Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

doi: 10.3791/55157 Published: January 19, 2017

Abstract

يحدث تكرار الجينوم خلال المرحلة S من دورة الخلية في عملية عالية التنظيم الذي يضمن الإخلاص من الازدواجية الحمض النووي. يتم نسخ كل منطقة الجينومية في وقت مميز خلال المرحلة S من خلال تفعيل المتزامن من أصول متعددة من النسخ المتماثل. الوقت من التكرار (المرجعية) يرتبط مع العديد من الميزات الجينومية وجينية ويرتبط معدلات الطفرات والسرطان. فهم وجهة النظر الجيني الكامل لبرنامج النسخ المتماثل في الصحة والمرض هو هدف مستقبل كبير والتحدي.

توضح هذه المقالة بالتفصيل "نسخ الرقم نسبة S / G1 لرسم خرائط الجينوم الوقت من النسخ المتماثل" طريقة (وتسمى هنا: لجنة المصالحة الوطنية-TOR)، مقاربة بسيطة لرسم خريطة الجينوم واسعة الاختصاصات من خلايا الثدييات. وتستند هذه الطريقة على أرقام نسخ مختلفة بين الخلايا مرحلة S وخلايا المرحلة G1. يتم تنفيذ طريقة CNR-الاختصاصات في 6 خطوات: 1. إعداد الخلايا وتلطيخ مع يوديد propidium (PI)؛ 2. سورتينغ G1 والخلايا مرحلة S باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS)؛ تنقية 3. الحمض النووي. 4. صوتنة. 5. إعداد مكتبة والتسلسل. و6. تحليل بيوينفورمتيك. طريقة CNR-اختصاصات هو نهج سريع و سهل أن يؤدي إلى خرائط مفصلة تكرارها.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تكرار الحمض النووي الثدييات غير المنظم بإحكام لضمان تكرار الدقيق لكل كروموسوم بالضبط مرة واحدة خلال دورة الخلية. يحدث النسخ المتماثل وفقا لترتيب منظم للغاية - متعددة المناطق الجينومية كبيرة (~ ميجا بايت) تكرار في بداية مرحلة S (تكرار في وقت مبكر المجالات) في حين أن مناطق الجينوم أخرى تكرار لاحقا في (المجالات منتصف وأواخر تكرار) منتصف أو المرحلة S أواخر 1. معظم الجينوم يعيد في نفس الوقت في جميع الأنسجة (المجالات المرجعية التأسيسية)، في حين أن 30٪ - 50٪ من الجينوم، والتغيرات اختصاصاتها بين الأنسجة خلال التمايز 3 و 4 و إلى حد أقل أيضا خلال السرطان تحول 5 . وعلاوة على ذلك، بعض المناطق الجينومية تكرار بشكل غير متزامن وهي أن هناك فرقافي الاختصاصات بين الاليلين.

اختصاصات يرتبط مع العديد من الميزات الجينومية وepigenomic بما في ذلك مستويات النسخ، والمحتوى GC، دولة لونين، كثافة الجينات، الخ 1 و 9. ويرتبط الاختصاصات أيضا مع معدلات الطفرة وأنواع 10، 11، وبالتالي لا يثير الدهشة، وترتبط اضطرابات من برنامج النسخ المتماثل إلى السرطان 12 و 13. العلاقة السببية بين اختصاصات وهيكل لونين ليست مفهومة حتى الآن. فمن الممكن أن ونين مفتوحة يسهل تكرارها في وقت مبكر. ومع ذلك، يشير نموذج بديل لونين يتم تجميعها أثناء النسخ المتماثل والمنظمين لونين مختلفة موجودة في بداية ونهاية المرحلة S الرصاص لتباين تغليف المبكرة والمتأخرة المناطق تكرار 14 11.

مضان في الموقع التهجين (FISH) هو الأسلوب الرئيسي لقياس الاختصاصات في مواضع الفردية. يتم تنفيذ ذلك ببساطة عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا المرحلة S الذي يحمل إشارات سمكة واحدة مقابل نسبة من الحلل لإعطاء أليل 15 و 16. طريقة بديلة، ويتألف من نبض وصفها الحمض النووي مع BrdU، فرز الخلايا وفقا لمحتوى الحمض النووي لنقطة زمنية متعددة على طول S، immunoprecipitating الحمض النووي الذي يحتوي BrdU، والتحقق من وفرة من الحمض النووي عجلت مع QPCR 17.

رسم الخرائط المرجعية الجيني يمكن أن يتحقق من خلال طريقتين. الطريقة الأولى هي نسخة الجيني الأسلوب القائم BrdU-IP المذكورة أعلاه، والتي الكمي لكميةمن يتم الحمض النووي عجلت في كل جزء في وقت واحد لكامل الجينوم من خلال التهجين لميكروأرس أو التسلسل عميق. الطريقة الثانية، لجنة المصالحة الوطنية-الاختصاصات، يقوم على قياس عدد نسخة من كل منطقة الجينوم من الخلايا مرحلة S وتطبيع من محتوى الحمض النووي في الخلايا G1. في هذه الطريقة، يتم فرز الخلايا عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية في حالة عدم تكرار (المرحلة G1) وتكرار (المرحلة S) مجموعات (الشكل 1). الخلايا في G1 لها نفس عدد النسخ في جميع المناطق الجينومية، وبالتالي ينبغي أن يكون محتوى الحمض النووي نفسه. من ناحية أخرى، فإن عدد نسخ الحمض النووي في S يعتمد على المرجعية، منذ خضعت المناطق تكرار مبكرة تكرارها في معظم الخلايا وبالتالي تضاعف محتوى الحمض النووي، في حين لم تكرارها المناطق تكرار في وقت متأخر بعد في معظم الخلايا، وبالتالي سوف محتوى الحمض النووي تكون مماثلة لتلك الخلايا G1. وبالتالي S إلى نسبة G1 من محتوى الحمض النووي يدل على الاختصاصات. يتم قياس كمية الحمض النووي لكل منطقة الجينومية إما عن طريق التهجين لميكروأرس أو التسلسل عميق 2 و 8. وستتم مناقشة مزايا وطريقة CNR-الاختصاصات.

وتصف هذه الورقة طريقة جنة المصالحة الوطنية، اختصاصات لرسم الخرائط المرجعية الجيني كما هو موضح في الشكل (2). وتناقش الورقة التفاصيل الدقيقة للعملية برمتها من جمع الخلايا حتى التحليل الأساسي للنتائج وإنشاء الخرائط المرجعية الجينوم. وقد تم تنفيذ بروتوكول صفها في هذه الورقة بنجاح على مختلف أنواع الخلايا المزروعة في الثقافة. تحسينات في المستقبل من هذا البروتوكول يمكن أن يؤدي إلى تعيين من الاختصاصات في الجسم الحي وفي أنواع الخلايا نادرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: يمكن قياس اختصاصات فقط على النمو، وخلايا غير المتزامنة. وينبغي أن يبدأ الإجراء مع لا يقل عن 1 - 2 × 10 6 خلايا تنمو بسرعة، والذي عادة ما يؤدي الى ~ 1 × 10 5 خلايا في مرحلة S (الخطوة معدل الحد). فمن المستحسن لإجراء كل تجربة باستخدام اثنين أو ثلاثة مكررات. ويمكن الانتهاء من العملية برمتها من لجنة المصالحة الوطنية-الاختصاصات خلال أسبوع واحد - يجب أن تكون مكرسة يومين لجميع الخطوات حتى إعداد المكتبة، وهناك حاجة 1-2 أيام لتسلسل ويوم إضافي ضروري لتحليل البيانات الأولية.

1. مجموعة من الخلايا من الثقافة

ملاحظة: يتم كتابة بروتوكول للخلايا تنمو في الثقافة في 10 سم لوحات (التي تحتوي على ما يقرب من 2-5 × 10 6 خلايا)، ولكن يمكن تعديلها بسهولة لمنصات أخرى.

  1. للخلايا التي كانت تزرع في تعليق، انتقل إلى تثبيت (القسم 2).
  2. لخلايا ملتصقة، نضح ويغسل ررأكل مع 3 مل PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+.
  3. تجاهل برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 1 مل التجاري التربسين- EDTA حتى فصل الخلايا.
    ملاحظة: مدة العلاج التربسين يجب تعديلها لكل نوع من الخلايا.
  4. إضافة 3 وسائل الإعلام ثقافة مل لتحييد التربسين وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية أو أنبوب البوليسترين 5 مل. الحفاظ على الجليد.

2. التثبيت

ملاحظة: للحصول على هذا الجزء، يجب أن تتم جميع الخطوات في 4 درجات مئوية.

  1. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  2. نضح ويغسل خلايا مرتين مع 1 مل PBS الباردة.
  3. Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر (إجمالي) الباردة برنامج تلفزيوني.
  4. في حين vortexing لبلطف الأنبوب، إضافة ببطء قطرة قطرة 800 ميكرولتر من -20 درجة مئوية الإيثانول بنسبة 100٪. وهذا يؤدي إلى تركيز الإيثانول النهائي من 70-80٪.
    ملاحظة: يوصى الايثانول نقاء عالية في هذه الخطوة.
  5. احتضان الخلايا على الجليد FOص 30 دقيقة.
    ملاحظة: عند يمكن أن تبقى هذه الخلايا مرحلة لبضعة أيام في 4 درجات مئوية أو لبضعة أشهر في -20 درجة مئوية.

3. PI تلطيخ

  1. الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. نضح طاف بعناية وغسل خلايا مرتين مع 1 مل PBS الباردة.
  3. نضح و resuspend كل عينة مع الخليط التالي: 1 مل PBS، 5 ميكرولتر 10 ملغ / مل RNaseA، 50 ميكرولتر 1 ملغ / مل يوديد propidium (PI؛ المزيج القنينة قبل الاستعمال). ضبط تركيز تصل إلى ~ 2 × 10 6 خلية / مل).
    ملاحظة: يحفظ بعيدا عن الضوء - PI غير الحساسة للضوء.
  4. من خلال تصفية 35 ميكرومتر شبكة لأنبوب البوليسترين 5 مل، وعلى مقربة مع بارافيلم.
  5. في احتضان RT في الظلام، ل15-30 دقيقة.
    ملاحظة: الخلايا هي الآن جاهزة للتحليل FACS. إذا لزم الأمر، والخلايا الملون يمكن تخزينها لمدة لا تقل عن 24 ساعة عند 4 درجات مئوية في الظلام.

4. ترتيب

  1. خلايا النوع باستخدام آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية. لناالبريد الليزر 561 نانومتر للتمييز الخلايا استنادا كثافة PI بهم. الليزر الأخرى بالقرب من الإثارة أقصى 535 نانومتر مثل 488 نانومتر أو 532 يمكن استخدام اعتمادا على تكوين الجهاز FACS.
  2. لأفضل النتائج، استخدم أصغر فوهة الموصى بها لحجم خلية معينة (لمعظم الخلايا 85 ميكرون). أولويات وسائط نقاء على العائد. استخدام التدفق البطيء المطرد، وعادة ما يصل إلى 300-500 الأحداث / ثانية، مع الضغط غمد من 45 رطل.
  3. باستخدام النابضة، تميز الخلايا الميتة والحطام التحت خلوية (FCS منخفضة وعالية SSC) من خلال التآمر ضد أمن الدولة FCS. من خلايا قابلة للحياة التمييز الحلل بالتآمر SSC-العرض (W) مقابل SSC-الارتفاع (H) تليها FSC-W مقابل FSC-H مؤامرة وPI- W مقابل PI-H (الحلل سيكون لها نفس H-قيمة ولكن أكبر قيمة W). للحصول على الخلايا واحدة قابلة للتطبيق رسم بياني لكثافة PI-المنطقة (أ) التي تمثل محتوى الحمض النووي للخلايا.
  4. خلايا النوع في G1 و S مراحل، كما هو مبين في الشكل رقم 1. وينبغي أن يكون المحاصرة لS اسعة وتتدخل في G1 و G2 مراحل، في حين G1 النابضة ينبغي أن تكون ضيقة وبعيدة عن S ممكن.

شكل 1
الشكل 1. خلية مرحلة دورة تصميم يعتمد على كثافة PI. الرسم البياني يوضح توزيع محتوى الحمض النووي الخلوي (تقاس PI-المنطقة) من الماوس الجنينية الخلايا الليفية السكان (MEF). يتم استخدام محتوى الحمض النووي لفرز السكان إلى اثنين من السكان الفرعي ط) خلايا G1 (محتوى 2N DNA) والثاني) خلايا مرحلة S (2N - 4N محتوى DNA)، وذلك باستخدام المناطق ملحوظ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: إن الغرض من مجموعة من الخلايا G1 هو لحساب التحيز في كفاءة التسلسل بين مناطق الجينوم مختلفة. تطبيق بديلروتش هو استخدام خلايا اعتقال G1 من نفس نوع من الخلايا. هذا النهج يعطي نتائج أكثر نظافة (لأنه يقلل من تلوث المرحلة S) ولكنه قد يعرض التحيزات الناجمة عن الاختلافات الوراثية بين الخلايا القبض عليه والخلايا قياسها.

  1. الفرز في ظروف البرد وجمع الخلايا التي تم فرزها إلى 1.5 / 2 مل أنابيب. إبقاء الأنابيب على الجليد بعد الفرز.
    ملاحظة: من أجل تحسين استرداد الحمض النووي، فمن الأفضل لاستخدام أنابيب ملزمة منخفضة أو استخدام أنابيب مغلفة 4-5٪ BSA عن 1-3 ساعات في 4 درجات مئوية (18).

5. الحمض النووي تنقية

  1. لكل عينة (G1 وS) تنقية الحمض النووي باستخدام طقم تنقية الحمض النووي.
    ملاحظة: عند استخدام عدة التجارية، أزل مع 400 ميكرولتر شطف العازلة في أنبوب مل 2 لعالية الغلة، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
  2. تحقق تركيز الحمض النووي باستخدام التألق.
    ملاحظة: من 100،000 خلايا الثدييات التي تم جمعها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية، ينبغي للمرء أن يحصل ~ 1 ميكروغرام من الحمض النووي. ار هذه المرحلة الحمض النووي يمكن أن تبقى لبضعة أيام في 4 درجات مئوية أو عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة التخزين الطويل.

6. صوتنة

  1. نقل الحمض النووي في أنبوب مل 1.7 متوافق مع الوقوف المغناطيسي المستخدمة.
  2. التركيز الحمض النووي باستخدام الخرز 2X سبري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وذلك باستخدام الوقوف المغناطيسي، وأزل في شطف العازلة 50 ميكرولتر.
  3. الحمض النووي القص مع ultrasonicator تركيزا على متوسط ​​ذروة الهدف حجم 250 نقطة أساس. استخدام الإعدادات التالية لعينة من الحمض النووي 50 ميكرولتر: 50 ث، 20٪ عامل واجب، 200 دورة في انفجار و 20 درجة مئوية، 120 ق.
  4. تحقق من حجم الحمض النووي المنفصمة من قبل الكهربائي. توزيع حجم الموصى بها هي 200-700 نقطة أساس وبلغت ذروتها في ~ 250 نقطة أساس.
    ملاحظة: عند يمكن أن تظل هذه المرحلة الحمض النووي لبضعة أيام في 4 درجات مئوية أو عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة التخزين الطويل.

7. مكتبة التحضير، وتسلسلها

ملاحظة: العديد من مجموعات إعداد مكتبة وتختلفيجب منصات التسلسل الأنف والحنجرة يعمل بطريقة مشابهة لتلك المستخدمة من قبل الولايات المتحدة والمذكورة في قسم المواد. فعلا في الماضي، تم إنشاؤها الخرائط المرجعية باستخدام طريقة مشابهة جدا مع منصات ميكروأري 2.

  1. إعداد مكتبات باستخدام أي أدوات إعداد مكتبة تجارية.
  2. في نهاية إعداد المكتبة، تحديد حجم استخدام الخرز المغناطيسي لل300-800 نقطة أساس.
  3. بعد إعداد المكتبات، وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام التألق.
  4. قياس حجم الحمض النووي باستخدام الكهربائي.
  5. أداء التسلسل على أي منصة.
    ملاحظة: تسلسل لا يقل عن 10 M يقرأ في العينة الموصى بها. هذا العمق ما يعادل قراءة كل ما يقرب من 300 سنة مضت (ب ~ 3 جيجابايت حجم الجينوم)، وغير كافية لقياس الاختصاصات في القرار 50-100 كيلو بايت. وزيادة عمق سيؤدي إلى انخفاض في حجم النوافذ، وبالتالي تمكين زيادة دقة مع ارتفاع اليقين. يقترن التسلسل النهائي هو ليس من الضروري فييتم جمع هذا البروتوكول منذ معلومات تغطية فقط. مع ذلك، قد يساعد في حل موقع يقرأ التي تحتوي على تسلسل المتكررة.

8. تحليل

ويستند تحليل البيانات على الطريقة المستخدمة من قبل أ. كورين وآخرون: ملاحظة. 19.

  1. بيانات الخريطة تسلسل لجينوم المقابلة باستخدام bowtie2 أو أي قصير اليجنر قراءة موثوق بها. يقرأ تعريف متفاوتة الحجم، متساوية تغطية النوافذ الكروموسومات كما شرائح بمقدار 200 مغطاة يقرأ في جزء G1 والاعتماد المرحلة S في نفس النوافذ.
  2. حساب نسبة S / G1 لكل نافذة. وهذا ينبغي إنشاء مخطط مع تقلبات كبيرة في نسبة S / G1 على طول الجينوم (الشكل 3). ومراقبة جيدة لموثوقية القياسات المرجعية هي لمقارنة هذه الخريطة لنسبة G1 / G1 (من اثنين من القياسات منفصلة من G1) التي ينبغي أن تكون الكثير من تملق.
  3. تطبيع البيانات إلى 0 يعني و1 SD عن طريق طرح من كل الخامسalue متوسط ​​قيمة كل النوافذ (باستثناء كروموسوم X) وتقسيم النتائج والانحراف المعياري للS / G1 من جميع النوافذ. ويتم ذلك من أجل تحويل إلى عشرات ض وتمكين المقارنة بين التجارب المختلفة.
  4. إزالة جميع المناطق الفجوة المذكورة من قبل متصفح الجينوم UCSC وكذلك كل جزء الفجوة بين المتبقية التي تحتوي على أقل من 15 نافذة البيانات.
  5. تمهيد شظايا المتبقية مع شريحة تجانس مكعب عبر وظيفة csaps ماتلاب مع معلمة من 10-16 وأقحم في النقاط المحددة لكل 100 كيلو بايت.
    ملاحظة: يجب تعديل معلمات تمهيد والاستيفاء على أساس عمق البيانات. طرق تنعيم مناسبة أخرى وظائف موجودة ويمكن استخدامها.
  6. بعد التأكد بصريا موثوقية كل تكرار، ودمج جميع يقرأ وحساب قرار الشخصي أعمق عن طريق إجراء نفس العملية المذكورة أعلاه على هذه البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد خريطة الاختصاصات التقليدية في الشكل (3) لالخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS). يوضح هذا الرقم عملية التحليل، إذ أنه يظهر كل من النقاط، التي هي تطبيع S / نسبة G1 للنوافذ الفردية (الخطوة 8.3)، وكذلك الخط الذي ينتج من تجانس مكعب والاستيفاء (الخطوة 8.5).

هذه الخرائط التقاط تنظيم برنامج النسخ المتماثل الذي هو خليط من نوعين من مجالات الاختصاصات: أ) مناطق واسعة (في أمر من megabase) التي تكرار في وقت واحد (الظهور = مناطق المرجعية الثابتة) في وقت مبكر، في منتصف أو أواخر S . وب) المناطق التي تمر بمرحلة انتقالية مؤقتة (TTRs) الذي يغير الشروط المرجعية تدريجيا. وترتبط الظهور لبعضهم البعض عن طريق TTRs ومعا هذين النوعين من منظمة تكرار تغطي الجينوم بأكمله.

وعلى الرغم من الانخفاض النسبي التسلسل ج عجوز (واحد قراءة كل 300 سنة مضت) يستخدم لرسم الخرائط المرجعية والخرائط الناتجة هي قوية جدا. ويبين الشكل 4 استنساخ الخرائط الاختصاصات بين يثلث الخلايا MEF مقارنة يثلث من الماوس خلايا ما قبل-B في نفس المنطقة. المقارنة بين هذه الخرائط تتيح تحديد المناطق مع الفارق الاختصاصات التي تعرف بأنها المناطق التي الاختلافات في الخرائط الاختصاصات بين الأنسجة هي أكبر بكثير من الاختلافات بين مكررات.

الشكل 2
الشكل 2: مخطط البروتوكول. الرسم التخطيطي اصفا الداخلي للطريقة CNR-الاختصاصات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

57 / 55157fig3.jpg "/>
الشكل (3): الممثل الخرائط المرجعية الجينوم. أظهرت هو المرجعية للكروموسوم كامل 1 من خلايا MEF ونظرة فاحصة على منطقة ميغابايت ~ 50. أظهرت هي عشرات Z القيم S / G1 في متفاوتة ويندوز حجم (نقطة) والبيانات ممهدة (خط الصلبة). قيم عالية S / G1 تتوافق مع النسخ في وقت مبكر في حين القيم المنخفضة تتوافق مع أواخر النسخ المتماثل. تشير الأسهم إلى أمثلة من المناطق مستمرة الاختصاصات (الظهور، أحمر) والمناطق التي تمر بمرحلة انتقالية مؤقتة (TTRs، الأخضر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: القدرة على التكاثر من يكرر. (A) ممهدة الاختصاصات من يثلث MEF (الأزرق) مقارنة مع ما قبل-B يثلث (الأحمر) في منطقة ميغابايت 18 على كروموسوم الماوس 1. السهام أورانجنشير إلى أمثلة من المناطق الفارق بين خطوط الخلايا. (ب) خريطة الحرارة من الارتباط سبيرمان بين العينات 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لجنة المصالحة الوطنية-اختصاصات لا يمكن أن يؤديها من حيث المبدأ على أية مجموعة من السكان الخلايا المتكاثرة حقيقية النواة التي يمكن تقسيمها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية لS ومراحل G1 (التي استعرضتها Rhind N. وجيلبرت 20 DM). تم تعديل الطريقة الموصوفة هنا لخلايا الثدييات مع حجم الجينوم من ~ 3 جيجابايت مثل الفأر والإنسان. هناك حاجة لتغييرات صغيرة في بروتوكول لجنة المصالحة الوطنية-الاختصاصات (في إعداد الخلايا وعمق التسلسل)، من أجل تعديله لحقيقيات النوى الأخرى. يجب أن تدفع الانتباه إلى جمع كميات كافية من الخلايا مرحلة S لأنه هو الحد من معدل خطوة. وبالتالي، ينبغي إجراء نظام مراقبة الأصول الميدانية الأولية للدورة الخلية للتأكد من أن التجربة يمكن القيام به، والتحقق من صحة كمية من الخلايا في مرحلة S. للخلايا التي تظهر دورات الخلايا غير النظامية، فمن المستحسن أن prestain الخلايا مع BrdU للكشف عن الخلايا المنقسمة، واتبع بروتوكول الشركة المصنعة مكافحة BrdU حتى الخطوة FACS. وعادة ما تكون ملطخة الخلايا مع 10-20 BrdU ميكرومتر لمدة 30 دقيقة.

6 خلايا) لكل تكرار من أجل الحصول على> 1 × 10 5 خلايا في مرحلة S. هذا المبلغ يجب أن تكون زيادة عند العمل مع الخلايا بطيئة النمو، حيث أن النسبة المئوية للخلايا في مرحلة S أقل، وبالتالي يتعين على المرء أن فرز أكثر من الخلايا من أجل الحصول على كمية كافية من الخلايا في س.

عندما يكون الترتيب الخلايا، فمن المهم لتحقيق أفضل فصل ممكن من الخلايا وفقا لمحتوى الحمض النووي، وبالتالي ينصح معدل تدفق منخفض. من أجل تحقيق أقصى قدر من القرار الزماني، فمن المهم أن جمع الخلايامن مرحلة S بأكملها. ويتحقق ذلك عن طريق النابضة S على أوسع نطاق ممكن (الشكل 1). من ناحية أخرى، ينبغي أن يكون G1 النابضة الضيق (بدءا من ذروة G1 وإلى اليسار، الشكل 1)، وذلك لتجنب كلا من الباطن G1-وأوائل التلوث S-المرحلة.

صوتنة يمكن القيام بها بطرق مختلفة، ولكن من المستحسن استخدام ultrasonicator تركيزا والتي تمكن صوتنة قوية وسهلة دون الحاجة للمعايرة من كل تجربة. ومع ذلك، عندما أولا إنشاء بروتوكول في المختبر، فمن المستحسن لمعايرة المعلمات للحصول على توزيع حجم 200-700 نقطة أساس.

كما هو موضح في المقدمة، هناك طريقتان رئيسيتان لرسم الخرائط المرجعية الجينوم على نطاق - BrdU-IP وCNR-الاختصاصات. كلا الطريقتين تعطي خرائط اختصاصات مماثلة (لا تظهر البيانات) على الرغم من الخلافات بينهما. يقتصر أسلوب CNR-الاختصاصات في نطاق تخصيب اليورانيوم منذ الفرق أقصى betweأون المناطق المبكرة والمتأخرة هي ذات شقين، في حين مع يتحقق BrdU-IP أعلى بكثير تخصيب اليورانيوم منذ المناطق تكرار مبكرة سيحتوي BrdU فقط تقريبا في جزء مبكر. من ناحية أخرى، هو قرار طريقة BrdU-IP محدودة من قبل عدد من الكسور المرحلة S التي تم جمعها. في التطبيق الأكثر شيوعا لها، تتم مقارنة اثنين فقط من الكسور (في وقت مبكر مقابل أواخر S)، مما يؤدي إلى حل وسط من القرار الزماني على ما يرام. طريقة جنة المصالحة الوطنية، المرجعية، ومع ذلك، ويعطي إشارة مستمرة على طول المرحلة S بأكملها. وعلاوة على ذلك، يستند طريقة BrdU-IP على المناعية هطول الأمطار التي تعطي عادة خلفية أعلى بكثير من طريقة CNR-الاختصاصات. ميزة أخرى لطريقة جنة المصالحة الوطنية، المرجعية هي أنه يمكن استخدامها بأثر رجعي لاستخراج المعلومات المرجعية من البيانات تسلسل الثقافات غير المتزامنة كما هو موضح في الآونة الأخيرة 21. وأخيرا، فإن طريقة CNR-اختصاصات هو الأفضل نظرا لبساطته ويرجع ذلك إلى حقيقة أنه يمكن زيادتها إلى أسفل لأنه لا يستند إلى immuعدم هطول الأمطار.

يبقى دور المرجعية في شبكة معقدة من الميزات الجينومية وepigenomic إلى فك شفرتها. السهولة النسبية للطريقة CNR-اختصاصات تسمح للتوسع في البيانات المرجعية القائمة لتشمل العديد من الظروف الطبيعية التي تجربة الخلايا ويجب النظر بدقة والجينوم على نطاق واسع. وهذا يشمل مختلف حالات الإجهاد النسخ المتماثل تنسخ داخلي فضلا عن العديد من التحولات السرطانية. فإن استخدام البيانات SNP وأعلى عمق التسلسل تسمح أيضا قياس اختصاصات كل أليل على حدة. وعلاوة على ذلك، فإن انخفاض إضافي في التكلفة التسلسل تمكين زيادة هذا القرار من الخرائط المرجعية، والتي قد تتسبب في زيادة المساعدات في تسمح بتحديد التغييرات الطفيفة بين الظروف. ويمكن تحقيق التطبيقات المستقبلية الأخرى عن طريق تحسين الطرق الحالية وتطبيق القياس المرجعية على أعداد صغيرة من الخلايا التي ستمكن قياس الاختصاصات في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر الأوريا فاردي للمساعدة في توليد أرقام. وأيد العمل في المجموعة هو من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل (منحة رقم 567/10) والمجلس الأوروبي للبحوث ابتداء غرانت (# 281306).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS BI (Biological Industries) 02-023-1A
Trypsin-EDTA BI (Biological Industries) 03-052-1B
15 mL conical tube Corning 430790
5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap  BD-Falcon 352235
Ethanol Gadot 64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL Sigma R4875
Propidiom iodide 1 mg/mL Sigma P4170
Parafilm Parafilm PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes  Eppendorf 22431021
BSA Sigma A7906
1.7 mL MaxyClear tube  Axygen MCT-175-C
magnetic beads - Agencourt AMPure XP  Beckman Coulter A63881
Ultrasonicator Covaris M-series  -530092
50 µL microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm Covaris 520096
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Invitrogen Q32854
Electrophoresis 2200 Tape station system Agilent D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina NextSeq system Illumina SY-415-1001
Dneasy kit for DNA purification Qiagen 69504
PureProteom Magnetic Stand Millipore LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC DAKO F7210
FACS sorter BD FACSARIA III
FACS software BD FACSDiva v 8.0.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18, (1), 115-125 (2010).
  2. Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6, (7), e1001011 (2010).
  3. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6, (10), (2008).
  4. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25, (8), 1091-1103 (2015).
  5. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22, (10), 1833-1844 (2012).
  6. Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18, (10), 1562-1570 (2008).
  7. Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24, (1), 64-69 (2014).
  8. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10, (5), e1004319 (2014).
  9. McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25, (7), 647-656 (2003).
  10. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  11. Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44, (9), 4222-4232 (2016).
  12. Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
  13. Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
  14. Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, (1), 25-32 (2003).
  15. Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11, (3), 1217-1225 (1992).
  16. Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
  17. Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401, (6756), 929-932 (1999).
  18. Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. (1993).
  19. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91, (6), 1033-1040 (2012).
  20. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (8), a010132 (2013).
  21. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159, (5), 1015-1026 (2014).
تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).More

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter