mmol) triallylboraNE 22 para um 24/40 L um balão de fundo redondo seco na estufa equipado com uma barra de agitação e adicionar 250 mL de diclorometano. Fecha-se o frasco com um septo de borracha. Do lado de fora da caixa, arrefece-se a solução para -78 ° C sob uma atmosfera de azoto sobre um colector de gás de vácuo.
- Adicionar 100 mL de solução 1,00 M de tricloreto de boro (100 mmol) em hexano à solução triallylborane a -78 ° C por meio de transferência de uma cânula. Deixe a mistura de reacção agitar a esta temperatura durante 4 h.
NOTA: Cuidado, tricloreto de boro é altamente reativo com água. - Em um balão de 100 mL separado, medir 25,7 g N - (t-butildimetilsilil) - N -allylamine (150 mmol) e adicionar 20,0 mL de diclorometano. Ao balão reaccional de 1 L, adicionar esta solução através de transferência de uma cânula mantendo a temperatura da reacção a -78 ° C.
- Adicionar 21,0 ml de trietilamina (150 mmol) à mistura reaccional. Manter a agitação sob um fluxo positivo de azoto e permitir que ele se aquecer gradualmente a rodurante a noite a temperatura om.
- Após 18 h de agitação, a remoção de aproximadamente metade do solvente por meio de um colector de gás sob vácuo, utilizando alto vácuo (300-500 mTorr), com uma armadilha de azoto líquido.
- Aqui o balão de reacção para uma caixa de luvas e filtra-se o sal branco que se formou na mistura de reacção através de uma frita de porosidade média, seco no forno equipado com um adaptador de vácuo e uma 24/40 mL balão de fundo redondo de 500 24/40 com uma agitação Barra. Use diclorometano para transferir todos os materiais restantes.
- Remover todos os produtos voláteis restantes do filtrado fora da caixa através de um colector de gás de vácuo com vácuo elevado.
- Numa caixa de luvas, transferir a mistura de reacção concentrou-se em uma seco em forno, 14/20 frasco de 100 ml de fundo redondo com uma barra de agitação para se preparar para destilação. Tapar o frasco com um septo.
- Sob um fluxo de azoto, abrir rapidamente o septo e adicionar 200 mg de hidreto de cálcio como um agente de secagem.
- Configurar o aparelho de destilação pela montagem de um forno-secou-se 14/20 cabeça de destilação ligado com um termómetro, um lado com um 14/20 frasco de 50 ml de armazenamento isento de ar, que recebe e o outro lado com o balão de 100 mL contendo o produto em bruto. Equipar a cabeça de destilação com água gelada. (Utilize graxa para todas as articulações do aparelho de destilação.)
NOTA: o produto começa a destilar, quando a temperatura do vapor atingir 60 ° C a 300 mTorr. - Continuar a recolher o produto, aumentando a temperatura do banho de óleo até que a cabeça de destilação termómetro lê 75 ° C.
NOTA: o produto é um líquido incolor transparente. - Pare destilação por remoção da fonte de calor e arrefece-se a aparelhos para a temperatura ambiente antes do armazenamento. Ao arrefecer, pressurizar o aparelho com azoto e firmemente fechar a válvula macho no frasco de armazenamento livre de ar. Armazene o produto isolado em um freezer porta-luvas.
NOTA: O rendimento pode variar de 65% a 84%.
- Preparação de N B Cl produto fechou-ring (2)
- Numa caixa de luvas, medir 56,0 g N -allyl- N -TBS- B-alilo aduto de cloreto de (1) (217 mmol) em um 24/40 1 L balão de fundo redondo, seco no forno com uma barra de agitação e adicionar 500 tolueno mL.
- Medir 1,79 g Grubbs 1 catalisador geração st (2,17 mmol).
- Adicionar o catalisador, em porções, à solução em agitação de 1, à temperatura ambiente numa caixa de luvas. Purgar a caixa durante a adição para remover o gás de etileno formado a partir da reacção.
NOTA: a reacção está normalmente completa dentro de 30 min, da cessação da evolução de gás. Como outro indicador de conclusão, a cor da reação terá mudado completamente de sua inicial roxo ao marrom. Neste ponto, o produto pode ser isolado por meio de destilação no vácuo; veja referência 12 para obter detalhes. Neste protocolo, é descrito um one-pot, processo de dois passos para a síntese directa de 3. - Preparação de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
- Para a solução de reacção do produto de anel fechado (2) em tolueno, adicionar 14,0 g de paládio sobre carbono (10% em peso de Pd, 13,2 mmol).
- Retirar o balão da caixa e ajustá-lo com um condensador de refluxo 24/40 seco no forno, que foi purgado com azoto e equipado com água gelada.
- Aquece-se a reacção utilizando um banho de óleo a um refluxo vigoroso a 135 ° C enquanto se agitava.
- Depois de se manter ao refluxo durante 16 h, arrefece-se a reacção por remoção do balão do banho de óleo. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, retirar uma aliquota mL a partir da mistura reaccional utilizando uma seringa equipada com uma agulha de fecho Luer seco no forno 0,5. Transferir o mL alíquota de 0,5 a um tubo de RMN de parafuso-top para analisar através de 11 B RMN 12.
NOTA: O pico do produto desejado aparecer em ca. 35,5 ppm 12, enquanto que o mater começandopico ial aparece na ca. 42,9 ppm 12. Normalmente, neste momento 11 B RMN indica que a reacção está incompleta, com um menor pico de material de partida restante. - Se a reacção estiver incompleta, trazer o balão de reacção para uma caixa de luvas e adicione um adicional 3,00 g de paládio sobre carbono (10% em peso de Pd, 2,82 mmol).
- Resubject a reacção até ao refluxo condições como descrito em 1.3.2 e 1.3.3.
- Após um adicional de 24 h em refluxo, analisar uma outra alíquota da reacção por RMN 11 B. Neste ponto, a reacção deve estar completa.
- Transferir o frasco da reacção para a caixa de luva e passar a mistura de reacção através de uma coluna de cromatografia flash descartável embalado com toalhetes de papel. Recolhe-se o filtrado por meio de lavagem com 50,0 ml de tolueno.
- Remove todos os voláteis do filtrado fora da caixa sobre um colector de gás de vácuo equipado com vácuo elevado.
NOTA: A remoção dos produtos voláteis pode levar 40 minutos tO 90 min, dependendo da pressão de vácuo. Quando o indicador de vácuo lê a pressão máxima, que indica que a remoção do solvente é completa. Embora a remoção de solvente, certifique-se de que o banho de água sob o balão permanece à temperatura ambiente durante a dissipação de calor. - Numa caixa de luvas, transferir a mistura de reacção concentrou-se em uma seco em forno, 24/40 balão de 250 ml de fundo redondo com uma barra de agitação. Tapar o frasco com um septo.
- remover rapidamente o septo e adicionar 200 mg de hidreto de cálcio como um agente de secagem.
- Configurar o aparelho de destilação pela montagem de um 24/40 cabeça de destilação seca em estufa anexado com um termómetro, um lado com um 24/40 100 mL frasco de armazenamento livre de ar recebendo e do outro lado com o frasco de 100 ml contendo produto bruto. Equipar a cabeça de destilação com água gelada. Use graxa para todas as articulações do aparelho de destilação.
NOTA: o produto começa a destilar-se quando a temperatura do vapor atingir 65 a 70 ° C a 1000 mTorr com um óleotemperatura do banho entre 90-100 ° C. O produto é um líquido incolor transparente. - Pare destilação por remoção da fonte de calor e arrefece-se a aparelhos para a temperatura ambiente antes do armazenamento. Ao arrefecer, pressurizar o aparelho com azoto e firmemente fechar a válvula macho no frasco de armazenamento livre de ar. Armazenar o produto isolado num congelador caixa de luvas a -30 ° C.
NOTA: O rendimento para o um-vaso, o procedimento de dois passos é de 52%.
Figura 2: 11 B espectros de RMN para a formação de monitorização de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). A) N -Allyl- N-TBS-B-alil cloreto de aducto (1), o material para o anel de metátese de fecho inicial. B) Oxidação após 16 h. (Produto de anel fechado que não reagiu N -TBS- B Cl (2) e o produto isomerizado B -vinil de anel fechado (2 '), juntamente com N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine (3) são mostrados.) C) A oxidação após mais 24 h. D) produto isolado (3), após purificação por destilação sob vácuo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.- Preparação de N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
- Numa caixa de luvas, medir 4,00 g N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) num balão mL, seco no forno 100 de fundo redondo com uma barra de agitação e adicionar 35 mL de acetonitrilo. Medir acetamida 1,14 g (19,3 mmol) e transferir para o frasco da reacção. Fecha-se o frasco com um septo de borracha.
- Retirar o frasco da reacção a partir da caixa e se encaixam com um OVen-seco 24/40 condensador de refluxo que foi purgado com azoto e equipado com água gelada.
- Aquecer a reacção a refluxo a 85 ° C num banho de óleo com agitação.
- Após 3 h em refluxo, arrefece-se a reacção por remoção do balão do banho de óleo. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, remover o solvente em um tubo de distribuição de gás de vácuo equipado com vácuo elevado.
- Após a remoção dos voláteis sob vácuo, redissolver o resíduo de reacção em 15,0 mL de THF. A esta solução adicionar 3,21 mL de n-butanol (35,1 mmol).
- Agita-se a reacção à temperatura ambiente durante 1 h.
- Remover o solvente num colector de gás de vácuo equipado com vácuo elevado, para se obter o produto em bruto.
- Numa caixa de luvas, isolar o produto através de cromatografia em coluna de gel de sílica, utilizando uma mistura de pentano e éter dietílico (5: 1) como eluente. Remover os voláteis a partir das fracções contendo o produto, utilizando um colector de gás de vácuo equipado com vácuo elevado, para se obter o produto puro comoforma de um sólido branco.
NOTA: O rendimento pode variar de 82% a 87%.
- Preparação de N -H- B -etil-1,2-azaborine (5)
- Numa caixa de luvas, medir 1,00 g N- H -B- Obu-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) num frasco de 100 ml de fundo redondo, seco no forno com uma barra de agitação e adicionar 25 mL de Et 2 O. selo do frasco com um septo de borracha e colocar sob N 2 em um colector de gás de vácuo.
- Em um balão de 100 ml de fundo redondo, seco no forno separado, adicionar 26,5 mL de uma solução de etil-lítio (0,5 M em benzeno / ciclo-hexano, 13,2 mmol) sob atmosfera de azoto. Remover a mistura do solvente (benzeno / ciclo-hexano) a partir do reagente de etil-lítio para evitar problemas com o isolamento do produto desejado azaborine. Redissolve-se o etil-lítio sólido em 13,0 ml de Et 2 O.
NOTA: Atenção: reagentes organolítio são pyrophoric (inflamável em contacto com o ar ou água). O produto desejado (5 - Arrefece-se o balão de reacção que contém de 4 a -30 ° C com um banho de arrefecimento.
- Adicionar a solução de etil-lítio ao frasco de reacção por meio de transferência de uma cânula a -30 ° C. Manter agitação a esta temperatura durante 1 h e permitir que a aquecer lentamente até à temperatura ambiente.
- Monitorizar a reacção por 11 B RMN. (O pico intermediário desejado aparecer a cerca de 39,8 ppm).
- Após a conclusão da reacção, arrefece-se a reacção a -30 ° C e adicionar 6,62 mL de uma solução de HCl (2,0 M em Et2O, 13,2 mmol). Agita-se a reacção durante 1 h, enquanto que permitindo-a aquecer lentamente até à temperatura ambiente.
- Remover o solvente num colector de gás de vácuo equipado com baixo vácuo (20-25 torr) para se obter a mistura de produto em bruto.
- Numa caixa de luvas,isolar o produto através de cromatografia em coluna de gel de sílica, utilizando 2-metilbutano como eluente. Remover o volátil para um colector de gás de vácuo equipado com um vácuo atenuada para se obter o produto puro como um líquido incolor.
NOTA: O rendimento é de 56%.
2. Proteína Preparação e cristalização de lisozima T4 Mutantes
- Protein Expression and Purification
- Cultivar células E. coli RR1 transformadas com os plasmídeos subclonados (L99A ou L99A / M102Q) meio suplementado com 40,0 mg de ampicilina a 37 ° C durante 12 h, 17, 20 em 200 ml de LB (caldo de lisogenia).
NOTA: A composição do meio LB é 12 g de triptona, 5 g de extracto de levedura, cloreto de sódio a 10 g, e 1 g de glucose por 1 LH 2 O. - Inocular 4,00 L meio LB (suplementado com ampicilina 800 mg) com 160 mL da cultura durante a noite e incubar a 37 ° C a 240 rpm com um filterefornecimento de ar d.
- Quando a densidade óptica atingir 0,7 a 600 nm, arrefece-se a cultura bacteriana até à temperatura ambiente, retirando-o da incubadora.
- Medir 695 mg de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (concentração final de 0,7 mM) num tubo de centrifugação cónico e adicionar 4 ml de LB meios para dissolver.
- Adicionar a solução de IPTG à cultura para induzir a expressão da proteína. Incubam-se as culturas a 110 rpm durante 21 h a 25 ° C.
- Centrifugar a cultura a 4412 xg durante 30 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 300 ml de fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,6), NaCl 0,2 M e adicionar 30,0 mL de 0,5 M de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) (pH 8,0). Agita-se a suspensão durante 17 h a 4 ° C.
- Adicionar 30,0 ml de 1,0 M MgCl2 e 0,500 mL de desoxirribonuclease I (ADNase I) à suspensão e agita-se à temperatura ambiente durante 8 h.
- Centrifugar a suspensão de células lisadas a 30913 xg durante 30 min a 4 76; C. Recolher o sobrenadante contendo proteína expressa e descartar o pellet.
- Dialisar o lisado contra fosfato de sódio 20 mM (pH 6,5 para pH 6,3 e L99A para L99A / M102Q) a 4 ° C durante a noite.
- Lavar e equilibrar 20,0 mL de carboximetilo grânulos de permuta iónica com tampão de equilíbrio (Tris 50 mM, EDTA 1 mM (pH 7,3)) em uma coluna. Carregar a solução contendo proteína sobre as pérolas e lava-se a coluna com 100 ml do tampão de equilíbrio. Elui-se a coluna com um gradiente linear de 600 mL de NaCl 300 mM no tampão de equilíbrio.
- Usar um sistema de cromatografia de baixa pressão para a coluna de purificação. Usar uma bomba de taxa de 1 mL / min e recolhem fracções de 10 ml. Recolher as fracções contendo proteína pura.
Nota: Durante a eluição, monitorar a densidade óptica (DO) a 280 nm para verificar a presença da proteína. Determinar a pureza de cada fracção por SDS-PAGE e apenas recolher as fracções mais puras.
- Cultivar células E. coli RR1 transformadas com os plasmídeos subclonados (L99A ou L99A / M102Q) meio suplementado com 40,0 mg de ampicilina a 37 ° C durante 12 h, 17, 20 em 200 ml de LB (caldo de lisogenia).
Figura 3: Os resultados representativos para a purificação de proteínas de T4 lisozima L99A mutante / M102Q. A) cromatograma que mostra a absorvância de UV medido na UA a 280 nm (linha azul) e da condutibilidade em mS / cm (linha vermelha). As fracções 20-23 foram combinadas e a pureza foi determinada por SDS-PAGE. B) 15% de gel SDS-PAGE que mostra a presença de proteína purificada de fracções 20-23 em 18,6 kDa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.- cristalização de proteínas
- Transferir a solução de proteína purificada a um tubo de membrana de diálise (MWCO 12.000 a 14.000). Colocar o tubo de diálise para um copo contendo 4,00 L de fosfato de sódio 100 mM, NaCl 550 mM, 0,02% de NaN3 (pH 6,5 para pH 6,3 e L99A para L99A / M102). Agita-se a solução de 4 L durante a noite a 4 ° C.
- Adicionar 2-mercaptoetanol (concentração final de 5 mM) para a amostra dialisada e concentrar de modo a ~ 40,0 mg / ml utilizando um concentrador centrífugo (10.000 MWCO). Determinar a concentração de proteína através da medição da absorção a 280 nm. Remover qualquer precipitado por fiação antes da cristalização.
- Use o método de gota suspensa de vapor de difusão para cristalização de proteínas. Misture 5,00 mL da solução concentrada de proteína com 5,00 mL da solução de reservatório (fosfato 2,0-2,2 M de sódio / potássio, pH 6,7-7,1, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mM de dissulfureto de 2-hidroxietilo) sobre uma lâmina de vidro de cobertura siliconizada.
- Equilibrar a gota mistura contra 1,00 mL da solução de reservatório, colocando a lâmina de cobertura de cabeça para baixo na parte superior do reservatório de solução de cada cavidade que continha. Use graxa para selar firmemente cada poço com o slide. Defina-se várias condições utilizando uma placa de 24 poços com solução reservatório mencionado no ponto 2.2.3.Armazenar a placa a 4 ° C durante o crescimento do cristal.
NOTA: Os cristais crescem normalmente em 1-2 semanas, no tampão de equilíbrio nas na corrediça de cobertura. precipitação imediata durante a mistura solução de proteína com a solução reservatório no passo 2.2.3 indica falha de cristalização.
Figura 4: imagem representativa de cristais de T4 lisozima L99A mutante antes de complexação com ligantes. Os cristais são no licor mãe (de sódio 2,1 M / fosfato de potássio, pH 6,9, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mM de dissulfureto de 2-hidroxietilo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.- preparação de complexo
- Escolha os cristais utilizando um tubo criogénico em forma em um loop (veja Lista de Materiais) ecolocá-los em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Adicionar 50.0 ul de licor mãe para o tubo para evitar a secura e preservar os cristais.
NOTA: a seleção de cristal único é auxiliado por meio de um microscópio. - Transferir o tubo contendo cristais em uma caixa de luvas. Tome 5,00 mL do ligando azaborine (5) e coloque dentro do snap-cap do tubo. Cap e armazenar o tubo no frigorífico (4 ° C) dentro da caixa de luva para 2-7 dias para o equilíbrio por difusão de vapor.
NOTA: As propriedades físicas (elevada volatilidade e solubilidade em solução aquosa) do ligando azaborine (5) permite que a complexação com os cristais de proteína pré-formadas através do método de difusão de vapor. - Transferir os cristais utilizando um tubo criogénico em forma em forma de laço a uma lâmina de vidro contendo uma gota de N-paratone antes do Flash-congelação em azoto líquido. Escolha o cristal protegido com N-paratone e rapidamente flash-freeze mergulhando o cristal sobrelacete num Dewar contendo azoto líquido. Monte o cristal em loop usando um tong criogênico.
- Recolher conjuntos de dados de um único cristal usando radiação síncrotron. Realizar a substituição molecular utilizando estruturas publicados 20, 24; verificar a existência de ligante no interior do sítio de ligação da proteína por um blob un-modelada de densidade de elétrons.
- Escolha os cristais utilizando um tubo criogénico em forma em um loop (veja Lista de Materiais) ecolocá-los em um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Adicionar 50.0 ul de licor mãe para o tubo para evitar a secura e preservar os cristais.
Figura 5: modelos atômicos do T4 lisozima mutante L99A bolso de ligação com a densidade de elétrons. A) cavidade L99A com um blob densidade de elétrons-modelado un no sítio de ligação. B) L99A cavidade com o ligando azaborine modelada 5 em dois confórmeros alternativos. Por favor click aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
A via de síntese para 1,2-esquemática azaborines é mostrado na Figura 1. Isto aplica-se o protocolo para a síntese de cinco moléculas de boro-azoto contendo diferentes. A Figura 2 representa espectros de RMN de 11 B medida no decurso do passo 1.3 para monitorizar a formação do produto desejado (3). Purificação de proteínas foi realizada por cromatografia usando o sistema de baixa pressão e um cromatograma representativo é mostrado na Figura 3. A pureza das fracções recolhidas foi determinada por SDS-PAGE. Cristais de T4 lisozima mutante L99A estão representados na Figura 4. Figura 5 mostra a cavidade de ligação L99A com densidade de elétrons-modelado un e na cavidade de ligação após refinamento com o ligante 5 vinculado.
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Discussion
Na primeira parte deste protocolo, descrevemos uma síntese modificada de 1,2-azaborines baseados em métodos previamente relatados 12, 13. Triallylborane 22 foi utilizado como um substituto para as rotas usando allyltriphenyl estanho ou de potássio allyltrifluoroborate para preparar N N -allyl- -TBS- B -alil aduto de cloreto de (1). Este método permite uma abordagem mais átomos de-econômica e ambientalmente amigável. Para a síntese de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3), foi empregue um de um só recipiente, a sequência de dois passos (metátese de fecho de anel seguida por oxidação), que resultou num rendimento mais elevado do que o isolado anterior método que envolve o isolamento do intermediário (2) (52% versus 29% em dois passos). (No entanto, dependendo da pureza do produto de adição (1), o isolamento do produto de anel fechado antes do passo de oxidaçãopode ser necessário usando destilação sob vácuo. Neste caso, usando diclorometano como solvente em vez do tolueno reduz o tempo para a remoção de compostos voláteis antes da destilação.) O controlo 11 B RMN (Figura 2) durante a etapa de oxidação também benefícios na redução nas quantidades totais de Pd / C utilizados no presente reacção (7 mol% vs 15% molar).
Síntese de N -H- B -etil-1,2-azaborine (5) foi realizada em dois passos a partir de 4, utilizando etil-lítio em vez da sequência de passos múltiplos anteriormente relatado que 16 necessário o uso de um complexo de crómio. O isolamento necessário um controlo preciso da temperatura e manipulação a vácuo atenuada devido à volatilidade do produto. As técnicas apresentadas no presente protocolo pode também ser aplicado para a purificação de outros compostos voláteis.
Na segunda parte, demonstramos a purificação de proteínas e complexação de cristalde T4 lisozima mutantes L99A e L99A / M102Q. A expressão de proteína padrão em E. coli estirpe RR1 e indução utilizando IPTG, seguido de lise celular química isolamento proporcionou da proteína desejada. Aconselha-se a executar SDS-PAGE após a expressão da proteína e lise celular para confirmar o sucesso de cada etapa ou identificar o processo falhou. Para a lisozima T4 L99A, a proteína expressa pode ser encontrado tanto no sobrenadante e pelete, devido à sua actividade para lisar células bacterianas. Neste caso, a proteína no sobrenadante pode ser dialisado contra o tampão de fosfato de sódio 20 mM e combinados com o lisado proveniente de lise celular por purificação em coluna. condições de indução pode ser ajustada para uma temperatura mais elevada e menor tempo (de 21 h a 25 ° C a 2-3 h a 37 ° C). A lise celular pode também ser realizada usando sonicação com um banho de gelo para evitar o sobreaquecimento. Carboximetil coluna de permuta de iões com um gradiente linear de NaCl 300 mM foi utilizado para a purificação de proteínas. Apenas> 95% puro (baseado em Sfrações protéicas DS-PAGE) foram coletadas e usadas na cristalização de proteínas.
Antes de se concentrar a solução de proteína, a adição de 2-mercaptoetanol (concentração final de 5 mM) (passo 2.2.2) para a proteína dialisada foi necessário para evitar a sua precipitação espontânea, especialmente para a proteína L99A / M102Q que tende a precipitar facilmente a alta concentração. Como complexação de proteínas com 5 exigida uma atmosfera livre de ar, o complexo proteína-ligando foi preparada numa caixa de luvas. Os materiais preparados neste protocolo foram usadas em estudos de 1,2-azaborines ligação num sistema de modelo biológico: mutantes lisozima-bearingT4 cavidade.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free | Sigma Aldrich | 309966 | |
| Methylene chloride (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) | Fisher | D37-20 | |
| Toluene | Fisher | T290-4 | |
| Pentane, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
| Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophoric |
| Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M Boron trichloride solution in hexane | Sigma Aldrich | 211249 | Highly toxic/Pyrophoric |
| Triethylamine, ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st generation catalyst | materia | C823 | |
| Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane | Sigma Aldrich | 561452 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| HCl solution, 2.0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher | BP329 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher | BP332 | |
| Sodium chloride | Fisher | S642212 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher | BP118 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosive |
| Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Sodium azide | TCI | S0489 | Highly toxic |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators | Fisher | 14-558-501 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hydroxyethyl disulfide | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | cryogenic tubing shaped into a loop | |
| CryoTong | Thermo Fisher | cryogenic tong | |
| Coot | Electron density images are generated from the software |
References
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