Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения

doi: 10.3791/55157 Published: January 19, 2017

Abstract

Репликация генома происходит во время S-фазе клеточного цикла в сильно регулируемом процессе, который обеспечивает точность дублирования ДНК. Каждый геномная область реплицируется в отдельное время во время фазы S через одновременной активации нескольких начала репликации. Время репликации (ПКВ) коррелирует со многими геномных и эпигенетических особенностей и связан с частоты мутаций и рака. Осмысливая полную геномную вид программы репликации, в здоровье и болезни является одной из основных целей будущего и вызов.

В данной статье подробно описывается "Copy Number Коэффициент S / G1 для отображения геномную времени репликации" метод (в данном документе под названием: CNR-TOR), простой подход к карте генома широкий ToR клеток млекопитающих. Метод основан на количестве копий различий между S фазы клеток и фазы G1 клеток. Метод CNR-TOR выполняется в 6 этапов: 1. Подготовка клеток и окрашивание пропидиума йодида (PI); 2. Сортин G1 и фазы S клетки с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS); 3. Очистка ДНК; 4. Ультразвуком; 5. Подготовка библиотеки и последовательности; и 6. Биоинформатический анализ. Метод CNR-TOR является быстрый и простой подход, который приводит к репликации подробных карт.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Млекопитающим репликации ДНК жестко регулируется, чтобы обеспечить точную репликацию каждой хромосомы только один раз в течение клеточного цикла. Репликация происходит в соответствии с жестко регламентированной порядке - несколько больших геномных областей (~ Мб) реплицировать в начале фазы S (начало репликации доменов) , тогда как другие геномные области репликации позже в средней или поздней фазе S (средние и поздние реплицирующихся доменов) 1. Большая часть генома реплицируются в то же время во всех тканях (конститутивные домены ПКВ), в то время как 30% - 50% генома, меняет свое техническое задание между тканями 2, во время дифференцировки 3, 4 , и в меньшей степени , также во время раковой трансформации 5 , Кроме того, некоторые геномные области репликации в асинхронном режиме 6, 7, 8, а именно есть разницав ПКВ между двумя аллелями.

ToR коррелирует со многими геномных и эпигеномном функций , включая уровни транскрипции, содержание GC, хроматина состояние, плотность генов и т.д. 1, 9. ToR также связан с частоты мутаций и типов 10, 11 и , следовательно , неудивительно, что возмущения программы репликации связаны с раком 12, 13. Причинно-следственная связь между ПКВ и структуры хроматина пока не понял. Вполне возможно, что открытая хроматина способствует раннему репликации. Тем не менее, альтернативная модель предполагает , что хроматин собирается во время репликации и различные регуляторы хроматина , присутствующие в начале и в конце S фазы приводят к дифференциальной упаковки ранних и поздних воспроизводящихся областей 1, 14 11.

Флуоресцентная гибридизация (FISH) в основной метод для измерения ПКВ на отдельных локусов. Она осуществляется просто путем подсчета процента клеток фазы S , которые обладают одной рыбы сигналы vs. процент дублетов для заданного аллель 15, 16. Альтернативный способ, состоит из последовательностей импульсов мечения ДНК , с помощью BrdU, сортировка клеток в соответствии с их содержанием ДНК в различные моменты времени по S, иммунопреципитации ДНК , содержащей BrdU, и проверять обилие осажденной ДНК с кПЦР 17.

Геномные отображение ТЗ может быть достигнуто двумя способами. Первый способ представляет собой геномную вариант метода, основанного BrdU-IP описанный выше, в котором количественное определение суммыосажденной ДНК в каждой фракции осуществляется одновременно в течение всего генома путем гибридизации с микрочипов или глубокой последовательности. Второй метод, CNR-ToR, основан на измерении числа копий каждой геномной области фазовых клеток S и нормализацию по содержанию ДНК в G1 клетках. В этом способе клетки сортируются по FACS в не-тиражирование (G1 фаза) и тиражирование (фаза S) группы (рисунок 1). Клетки в G1 имеют один и тот же номер копии всех геномных областей и, следовательно, их содержание ДНК должно быть одинаковым. С другой стороны, ДНК, число копий в S зависит от технического задания, так как ранние регионы Дублирование подверглись репликации в большинстве клеток и, следовательно, их содержание ДНК удваивается, в то время как поздние регионы Дублирование еще не реплицируются в большинстве клеток и, следовательно, их содержание ДНК будет быть похож на G1 клеток. Следовательно, S соотношение G1 содержания ДНК свидетельствует о ПКВ. Количество ДНК для каждой области генома измеряется либо путем гибридизациимикрочипов или глубокой последовательности 2, 8. будут дополнительно обсуждены преимущества метода CNR-TOR.

В данной статье описывается метод CNR-TOR для геномного картирования ToR , как описано на рисунке 2. В статье рассматриваются мелкие детали всего процесса от момента сбора клеток до базового анализа результатов и создания геномных ToR карт. Протокол, описанный в этой статье была успешно выполнена на различных типах клеток, выращенных в культуре. Дальнейшее совершенствование этого протокола может привести к отображению ПКВ в естественных условиях и в редких типов клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Примечание: TOR может быть измерена только на растущих, несинхронизированных клетках. Эта процедура должна начинаться с по крайней мере , 1 - 2 х 10 6 быстро растущих клеток, которые обычно приводят к ~ 1 × 10 5 клеток в фазе S (шаг ограничение скорости). Рекомендуется проводить каждый эксперимент с использованием двух или трех повторах. Весь процесс CNR-TOR может быть завершена в течение одной недели - через два дня должен быть посвящен всем шагам до подготовки библиотеки, от одного до двух дней, необходимых для секвенирования и дополнительный день необходимо для первоначального анализа данных.

1. Сбор клеток из культуры

Примечание: Протокол написан для клеток , растущих в культуре в 10 см пластинах (содержащих примерно 2 - 5 × 10 6 клеток), но может быть легко отрегулирована на другие платформы.

  1. Для клеток, выращенных в суспензии, перейти к фиксации (раздел 2).
  2. Для прилипшие клетки, аспирация и мыть плел с 3 мл PBS без Са 2+ и Mg 2+.
  3. Выбросите PBS и инкубируют клетки в течение 5 мин при 37 ° С в 1 мл трипсина-коммерческого ЭДТА, пока клетки отделяться.
    Примечание: Продолжительность обработки трипсином должна быть отрегулирована для каждого типа клеток.
  4. Добавьте 3 мл культуральной носитель для нейтрализации трипсина и собирают клетки в 15 мл коническую пробирку или 5 мл полистирола трубки. Держите на льду.

2. Закрепление

Примечание: В этой части все шаги должны быть сделано при 4 ° С.

  1. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  2. Отберите и мыть клетки дважды 1 мл холодного PBS.
  3. Ресуспендируют клеток в 250 мкл (общий) холодной PBS.
  4. В то время как осторожно встряхивая пробирку, медленно по каплям добавляют 800 мкл 20 ° C 100% этанола. Это приводит к конечной концентрации этанола 70 - 80%.
    Примечание: Высокий этанол чистота рекомендуется на этом этапе.
  5. Инкубируйте клетки на льду Foг 30 мин.
    Примечание: На этом этапе клетки могут храниться в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или в течение нескольких месяцев при -20 ° C.

3. PI Окрашивание

  1. Центрифуга клетки при 500 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
  2. Аспирируйте супернатант тщательно и мыть клетки дважды 1 мл холодного PBS.
  3. Отберите и ресуспендирования каждый образец со следующей смеси: 1 мл PBS, 5 мкл 10 мг / мл РНКазы А, йодид пропидия 50 мкл 1 мг / мл (PI; перемешать флакон перед использованием). Отрегулируйте концентрацию до ~ 2 · 10 6 клеток / мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить света - PI чувствителен к свету.
  4. Фильтруют через 35 мкм меш в 5 мл полистирола трубки и близко парафильмом.
  5. Выдержите при комнатной температуре в темноте в течение 15 - 30 мин.
    Примечание: Клетки теперь готовы для анализа FACS. При необходимости, Окрашенные клетки могут храниться в течение не менее 24 ч при температуре 4 ° С в темноте.

4. Сортировка

  1. Сортировка клеток с использованием машины FACS. НасЕ 561 нм лазер дифференцироваться клетки в зависимости от их интенсивности ПИ. Другие лазеры вблизи максимума возбуждения на 535 нм, как 488 нм или 532 могут использоваться в зависимости от конфигурации FACS машины.
  2. Для получения оптимальных результатов используйте наименьшее сопло рекомендованного для конкретного размера ячейки (для большинства клеток 85 мкм). Приоритетность режимы чистоты по сравнению с выходом. Используйте постоянный медленный поток, как правило, до 300-500 событий / с, при давлении оболочки 45 фунтов на квадратный дюйм.
  3. Использование стробирования, различать мертвые клетки и субклеточных мусора (FCS низкие и высокие SSC), откладывая FCS против SSC. Из жизнеспособных клеток дискриминировать дублеты путем построения графика SSC-Ширина (W) против SSC-высота (H) , а затем FSC-W против FSC-H участка и по PI- W против PI-H (дублеты будет иметь тот же H-значение но больше W-значение). Для получения жизнеспособных одиночных клеток начертить гистограмму интенсивности ПИ-зона (А), которая представляет содержание ДНК в клетках.
  4. Сортировка клеток в фазах G1 и S, как показано на рисунке 1, Gating для S должны быть широкими и вторгаться в G1 и G2 фаз, в то время как G1 стробирования должна быть узкой и как можно дальше от S, насколько это возможно.

Рисунок 1
Рисунок определение фазы цикла 1. Ячейка на основе интенсивности ПИ. Гистограмма, показывающая распределение содержания клеточной ДНК (измеряется PI-площадь) мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) населения. Содержание ДНК используется для сортировки население на две подгруппы населения I) G1 клетки (содержание 2н ДНК) и II) S фазы клетки (2N - 4N содержание ДНК), используя отмеченные регионы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Примечание: Цель коллекции G1 клеток для учета погрешностей в эффективности между различными секвенирования геномных областей. Альтернативное приложениеРоач является использование G1 клеток, захваченных из того же самого типа клеток. Такой подход дает более чистые результаты (так как это сводит к минимуму загрязнение фазы S), но это может ввести предвзятости, вытекающие из генетических различий между арестованными клеток и измеренных клеток.

  1. Сортировка в холодных условиях и сбора отсортированных клеток в 1,5 / 2 мл пробирки. Хранить трубы на льду следующие сорта.
    Примечание: Для того , чтобы улучшить восстановление ДНК, то лучше использовать низким связыванием трубы или использовать трубы с покрытием с 4 - 5% БСА в течение 1 - 3 ч при 4 ° С 18.

5. ДНК Очистка

  1. Для каждого образца (G1 и S) очищают ДНК с использованием набора для очистки ДНК.
    Примечание: При использовании коммерческого набора, элюции 400 мкл буфера для элюции в 2 мл пробирку для высокого выхода, в соответствии с рекомендациями производителя.
  2. Проверьте концентрацию ДНК с помощью флуорометр.
    Примечание: Из 100000 клеток млекопитающих, собранных FACS, следует получить ~ 1 мкг ДНК.т этот этап ДНК может сохраняться в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или при -20 ° С в течение длительного хранения.

6. Ультразвуком

  1. Перенос ДНК в 1,7 мл пробирку, который совместим с магнитной подставкой, используемой.
  2. Концентрат ДНК с использованием 2х SPRI бусин в соответствии с инструкциями производителя, используя магнитную стойку, и элюирования в 50 мкл буфера для элюции.
  3. Shear ДНК с сфокусированного ультразвукового дезинтегратора до среднего размера целевого пика 250 пар оснований. Используйте следующие параметры для образца ДНК в 50 мкл: 50 Вт, 20% коэффициент заполнения, 200 циклов в порыве, 20 ° C, 120 сек.
  4. Проверьте размер фрагментированной ДНК с помощью электрофореза. Рекомендуемый размер дистрибутива составляет 200 - 700 пар оснований с максимумом при ~ 250 пар оснований.
    Примечание: На этом этапе ДНК может сохраняться в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или при -20 ° С в течение длительного хранения.

7. Библиотека Подготовка и секвенирование

Примечание: Многие наборы для подготовки библиотеки и различающиесялор секвенирование платформы должны работать так же, как те, которые используются нами и упомянутые в разделе материалов. На самом деле в прошлом, ToR карты были получены с использованием очень похожий метод с микрочипов платформ 2.

  1. Подготовка библиотеки с использованием любого набора коммерческой подготовки библиотеки.
  2. По окончании подготовки библиотеки, выберите размер с помощью магнитных шариков 300 - 800 пар оснований.
  3. После подготовки библиотек, измерения концентрации ДНК с помощью флуорометр.
  4. Измерьте размер ДНК с помощью электрофореза.
  5. Выполните последовательность на любой платформе.
    Примечание: Секвенирование по меньшей мере, 10 М читает на пробу рекомендуется. Эта глубина эквивалентно прочитанного приблизительно каждые 300 пар оснований (за ~ 3 Гб размер геномов), и является достаточным для измерения ToR при разрешении 50 - 100 кб. Увеличение глубины приведет к уменьшению размера окна и, таким образом, позволит увеличить разрешение с более высокой достоверностью. Соединенный конец последовательности не является необходимым вэтот протокол, поскольку информация только покрытия собирается. Это, однако, может помочь в решении местоположения прочтений, которые содержат повторяющиеся последовательности.

8. Анализ

Примечание: анализ данных на основе метода , используемого А. Корен и соавт. 19.

  1. Карта секвенирования данные соответствующему генома с использованием bowtie2 или из любого надежного чтения короткий выравнивателя. Определить изменения размера, равного охвата хромосомные окна в виде сегментов, охватываемых 200 считывает в G1 фракции и рассчитывать фазы S читает в тех же окнах.
  2. Рассчитать отношение S / G1 для каждого окна. Это должно создать карту с большими колебаниями в соотношении S / G1 вдоль генома (рисунок 3). Хороший контроль за достоверность измерений ToR, чтобы сравнить эту карту с соотношением G1 / G1 (от двух отдельных измерений G1), которая должна быть гораздо более пологой.
  3. Нормализация Данные 0 означают и 1 SD путем вычитания из каждого VALUE среднее значение всех окон (за исключением Х-хромосомы) и разделив результат на стандартное отклонение S / G1 всех окон. Это делается для того, чтобы преобразовать в г баллов и возможность сравнения между различными экспериментами.
  4. Удалите все щелевые участки, перечисленные в геноме браузера УСК, а также каждого оставшегося фрагмента между зазором, содержащего менее 15 окон данных.
  5. Гладкая оставшиеся фрагменты с кубической сглаживающего сплайна через функцию csaps Matlab с параметром 10 - 16 и интерполировать в заданных точках через каждые 100 кб.
    Примечание: Параметры сглаживания и интерполяции должны быть скорректированы на основе глубины данных. Другие подходящие способы и функции сглаживающих существуют и могут быть использованы.
  6. После того, как визуально подтверждения достоверности каждой репликации, объединить все операции чтения и вычислить более глубокий профиль разрешения, выполняя тот же процесс, описанный выше, по этим данным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Типичная карта ToR показана на рисунке 3 для эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ). На этом рисунке показано, процесс анализа, так как он показывает как точки, которые являются нормализованное отношение / G1, S для отдельных окон (этап 8.3), а также линии, возникающее в результате сглаживания кубическими и интерполяции (этап 8.5).

Такие карты захвата организации программы репликации, которая представляет собой мозаику из двух типов ToR доменов: I) крупных регионов (в порядка Мегабазе), которые копируют одновременно (CTRS = константные области ToR) на ранней, средней или поздней S ; и б) временные переходные области (ППИ), в котором ToR постепенно меняется. Показатели CTR соединены друг с другом с помощью ППИ и вместе эти два типа организации репликации охватывают весь геном.

Несмотря на относительно низкую секвенирования C переросток (один для чтения каждые 300 пар оснований), используемый для отображения ToR, полученные карты являются весьма надежными. На рисунке 4 показана воспроизводимости ToR отображений между трехкратном повторе из MEF клеток по сравнению с трехкратном повторе мышиных пре-В клеток в том же регионе. Сравнение таких карт позволяет идентифицировать регионы с дифференциальной ToR, которые определяются как регионы, в которых различия в ToR картах между тканями значительно больше, чем различия между повторами.

фигура 2
Рисунок 2: Схема протокола. Принципиальная электрическая схема, описывающая процедуру метода CNR-TOR. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

57 / 55157fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Представитель геномные ToR карты. Показана ToR всего хромосоме 1 MEF клеток и более близкий взгляд на ~ 50 Мб региона. Указаны Z десятки значений S / G1 в той или иной размер окна (точки) и сглаженные данные (сплошная линия). Высокие значения S / G1 соответствуют ранней репликации, тогда как низкие значения соответствуют поздней репликации. Стрелки указывают на примеры постоянных областей ToR (CTR, красный) и временных переходных областей (ППИ; зеленый). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Воспроизводимость повторах. (A) Smoothed ToR из MEF трехкратном повторе (синий) по сравнению с пре-В трехкратном повторе (красный) в 18 Мб области на хромосоме 1. мыши Оранжевые стрелкиуказывают на примеры дифференциальных областей между клеточными линиями. (B) Тепловая карта Спирмена корреляций между 6 образцов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CNR-TOR может быть выполнена в принципе на любой эукариотической популяции пролиферирующих клеток , которые могут быть разделены на FACS к S и G1 фазы (обзор Ринда Н. и Гилберта DM 20). Метод, описанный здесь, был скорректирован к клеткам млекопитающих с размером генома ~ 3 Gb, таких как человека и мыши. Небольшие изменения в протоколе CNR-TOR (на стадии подготовки клеток и глубины секвенирования) необходимы для того, чтобы адаптировать его к другим эукариот. Особое внимание следует уделять сбору достаточного количества S фазовых ячеек, поскольку она является лимитирующей стадией. Таким образом, предварительный FACS для клеточного цикла должны быть выполнены, чтобы подтвердить, что эксперимент может быть сделано, и для проверки количества клеток в фазе S. Для клеток, которые обнаруживают нерегулярные циклы клеток, рекомендуется prestain клеток с BrdU для обнаружения делящихся клеток, а не следовать протоколу производителя Анти-BrdU до стадии FACS. Обычно клетки окрашиваются 10-20 мкМ BrdU в течение 30 мин.

6 клеток) рекомендуется для каждого повторить, чтобы получить> 1 × 10 5 клеток в фазе S. Эта сумма должна быть увеличена при работе с медленно растущих клеток, так как процент клеток в фазе S ниже, и, таким образом, приходится сортировать больше клеток для того, чтобы получить достаточное количество клеток в S.

При сортировке клеток, важно, чтобы достичь наилучшего отделения клеток в соответствии с их содержанием ДНК и, таким образом, рекомендуется низкой скорости потока. Для того, чтобы максимально увеличить временное разрешение, важно, чтобы собрать клеткиот всей фазы S. Это достигается за счет стробирования S как можно более широкого (рисунок 1). С другой стороны, G1 стробирования должна быть узкой (начиная с вершины G1 и влево; Рисунок 1), с тем чтобы избежать как суб-G1 и ранней S-фазе загрязнения.

Обработка ультразвуком может быть выполнена различными способами, однако рекомендуется использовать сфокусированный ультразвукового дезинтегратора, который обеспечивает надежную и легкую ультразвуковую обработку без необходимости калибровки каждого эксперимента. Тем не менее, когда на первом этапе создание протокола в лаборатории, рекомендуется для калибровки параметров для получения распределения по размерам 200-700 пар оснований.

Как объяснялось во введении, существует два основных метода генома отображения ToR - BrdU-IP и CNR-TOR. Оба метода дают аналогичные карты TOR (данные не показаны), несмотря на различия между ними. Метод CNR-ToR ограничен в своем диапазоне обогащения, так как максимальная разница betweан ранних и поздних регионов в два раза, в то время как с BrdU-IP значительно выше, обогащение достигается, так как ранние регионы Дублирование будет содержать BrdU почти только в начале фракции. С другой стороны, разрешение метода BrdU-МП ограничено количеством фазовых фракций S, собранных. В наиболее общем применении только две фракции (раннего и позднего S) сравниваются, что приводит к компромиссу тонкой временного разрешения. Метод CNR-TOR, однако, дает непрерывный сигнал вдоль всей фазы S. Кроме того, метод BrdU-IP основана на иммуно-осадков, которые, как правило, дает значительно более высокий фон, чем метод CNR-TOR. Еще одним преимуществом способа CNR-TOR является то , что он может быть использован ретроспективно для извлечения информации ToR из секвенирования данных несинхронизированных культур , как недавно описано 21. Наконец, метод CNR-TOR является предпочтительным из-за своей простоты и в связи с тем, что она может быть вниз масштабируется, так как оно не основано на IMMUнет-осадков.

Роль ПКВ в сложной сети геномных и эпигеномном функций остается быть расшифрованы. Относительная простота метода CNR-TOR позволяет для расширения существующих данных ToR включить многие из природных условий, что клетки опыт и должны быть изучены тщательно и генома в ширину. Это включает в себя различные стресс репликации ситуации, эндоредупликацию, а также различные преобразования рака. Использование данных SNP и более высокой глубины секвенирования также позволит измерять ToR каждого аллеля по отдельности. Кроме того, дальнейшее снижение стоимости секвенирования позволит увеличение разрешения ToR карт, что может в дальнейшем помощь в позволяют выявить тонкие изменения между условиями. Другие будущие приложения могут быть достигнуты за счет совершенствования существующих методов и применения измерений ToR на небольшом количестве клеток , которые позволят измерения ПКВ в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим ория Варди за помощь в создании фигуры. Работа в группе была поддержана Израильского научного фонда (грант № 567/10) и Европейского исследовательского совета Начиная Грант (# 281306).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS BI (Biological Industries) 02-023-1A
Trypsin-EDTA BI (Biological Industries) 03-052-1B
15 mL conical tube Corning 430790
5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap  BD-Falcon 352235
Ethanol Gadot 64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL Sigma R4875
Propidiom iodide 1 mg/mL Sigma P4170
Parafilm Parafilm PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes  Eppendorf 22431021
BSA Sigma A7906
1.7 mL MaxyClear tube  Axygen MCT-175-C
magnetic beads - Agencourt AMPure XP  Beckman Coulter A63881
Ultrasonicator Covaris M-series  -530092
50 µL microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm Covaris 520096
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Invitrogen Q32854
Electrophoresis 2200 Tape station system Agilent D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina NextSeq system Illumina SY-415-1001
Dneasy kit for DNA purification Qiagen 69504
PureProteom Magnetic Stand Millipore LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC DAKO F7210
FACS sorter BD FACSARIA III
FACS software BD FACSDiva v 8.0.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18, (1), 115-125 (2010).
  2. Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6, (7), e1001011 (2010).
  3. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6, (10), (2008).
  4. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25, (8), 1091-1103 (2015).
  5. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22, (10), 1833-1844 (2012).
  6. Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18, (10), 1562-1570 (2008).
  7. Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24, (1), 64-69 (2014).
  8. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10, (5), e1004319 (2014).
  9. McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25, (7), 647-656 (2003).
  10. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  11. Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44, (9), 4222-4232 (2016).
  12. Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
  13. Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
  14. Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, (1), 25-32 (2003).
  15. Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11, (3), 1217-1225 (1992).
  16. Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
  17. Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401, (6756), 929-932 (1999).
  18. Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. (1993).
  19. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91, (6), 1033-1040 (2012).
  20. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (8), a010132 (2013).
  21. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159, (5), 1015-1026 (2014).
Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).More

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter