Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement

doi: 10.3791/55157 Published: January 19, 2017

Abstract

Replikasjon av genomet oppstår under S-fasen av cellesyklusen i en svært regulert prosess som sikrer kvaliteten til DNA-duplisering. Hver genomisk region er kopiert på en klar tidspunkt under S-fasen gjennom samtidig aktivering av flere replikasjons. Tidspunkt for replikering (ToR) korrelerer med mange genomisk og epigenetiske funksjoner og er knyttet til mutasjon priser og kreft. Forstå full genomisk visning av replikeringsprogrammet, i helse og sykdom er en viktig framtidig mål og utfordringer.

Denne artikkelen beskriver i detalj "Kopier Antall Forhold av S / G1 for å kartlegge genomisk Time Replication" metoden (heretter kalt: CNR-ToR), en enkel tilnærming for å kartlegge genomet brede ToR av pattedyrceller. Metoden er basert på kopiantallet forskjellene mellom S-faseceller og G1 faseceller. CNR-ToR metoden utføres i 6 trinn: 1. Utarbeidelse av celler og farging med propidiumjodid (PI); 2. Sorting G1 og S-fase celler ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS); 3. DNA rensing; 4. Ultralyd; 5. Bibliotek forberedelse og sekvensering; og 6. bioinformatiske analyse. CNR-ToR metoden er en rask og enkel metode som gir detaljerte replikering kart.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pattedyr-DNA-replikasjon er tett regulert for å sikre en nøyaktig reproduksjon av hvert kromosom nøyaktig en gang i løpet av cellesyklusen. Replication skjer i henhold til en svært regulert rekkefølge - flere store genomiske regioner (~ Mb) gjenskape i begynnelsen av S-fasen (tidlig replikere domener), mens andre genomiske regioner replikere senere på midten eller slutten av S fase (midtre og sen Replikere domener) 1. Mesteparten av genomet replikerer samtidig i alle vev (konstitutive tor domener), mens 30% - 50% av genomet, skifter ToR mellom vevene 2, under differensiering 3, 4 og i mindre grad også i løpet av kreft transformasjon 5 . Videre kan visse genomiske regioner replikere asynkront 6, 7, 8, det vil si det er en forskjelli ToR mellom de to alleler.

ToR korrelerer med mange genomisk og epigenomic funksjoner, inkludert transkripsjonsnivåer, GC innhold, kromatin staten, genet tetthet, etc. 1, 9. Tor er også assosiert med mutasjon priser og typer 10, 11 og derfor overraskende, er forstyrrelser av replikeringsprogrammet knyttet til kreft 12, 13. Årsakssammenheng mellom ToR og kromatinstruktur er ennå ikke forstått. Det er mulig at åpen kromatin muliggjør tidlig replikering. Imidlertid tyder en alternativ modell som kromatinet er montert under replikering og de ulike kromatin regulatorer stede ved begynnelsen og slutten av S-fasen fører til forskjells pakking av tidlige og sene Replikere regioner 1, 14 11.

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er den viktigste metoden for å måle ToR på individnivå loci. Den er utført ganske enkelt ved å telle hvor mange prosent av S-faseceller som oppviser enkeltfisk signaler sammenlignet med prosentandelen av dubletter for en gitt allele 15, 16. En alternativ fremgangsmåte består av puls merking av DNA med BrdU, sortering celler i henhold til deres DNA-innhold til flere tidspunkter langs S, immunoutfelling DNA inneholdende BrdU, og sjekke overflod av utfelt DNA med qPCR 17.

Genomisk ToR kartlegging kan oppnås på to måter. Den første metoden er en genomisk versjon av BrdU-IP-baserte fremgangsmåten beskrevet ovenfor, i hvilken kvantifisering av mengdenav utfelt DNA i hver fraksjon skjer samtidig for hele genomet gjennom hybridisering til mikromatriser eller ved dyp-sekvensering. Den andre metoden, CNR-Tor er basert på måling kopiantallet av hver genomiske region av S-faseceller og normalisering av DNA-innhold i celler G1. I denne metoden, blir cellene sortert ved hjelp av FACS inn i ikke-reproduserende (G1 fase) og replikere (S fase) grupper (figur 1). Celler i G1 har samme kopiantall i alle genomiske regioner og dermed deres DNA-innhold bør være den samme. På den annen side, DNA kopiantall i S avhenger av Tor siden tidlig Replikere regioner gikk replikasjon i de fleste celler og derfor er deres DNA-innhold er fordoblet, mens sene Replikere regioner som ikke har replikert men i de fleste celler og derfor er deres DNA-innhold vil være lik den som er av G1-celler. Derav S til G1 forholdet mellom DNA-innhold er indikativ for Tor. Mengden av DNA for hver genomisk region blir målt enten ved hybridisering tilmikromatriser eller ved dyp sekvense 2, 8. Fordelene med den CNR-ToR fremgangsmåte vil bli nærmere omtalt.

Dette notatet beskriver CNR-ToR metode for genomisk ToR kartlegging som beskrevet i figur 2. Notatet drøfter de fine detaljene i hele prosessen fra å samle celler til den grunnleggende analyse av resultatene og etableringen av genomiske tor kart. Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen har blitt utført på forskjellige celletyper dyrket i kultur. Fremtidige forbedringer av denne protokollen kan føre til kartlegging av Tor in vivo og i sjeldne celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Merk: ToR kan måles bare på voksende, usynkroniserte celler. Prosedyren bør begynne med minst 1 - 2 x 10 6 hurtigvoksende celler, som vanligvis vil resultere i ~ 1 x 10 5 celler i S-fasen (det hastighetsbegrensende trinn). Det anbefales å gjennomføre hvert forsøk med to eller tre gjentak. Hele prosessen med CNR-ToR kan være ferdig i løpet av en uke - to dager bør være dedikert til alle trinn opp til biblioteket forberedelse, en til to dager er nødvendig for sekvensering og en ekstra dag er nødvendig for den første dataanalyse.

1. Samling av celler fra kultur

MERK: Protokollen er skrevet for celler som vokser i kultur i 10 cm plater (som inneholder ca 2 - 5 x 10 6 celler), men kan enkelt justeres til andre plattformer.

  1. For celler som ble dyrket i suspensjon, fortsett til fiksering (§ 2).
  2. For heftende celler, aspirer og vaske plspiste med 3 ml PBS uten Ca2 + og Mg2 +.
  3. Kast PBS og inkuberes cellene i 5 min ved 37 ° C med 1 ml kommersiell trypsin-EDTA inntil cellene løsner.
    MERK: Varigheten av trypsinbehandling bør justeres for hver celletype.
  4. Tilsett 3 ml kulturmedium for å nøytralisere trypsin og samle cellene i et 15 ml konisk rør eller en 5 ml polystyrenrør. Hold på is.

2. Fiksering

MERK: For denne delen, alle trinn bør gjøres ved 4 ° C.

  1. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  2. Aspirer og vask cellene to ganger med 1 ml kald PBS.
  3. Resuspender celler i 250 pl (total) kald PBS.
  4. Mens forsiktig virvling røret, langsomt tilsett dråpevis 800 ul -20 ° C 100% etanol. Dette fører til en sluttetanolkonsentrasjon på 70 - 80%.
    MERK: Høy renhet etanol anbefales på dette trinnet.
  5. Inkuber cellene på is for 30 min.
    MERK: På dette stadiet celler kan holdes i noen dager ved 4 ° C eller i noen måneder ved -20 ° C.

3. PI Farging

  1. Sentrifuger cellene ved 500 xg i 10 min ved 4 ° C.
  2. Aspirer supernatanten forsiktig og vaske cellene to ganger med 1 ml kald PBS.
  3. Aspirer og resuspender hver prøve med følgende blanding: 1 mL PBS, 5 ul 10 mg / ml RNaseA, 50 pl 1 mg / ml propidiumjodid (PI, bland flasken før bruk). Juster konsentrasjon opp til ~ 2 x 10 6 celler / ml).
    MERK: Oppbevares lys - PI er lysfølsom.
  4. Filtrer gjennom 35 pm sikt til en 5 ml polystyren rør, og tett med Parafilm.
  5. Inkuber ved romtemperatur i mørket, 15 - 30 min.
    MERK: Cellene er nå klar for FACS-analyse. Om nødvendig, kan de fargede cellene bli lagret i minst 24 timer ved 4 ° C i mørket.

4. Sort

  1. Sorter celler ved hjelp av en FACS maskin. Osse den 561 nm laser for å skille celler basert på deres PI intensitet. Andre lasere nær 535 nm eksitasjon maksimale som 488 nm eller 532 kan brukes avhengig av FACS maskinkonfigurasjon.
  2. For optimalt resultat, bruk den minste munnstykket anbefales for bestemt celle størrelse (for de fleste cellene 85 mikrometer). Prioriter renhet moduser enn utbyttet. Bruk en jevn treg flyt, vanligvis opp til 300-500 arrangementer / s, med en kappe trykk på 45 psi.
  3. Ved hjelp av gating, diskriminere døde celler og subcellulære rusk (lav FCS og høy SSC) ved å plotte FCS vs SSC. Fra de levedyktige celler diskriminere dubletter ved plotting av SSC-bredde (W) vs SSC-høyde (H) etterfulgt av en FSC-W vs FSC-H tomt og ved PI- W vs PI-H (dubletter vil ha den samme H-verdien men større W-verdi). For de levedyktige enkeltceller tegne et histogram av PI-området (A) intensitet som representerer DNA-innholdet i cellene.
  4. Sorter celler i G1 og S-faser, som vist i figur 1. Gating for S bør være bred og trenge inn i G1 og G2 faser, mens G1 gating bør være smal og så langt fra S som mulig.

Figur 1
Figur 1. Cellesyklus fase bestemmelse basert på PI intensitet. Histogram som viser fordelingen av det cellulære DNA-innhold (målt ved PI-område) på mus embryo fibroblast (MEF) populasjonen. Den DNA-innhold brukes til å sortere populasjonen i to sub-populasjoner i) G1-celler (2n DNA innhold) og ii) S faseceller (2N - 4n DNA innhold), ved hjelp av merkede områder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

MERK: Formålet med samlingen av G1-celler er å ta hensyn til skjevheter i sekvense effektivitet mellom ulike genomiske regioner. Et alternativ appmort er å bruke G1 stansede celler fra den samme celletype. Denne tilnærmingen gir renere resultater (siden det reduserer S-fasen forurensning), men det kan innføre skjevheter som stammer fra genetiske forskjeller mellom de stansede celler og de målte celler.

  1. Sorter i kalde forhold og samle sorterte celler i 1,5 / 2 ml rør. Hold rørene på is etter den slags.
    MERK: For å forbedre DNA utvinning, er det bedre å bruke lave bindende rør eller å bruke rør belagt med 4-5% BSA i 1-3 timer ved 4 ° C 18.

5. DNA Purification

  1. For hver prøve (G1 og S) rense DNA ved anvendelse av en DNA-rensesett.
    MERK: Når du bruker kommersielt sett, elueres med 400 mL eluering buffer i en 2 ml tube for høy avkastning, som anbefalt av produsenten.
  2. Sjekk DNA-konsentrasjon ved hjelp fluorometer.
    MERK: Fra 100000 pattedyrceller samlet inn av FACS, bør man få ~ 1 pg av DNA. ENt dette trinn DNA kan holdes i noen dager ved 4 ° C eller ved -20 ° C for lang lagring.

6. Ultralyd

  1. Overføre DNA inn i et 1,7 ml rør som er kompatibel med den magnetiske stativet benyttes.
  2. Konsentrer DNA ved bruk av 2 x SPRI perler i henhold til produsentens instruksjoner, ved hjelp av et magnetisk stativ, og elueres i 50 ul elueringsbuffer.
  3. Skjær DNA med en fokusert ultrasonicator til et gjennomsnitt mål peak størrelse på 250 bp. Bruk følgende innstillinger for en 50 mL DNA-prøve: 50 W, 20% Duty faktor, 200 sykluser per burst, 20 ° C, 120 s.
  4. Bekrefte størrelsen av den skjærpåvirkede DNA ved elektroforese. Den anbefalte størrelsesfordeling er 200-700 bp med en topp på ~ 250 bp.
    MERK: På dette stadiet DNA kan oppbevares i noen dager ved 4 ° C eller ved -20 ° C for lang lagring.

7. Bibliotek Forberedelse og sekvense

MERK: Mange bibliotek forberedelse kits og skiller segent sekvense plattformer skal fungere på samme måte som de som brukes av oss og nevnt i materialer delen. Egentlig i det siste, var Tor kart generert ved hjelp av en svært lignende metode med microarray plattformer 2.

  1. Forbered bibliotekene bruker noen kommersielle bibliotek forberedelse kit.
  2. På slutten av biblioteket forberedelse, velg størrelse ved hjelp av magnetiske kuler for 300-800 bp.
  3. Etter å ha forberedt biblioteker, måle DNA-konsentrasjon ved hjelp fluorometer.
  4. Mål DNA størrelse ved hjelp elektroforese.
  5. Utfør sekvensering på alle plattformer.
    MERK: Sekvense minst 10 M leser per prøve anbefales. Dette dybde tilsvarer en lese omtrent hver 300 bp (for ~ 3 Gb størrelse genomer), og er tilstrekkelig for Tor målinger med en oppløsning på 50 - 100 kb. Øke dybden vil resultere i en reduksjon i størrelsen av vinduene, og således gjør det mulig å øke oppløsning med høyere sikkerhet. Sammenkoblet ende sekvensering er ikke nødvendig idenne protokollen siden bare dekning informasjon samles inn. Det kan imidlertid bidra til å løse plasseringen av lyder som inneholder repeterende sekvenser.

8. Analyse

MERK: Dataanalyse er basert på metoden som brukes av A. Koren et al. 19.

  1. Kart sekvensdata til tilsvarende genomet ved hjelp bowtie2 eller noen pålitelig kort lese aligner. Definer varierende størrelse, lik-dekning kromosom vinduer som segmenter som omfattes av 200 leser i G1 fraksjonen og telle S-fasen leser i de samme vinduene.
  2. Beregn S / G1 grad for hvert vindu. Dette skal generere et kart med store svingninger i S / G1-forhold langs genomet (figur 3). En god kontroll for påliteligheten av Tor målingene er å sammenligne dette kartet til G1 / G1-forhold (fra to separate målinger av G1) som bør være mye flatere.
  3. Normal data til 0 betyr og en SD ved å trekke fra hver vALUE den gjennomsnittlige verdien av alle vinduer (unntatt X-kromosomet) og dele resultatene av standardavviket av S / G1 av alle vinduer. Dette er gjort for å omdanne til z-skår og muliggjøre sammenligning mellom forskjellige eksperimenter.
  4. Fjern alle gap regioner oppført av UCSC genom nettleser samt hver gjenværende inter gap fragment som inneholder færre enn 15 data vinduer.
  5. Glatt de resterende fragmenter med en kubisk utjevning spline via Matlab funksjon csaps med et parameter på 10 - 16 og interpolere til faste punkter hver 100 kb.
    MERK: Parametrene til utjevning og interpolering bør justeres basert på dybden av dataene. Andre egnede glattefremgangsmåter og funksjoner finnes og kan brukes.
  6. Etter visuelt bekrefter påliteligheten av hver enkelt kopiere, slå sammen alle de leser og beregne en dypere oppløsning profil ved å utføre den samme prosessen som er beskrevet ovenfor på disse dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En typisk ToR kart er vist i Figur 3 for mus embryonale fibroblaster (MEFs). Denne figuren viser analyseprosessen, siden det viser både de punkter, som er den normaliserte S / G1-forholdet for enkeltvinduer (trinn 8.3), så vel som den linje som resulterer fra den kubiske glatting og interpolering (trinn 8.5).

Slike kart fange organiseringen av replikering programmet, som er et lappeteppe av to typer Tor domener: i) store regioner (i størrelsesorden en megabase) som kopierer samtidig (CTR = konstant Tor regioner) på tidlig, midt eller sent S ; og ii) tidsmessige overgangsområdene (TTRS) hvori Tor endres gradvis. CTR er forbundet med hverandre ved hjelp av TTRS og sammen disse to typene av replikasjon organisasjon dekke hele genomet.

Til tross for den relativt lave sekvense c overskudd (en lese hver 300 bp) som brukes for ToR kartlegging, de resulterende kartene er ganske robust. Figur 4 viser reproduserbarhet Tor maps mellom tre paralleller av MEF celler sammenlignet med tre paralleller av mus pre-B-celler i samme region. Sammenligning mellom slike kart kan identifisering av regioner med differensial ToR som er definert som områder der forskjellene i Tor kartene mellom vev er betydelig større enn forskjellene mellom replikater.

Figur 2
Figur 2: Protokoll ordningen. Skjematisk diagram som beskriver fremgangsmåten i CNR-ToR metode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

57 / 55157fig3.jpg "/>
Figur 3: Representant genomiske Tor kart. Vist er Tor av hele kromosom 1 av MEF celler og en nærmere titt på en ~ 50 Mb regionen. Vist er de Z score til S / G1 verdier i varierende størrelse vinduer (prikker) og glattet data (heltrukket linje). Høy S / G1 verdier tilsvarer tidlig replikering mens lave verdier tilsvarer sent replikering. Piler peker på eksempler på konstant Tor regioner (CTR, rød) og tidsmessige overgangsområdene (TTRS, grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Reproduserbarhet av gjentagelsene. (A) Glattet ToR av MEF triplicates (blå) i forhold til pre-B triplicates (røde) i en 18 Mb region på musekromosom 1. Oransje pilervise til eksempler på differensialområdene mellom cellelinjer. (B) Heat kart over Spearman korrelasjon mellom de 6 prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CNR-ToR kan utføres i prinsipp på en hvilken som helst eukaryot prolifererende cellepopulasjon som kan deles ved hjelp av FACS til S og G1 faser (gjennomgått av Rhind N. og Gilbert DM 20). Metoden som beskrives her er blitt justert til pattedyrceller med et genomstørrelse på ~ 3 Gb slik som humant og mus. Små endringer i CNR-ToR protokoll (i cellepreparat og sekvensering dybde) er nødvendig, for å tilpasse den til andre eukaryoter. Det må tas hensyn til innsamling av tilstrekkelige mengder av S-fase celler, siden det er det hastighetsbegrensende trinnet. Således bør en foreløpig FACS for cellesyklus kan utføres for å bekrefte at forsøket kan gjøres og å validere den mengden av celler i S-fasen. For celler som oppviser uregelmessige cellesykluser, er det anbefalt å prestain cellene med BrdU å detektere delende celler, og flg Anti-BrdU produsentens protokoll før FACS trinnet. Vanligvis cellene blir farget med 10-20 mM BrdU i 30 minutter.

6) som er anbefalt for hver replikere for å få> 1 x 10 5 celler i S-fasen. Denne mengde bør økes når man arbeider med langsomt voksende celler, ettersom prosentandelen av celler i S-fasen er lavere og dermed har man å sortere flere celler for å få en tilstrekkelig mengde celler i S.

Ved sortering av celler, er det viktig for å oppnå best mulig separering av cellene i henhold til deres DNA-innhold, og således en lav strømningshastighet anbefales. For å maksimere den tidsoppløsningen, er det viktig å samle cellenefra hele S-fasen. Dette oppnås ved å portstyre S så bredt som mulig (figur 1). På den annen side bør G1 gating være smal (som starter fra G1 topp og til venstre, figur 1), for å unngå både sub-G1 og tidlig S-fase forurensninger.

Ultralydbehandling kan utføres ved forskjellige fremgangsmåter, men det anbefales å bruke en fokusert ultrasonicator som muliggjør en robust og enkel sonikering uten behov for kalibrering av hvert eksperiment. Ikke desto mindre, når den først etablerer protokollen i laboratoriet, er det anbefalt å kalibrere parameterne for å oppnå en størrelsesfordeling på 200-700 bp.

Som forklart i innledningen, er det to hovedmetoder for genome-wide ToR kartlegging - BrdU-IP og CNR-ToR. Begge metodene gir tilsvar Tor kart (data ikke vist) til tross for forskjellene mellom dem. CNR-ToR metoden er begrenset i sin berikelse serien siden den maksimale forskjellen betweno tidlige og sene regioner er todelt, mens med BrdU-IP mye høyere berikelse er oppnådd, siden tidlig Replikere regionene vil inneholde BrdU nesten bare i begynnelsen av fraksjonen. På den annen side er det BrdU-IP-metoden oppløsning begrenset av antall S-fasen fraksjoner oppsamlet. I sin mest vanlige anvendelse, er kun to fraksjoner (tidlig versus sen S) sammenlignet, noe som resulterer i et kompromiss av den fine tidsmessig oppløsning. CNR-ToR metode gir imidlertid et kontinuerlig signal langs hele S-fasen. Dessuten er den BrdU-IP-metode basert på immuno-utfelling som vanligvis gir en mye høyere enn bakgrunns CNR-ToR metode. En annen fordel med CNR-ToR metode er at den kan brukes i ettertid for å ekstrahere Tor Mer informasjon fra sekvenseringsdata for usynkroniserte kulturer som nylig beskrevet 21. Endelig er det CNR-ToR metode å foretrekke på grunn av sin enkelhet og på grunn av det faktum at det kan nedskalerte siden den ikke er basert på immunofluorescensno-nedbør.

Rollen ToR i komplekst nettverk av genomisk og epigenomic funksjoner gjenstår å dechiffrert. Det er relativt enkelt å CNR-ToR metoden gjør det mulig for utvidelse av eksisterende Tor data til å omfatte mange av de naturgitte forhold som cellene erfaring og bør utforskes grundig og Genome bred. Dette omfatter ulike replikering stressituasjoner, endoreduplication samt ulike krefttransformasjoner. Bruk av SNP data og høyere sekvense dybde vil også tillate å måle ToR av hvert allel separat. Videre vil ytterligere reduksjon i kostnadene sekvensering muliggjøre økning av oppløsningen av tor kart, som kan ytterligere hjelpemiddel i tillate identifisering av subtile endringer mellom tilstander. Andre fremtidige anvendelser kan oppnås ved å forbedre dagens metoder og anvende ToR måling på et lite antall celler som gjør det mulig å måle ToR in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Oriya Vardi for å få hjelp i å generere tall. Arbeid i IS-gruppen ble støttet av Israel Science Foundation (bevilgning nr 567/10) og European Research Council Starting Grant (# 281306).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS BI (Biological Industries) 02-023-1A
Trypsin-EDTA BI (Biological Industries) 03-052-1B
15 mL conical tube Corning 430790
5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap  BD-Falcon 352235
Ethanol Gadot 64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL Sigma R4875
Propidiom iodide 1 mg/mL Sigma P4170
Parafilm Parafilm PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes  Eppendorf 22431021
BSA Sigma A7906
1.7 mL MaxyClear tube  Axygen MCT-175-C
magnetic beads - Agencourt AMPure XP  Beckman Coulter A63881
Ultrasonicator Covaris M-series  -530092
50 µL microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm Covaris 520096
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Invitrogen Q32854
Electrophoresis 2200 Tape station system Agilent D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina NextSeq system Illumina SY-415-1001
Dneasy kit for DNA purification Qiagen 69504
PureProteom Magnetic Stand Millipore LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC DAKO F7210
FACS sorter BD FACSARIA III
FACS software BD FACSDiva v 8.0.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18, (1), 115-125 (2010).
  2. Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6, (7), e1001011 (2010).
  3. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6, (10), (2008).
  4. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25, (8), 1091-1103 (2015).
  5. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22, (10), 1833-1844 (2012).
  6. Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18, (10), 1562-1570 (2008).
  7. Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24, (1), 64-69 (2014).
  8. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10, (5), e1004319 (2014).
  9. McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25, (7), 647-656 (2003).
  10. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  11. Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44, (9), 4222-4232 (2016).
  12. Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
  13. Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
  14. Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, (1), 25-32 (2003).
  15. Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11, (3), 1217-1225 (1992).
  16. Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
  17. Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401, (6756), 929-932 (1999).
  18. Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. (1993).
  19. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91, (6), 1033-1040 (2012).
  20. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (8), a010132 (2013).
  21. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159, (5), 1015-1026 (2014).
Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).More

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter