Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning

doi: 10.3791/55157 Published: January 19, 2017

Abstract

Replikation av genomet inträffar under S-fasen av cellcykeln i en starkt reglerad process som garanterar trohet DNA duplicering. Varje genomregion replikeras på en viss tid under S-fasen genom samtidig aktivering av flera replikationsursprung. Tid för replikering (dir) korrelerar med många genomiska och epigenetiska funktioner och är kopplat till mutationshastigheter och cancer. Förstå hela iska syn på replikeringsprogrammet i hälsa och sjukdom är en stor framtida mål och utmaning.

Denna artikel beskriver i detalj "Kopiera Antal Förhållande S / G1 för att kartlägga genom Time of Replication" -metoden (här kallad: CNR-ToR), en enkel metod för att kartlägga genomet breda uppdrags av däggdjursceller. Metoden är baserad på kopietalet skillnaderna mellan S-fasceller och G1-fasceller. CNR-dir metoden utförs i 6 steg: 1. Framställning av celler och färgning med propidiumjodid (PI); 2. Sorting G1 och S-fas-celler med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS); 3. DNA-rening; 4. Sonikering; 5. Bibliotek förberedelse och sekvensering; och 6. Bioinformatisk analys. CNR-ToR metod är en snabb och enkel metod som resulterar i detaljerade replikering kartor.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Däggdjurs-DNA-replikation är hårt reglerad för att säkerställa den exakta replikering av varje kromosom exakt en gång under cellcykeln. Replikering sker enligt en starkt reglerad ordning - flera stora genomiska regioner (~ Mb) replikera i början av S-fasen (början replikera domäner), medan andra genomiska regioner replikera senare vid mitten eller sent S-fas (mitten och slutet av replikerings domäner) 1. Det mesta av genomet replikeras samtidigt i alla vävnader (konstitutiva ToR domäner), medan 30% - 50% av genomet, ändrar sin dir mellan vävnader 2, under differentiering 3, 4 och i mindre utsträckning även under cancertransformation 5 . Dessutom är vissa genomiska regioner replikera asynkront 6, 7, 8, nämligen det finns en skillnadi uppdrags mellan de två alleler.

ToR korrelerar med många genomiska och epigenomiska funktioner, inklusive transkriptionsnivåer, GC-innehåll, kromatin tillstånd, genen densitet, etc. 1, 9. Tor är också förknippad med mutationshastigheter och typer 10, 11 och därför föga förvånande, är störningar av replikeringsprogram kopplat till cancer 12, 13. Orsakssambandet mellan reglerna och kromatinstrukturen är ännu inte klarlagd. Det är möjligt att öppna kromatin underlättar tidig replikation. Tyder emellertid på en alternativ modell som kromatinet monteras vid replikering och de olika kromatin regulatorer närvarande vid början och slutet av S-fasen leder till differentiell förpackning av tidiga och sena replikerande regionerna 1, 14 11.

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) är den huvudsakliga metoden för att mäta ToR på individ loci. Den utförs helt enkelt genom att räkna den procentuella andelen S-fasceller som uppvisar enda fisk signaler kontra andelen dubbletter för en given allel 15, 16. En alternativ metod, består av puls märkning av DNA med BrdU, sortering celler enligt deras DNA-innehåll till flera tidpunkter längs S, immunoprecipitating DNA innehållande BrdU, och kontroll av överflöd av utfällt DNA med qPCR 17.

Genomisk dir kartläggning kan uppnås genom två metoder. Den första metoden är en genomisk version av BrdU-IP-baserad metod som beskrivits ovan, i vilken en kvantifiering av den mängdav utfällt DNA i varje fraktion sker samtidigt för hela genomet genom hybridisering till mikromatriser eller djup sekvensering. Den andra metoden, CNR-dir, är baserad på mätning av kopietalet av varje genomregion av S-fasceller och normalisering av DNA-halten i G1-celler. I denna metod, celler sorteras genom FACS till icke-replikerande (G1 fas) och replikera (S-fas) grupper (Figur 1). Celler i G1 har samma antal kopior i alla iska regioner och därmed deras DNA-innehåll bör vara densamma. Å andra sidan, det DNA kopietal i S beror på uppdrags, eftersom tidiga replikerande regioner genomgick replikation i de flesta celler och därför är deras DNA-innehåll fördubblas, medan sena replikerande regioner som inte har replikerats ännu i de flesta celler och därför är deras DNA-innehåll kommer vara liknande det i G1-celler. Därav S till G1 förhållandet mellan DNA-innehåll är ett tecken på reglerna. Mängden DNA för varje genomregion mäts antingen genom hybridisering tillmikromatriser eller genom djupsekvense 2, 8. Fördelarna med CNR-dir-metoden kommer att diskuteras vidare.

Detta dokument beskriver CNR-dir förfarande för genomisk dir kartläggning såsom beskrivs i figur 2. Papperet diskuterar de fina detaljerna i hela processen från att samla celler tills den grundläggande analys av resultaten och skapandet av genomiska kartor ToR. Protokollet som beskrivs i detta dokument har utförts med godkänt resultat på olika celltyper odlas i kultur. Framtida förbättringar av detta protokoll kan leda till kartläggningen av uppdrags in vivo och i sällsynta celltyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Obs: ToR kan endast mätas på växande, osynkroniserade celler. Förfarandet bör börja med åtminstone en - 2 x 10 6 snabbväxande celler, som vanligtvis kommer att resultera i ~ 1 x 10 5 celler i S-fas (det hastighetsbegränsande steget). Det rekommenderas att göra varje försök att använda två eller tre replikat. Hela processen med CNR-ToR kan slutföras inom en vecka - två dagar bör ägnas åt alla steg upp till biblioteket förberedelse, en till två dagar behövs för sekvensering och ytterligare en dag är nödvändigt för den första dataanalys.

1. Insamling av celler från kultur

OBS: Protokollet är skriven för celler som växer i kultur i 10 cm plattor (innehållande cirka 2 - 5 x 10 6 celler), men kan lätt anpassas till andra plattformar.

  1. För celler som odlades i suspension, vidare till fixering (avsnitt 2).
  2. För vidhäftande celler, aspirera och tvätta plåt med 3 ml PBS utan Ca 2 + och Mg 2 +.
  3. Kassera PBS och inkubera cellerna under 5 min vid 37 ° C med 1 ml kommersiell trypsin-EDTA tills cellerna lossnar.
    OBS: Varaktigheten av trypsinbehandling bör justeras till varje celltyp.
  4. Tillsätt 3 ml odlingsmedia för att neutralisera trypsin och samla celler i ett 15 ml koniskt rör eller en 5 ml polystyrenrör. Håll på is.

2. Fixering

OBS: För denna del, alla åtgärder bör ske vid 4 ° C.

  1. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
  2. Aspirera och tvätta cellerna två gånger med 1 ml kall PBS.
  3. Resuspendera cellerna i 250 mikroliter (totalt) kall PBS.
  4. Under försiktig vortexa röret, tillsätt långsamt droppvis 800 | il av -20 ° C 100% etanol. Detta leder till en slutlig etanolkoncentration på 70 - 80%.
    OBS: hög renhet etanol rekommenderas vid detta steg.
  5. Inkubera cellerna på is for 30 min.
    OBS: I det här skedet celler kan hållas under några dagar vid 4 ° C eller under några månader vid -20 ° C.

3. PI färgning

  1. Centrifugera cellerna vid 500 xg under 10 min vid 4 ° C.
  2. Aspirera supernatanten försiktigt och tvätta cellerna två gånger med 1 ml kall PBS.
  3. Aspirera och återsuspendera varje prov med följande blandning: 1 ml PBS, 5 mikroliter 10 mg / ml RNaseA, 50 mikroliter 1 mg / ml propidiumjodid (PI, blanda flaskan före användning). Justera koncentration upp till ~ 2 x 10 6 celler / ml).
    OBS: Förvaras utom ljus - PI är ljuskänslig.
  4. Filtrera genom 35 um mesh till en 5 ml polystyrenrör och nära med Parafilm.
  5. Inkubera vid RT i mörker, för 15-30 min.
    OBS: Celler är nu redo för FACS-analys. Om nödvändigt, kan de färgade cellerna lagras under minst 24 h vid 4 ° C i mörker.

4. Sortera

  1. Sorterings celler med användning av en FACS-maskin. Osse 561 nm laser för att differentiera celler baserat på deras PI intensitet. Andra lasrar nära excitation maximalt 535 nm som 488 nm eller 532 kan användas beroende på maskinens konfiguration FACS.
  2. För bästa resultat, använd den minsta munstycket rekommenderas för specifika cellstorleken (för de flesta celler 85 um). Prioritera renhetslägen över avkastning. Använda en stadig långsamt flöde, vanligen upp till 300-500 händelser / s, med en mantel tryck av 45 psi.
  3. Med hjälp av grind, diskriminera döda celler och subcellulära skräp (låga FCS och hög SSC) genom att rita FCS vs SSC. Från de livsdugliga cellerna diskriminera dubletter genom att rita SSC-bredd (W) mot SSC-Höjd (H), följt av en FSC-W vs FSC-H tomt och PI W vs PI-H (dubbletter kommer att ha samma H-värde men större W-värde). För de livsdugliga enskilda celler rita ett histogram av intensiteten PI-Area (A), som representerar DNA-innehållet i cellerna.
  4. Sorterings celler i G1 och S-faser, såsom visas i figur 1. Gating för S bör vara breda och tränga in i G1 och G2 faserna, medan G1 grind bör vara smal och så långt från S som möjligt.

Figur 1
Figur 1. Cellcykel fasbestämning baserat på PI intensitet. Histogram som visar fördelningen av det cellulära DNA-innehållet (uppmätt genom PI-Area) av mus embryonala fibroblaster (MEF) populationen. DNA-innehållet används för att sortera befolkningen i två delpopulationer i) G1-celler (2N DNA-innehåll) och ii) S-fasceller (2N - 4N DNA-innehåll), med hjälp av de markerade områdena. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

OBS: Syftet med insamling av G1-celler är att redogöra för bias i sekvense effektivitet mellan olika genomiska regioner. En alternativ appenmört är att använda G1 gripna celler från samma celltyp. Detta tillvägagångssätt ger renare resultat (eftersom det minimerar S förorening fas) men det kan införa fördomar som härrör från genetiska skillnader mellan de gripna celler och de uppmätta cellerna.

  1. Sortera i kyla och samla sorterade celler i 1,5 / 2 ml rör. Håll rören på is efter sort.
    OBS: För att förbättra DNA återhämtning, är det bättre att använda låga bindnings rör eller att använda rör belagda med 4-5% BSA under 1-3 h vid 4 ° C 18.

5. DNA Purification

  1. För varje prov (G1 och S) rena DNA med användning av en DNA-reningskit.
    OBS: När du använder kommersiellt kit, eluera med 400 mikroliter elueringsbuffert i ett 2 ml rör för hög avkastning, som rekommenderas av tillverkaren.
  2. Kontrollera DNA-koncentrationen med användning av fluorometer.
    OBS: Från 100.000 däggdjursceller som samlats in av FACS, bör en få ~ en ^ g av DNA. ent detta skede DNA kan förvaras under några dagar vid 4 ° C eller vid -20 ° C under lång lagring.

6. Sonikering

  1. Överföra DNA in i en 1,7 ml rör som är kompatibel med den magnetiska stativ används.
  2. Koncentrera DNA med 2x SPRI pärlor enligt tillverkarens instruktioner, med en magnetisk monter, och eluera i 50 mikroliter elueringsbuffert.
  3. Shear DNA med en fokuserad ultraljud till ett genomsnittligt mål topp storlek på 250 bp. Använd följande inställningar för en 50 mikroliter DNA-prov: 50 W, 20% Duty faktor, 200 Cykler per skur, 20 ° C, 120 s.
  4. Kontrollera storleken på det skjuvade DNA genom elektrofores. Den rekommenderade storleksfördelningen är 200-700 bp med en topp vid ~ 250 bp.
    OBS: Vid kan hållas detta stadium DNA för några dagar vid 4 ° C eller vid -20 ° C under lång lagring.

7. Bibliotek Förberedelser och sekvensering

OBS: Många förberedelse bibliotek kit och skiljer sigent sekvenseplattformar ska fungera på samma sätt som de som används av oss och som nämns i avsnittet material. Faktiskt i det förflutna, har kartor ToR genereras med hjälp av en mycket liknande metod med microarray plattformar 2.

  1. Förbered bibliotek använder någon kommersiellt preparat bibliotek kit.
  2. I slutet av biblioteket förberedelse, välj storlek med hjälp av magnetiska pärlor för 300-800 bp.
  3. Efter framställning bibliotek, mäta DNA-koncentrationen med hjälp av fluorometer.
  4. Mät DNA-storlek med hjälp av elektrofores.
  5. Utför sekvense på alla plattformar.
    OBS: Sekvense minst 10 M läser per prov rekommenderas. Detta djup motsvarar en läsa ungefär var 300 bp (för ~ 3 GB storlek genom), och är tillräcklig för Tor mätningar med en upplösning på 50 - 100 kb. Öka djupet kommer att resultera i en minskning av storleken av fönstren och kommer således att göra det möjligt att öka upplösningen med högre säkerhet. Parade slut sekvensering är inte nödvändigtdetta protokoll eftersom endast täckning information samlas. Det kan dock bidra till att lösa placeringen av läsningar som innehåller repetitiva sekvenser.

8. Analys

OBS: Dataanalys är baserad på den metod som används av A. Koren et al. 19.

  1. Karta sekvensdata till motsvarande genomet med hjälp av bowtie2 eller någon tillförlitlig kort läsning Aligner. Definiera varierande storlek, lika-täckning kromosomala fönster som segment som omfattas av 200 läser i G1 fraktionen och räkna S-fasen läser i samma fönster.
  2. Beräkna S / G1-förhållande för varje fönster. Detta bör generera en karta med stora svängningar i S / G1-förhållande längs genomet (Figur 3). En god kontroll för tillförlitligheten TOR mätningarna är att jämföra den här kartan till G1 / G1 förhållande (från två separata mätningar av G1) som bör vara mycket plattare.
  3. Normalisera data till 0 betyder och en SD genom att subtrahera från varje value medelvärdet av alla fönster (exklusive X-kromosomen) och dividera resultatet med standardavvikelsen för S / G1 av alla fönster. Detta görs för att konvertera till z poäng och möjliggöra jämförelser mellan olika experiment.
  4. Ta bort alla gap regioner som anges av UCSC genomet webbläsare liksom varje återstående bland gap fragment innehållande färre än 15 uppgifter fönster.
  5. Jämna de återstående fragmenten med en kubisk utjämning spline via Matlab-funktionen csaps med en parameter av 10 - 16 och interpolera på börvärden 100 kb.
    OBS: Parametrar för utjämning och interpolering bör justeras baserat på djupet av data. Andra lämpliga utjämningsmetoder och funktioner existerar och kan användas.
  6. Efter visuellt bekräftar tillförlitligheten i varje replikera, slå ihop alla läser och beräkna en djupare upplösning profil genom att utföra samma förfarande som beskrivits ovan på dessa data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En typisk dir karta visas i figur 3 för mus embryonala fibroblaster (MEF). Denna figur visar analysprocessen eftersom det visar både de prickar, som är den normaliserade S / G1-förhållande för enskilda fönster (steg 8,3), såväl som den linje som är ett resultat av den kubiska utjämning och interpolering (steg 8,5).

Sådana kartor fånga organisationen av replikeringsprogrammet, som är ett lapptäcke av två typer av ToR områden: i) stora regioner (i storleksordningen en megabas) som replikerar samtidigt (CTR = konstant ToR regioner) vid början, mitten eller slutet av S ; och ii) tidsövergångsregioner (TTRS) där uppdrags förändras gradvis. CTR är förbundna med varandra genom TTRS och tillsammans dessa två typer av replikerings organisation täcka hela genomet.

Trots den relativt låga sekvense c satsning (en läsning varje 300 bp) som används för Tor kartläggning, de resulterande kartorna är ganska robust. Figur 4 visar reproducerbarheten av kartor ToR mellan triplikat av MEF celler jämfört med triplikat av mus pre-B-celler i samma region. Jämförelse mellan dessa kartor möjliggör identifiering av regioner med differentiell ToR som definieras som regioner där skillnaderna i kartorna ToR mellan vävnader är betydligt större än skillnaderna mellan replikat.

figur 2
Figur 2: Protokoll systemet. Schematiskt diagram som beskriver förfarandet för CNR-dir-metoden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

57 / 55157fig3.jpg "/>
Figur 3: representant iska kartor ToR. Visas är uppdrags hela kromosom 1 av MEF celler och en närmare titt på en ~ 50 Mb region. Här visas Z poängen för S / G1 värden i varierande storlek fönster (punkter) och utjämnade data (heldragen linje). Hög S / G1 värden motsvarar tidig replikation medan låga värden motsvarar sent replikering. Pilarna pekar mot exempel på konstanta ToR regioner (CTR, röd) och temporala övergångsregioner (TTRS, grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Reproducerbarhet av upprepningarna. (A) Utjämnad ToR MEF tripletter (blå) jämfört med pre-B tre exemplar (röda) i en 18 Mb region på mus kromosom 1. Orange pilarpeka på exempel på särskiljande regioner mellan de cellinjer. (B) Värme karta över Spearman korrelationer mellan 6 prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CNR-dir kan utföras i princip vilken eukaryot prolifererande cellpopulation som kan delas genom FACS till S och G1-faserna (översikt av Rhind N. och Gilbert DM 20). Den metod som beskrivs här har justerats till däggdjursceller med en genomstorlek av ~ 3 Gb såsom människa och mus. Det behövs små förändringar i CNR-uppdrags protokoll (i förberedelse cell och sekvense djup), för att anpassa den till andra eukaryoter. Uppmärksamhet måste ägnas åt insamlingen av tillräckliga mängder av S-fasceller eftersom det är det hastighetsbegränsande steget. Sålunda bör en preliminär FACS för cellcykeln utföras för att bekräfta att experimentet kan göras och att validera den mängd celler i S-fasen. För celler som uppvisar oregelbundna cellcykler, är det rekommenderat att prestain cellerna med BrdU att upptäcka delande celler, och följ Anti-BrdU tillverkare protokoll tills FACS steg. Vanligtvis celler färgas med 10-20 | iM BrdU i 30 min.

6 celler) rekommenderas för varje replikera för att få> 1 x 10 5 celler i S-fasen. Denna mängd bör ökas när man arbetar med långsamt växande celler, eftersom den procentuella andelen av celler i S-fas är lägre och har således ett för att sortera flera celler för att få en tillräcklig mängd celler i S.

Vid sortering celler, är det viktigt att uppnå bästa möjliga separation av cellerna enligt deras DNA-innehåll och sålunda en låg flödeshastighet rekommenderas. För att maximera den tidsmässiga upplösningen, är det viktigt att samla upp cellerfrån hela S-fasen. Detta uppnås genom att grind S så bred som möjligt (Figur 1). Å andra sidan bör G1 grind vara smal (med början från G1 topp och till vänster, figur 1), för att undvika både under G1 och tidiga S-fas föroreningar.

Ultraljudsbehandling kan utföras genom olika metoder, men det rekommenderas att använda en fokuserad ultraljud som möjliggör en robust och enkel ultraljudsbehandling utan behov av kalibrering av varje experiment. Men när första upprättandet av protokollet i laboratoriet, är det rekommenderat att kalibrera parametrarna för att erhålla en storleksfördelning av 200-700 bp.

Som förklaras i inledningen, finns det två huvudsakliga metoder för genomet hela dir kartläggning - BrdU-IP och CNR-dir. Båda metoderna ger liknande kartor ToR (data visas ej) Trots skillnaderna mellan dem. CNR-dir-metoden är begränsad i dess anrikning sortiment sedan den maximala skillnaden betwesv tidiga och sena regioner är dubbelt, medan med BrdU-IP mycket högre anrikning uppnås sedan början replikering regioner innehåller BrdU nästan bara i början av fraktionen. Å andra sidan är den BrdU-IP-metoden upplösning begränsad av antalet S-fas uppsamlade fraktionerna. I sin vanligaste användningsområdet är endast två fraktioner (tidig kontra sen S) jämförs, vilket resulterar i en kompromiss av den fina tidsupplösning. CNR-dir-metoden ger emellertid en kontinuerlig signal längs hela S-fasen. Dessutom är BrdU-IP-metod baserad på immuno-utfällning som vanligtvis ger en mycket högre bakgrund än CNR-dir-metoden. En annan fördel med CNR-dir metoden är att den kan användas i efterhand för att extrahera dir information från sekvenseringsdata av osynkroniserade kulturer som nyligen beskrivna 21. Slutligen är CNR-uppdrags metod att föredra på grund av dess enkelhet och på grund av det faktum att det kan ned-skalas eftersom det inte grundar sig på IMMUno-utfällning.

Rollen av ToR i komplexa nätverk av genomiska och epigenomiska funktioner återstår att dechiffreras. Den relativa lätthet av CNR-ToR metod möjliggör utbyggnad av befintliga ToR data som ska inkluderas många av de naturliga förhållanden som celler erfarenhet och bör undersökas grundligt och Genome bred. Detta inkluderar olika replikering stressituationer, endoreduplikation samt olika cancer transformationer. Användningen av SNP data och högre sekvense djup kommer också att möjliggöra mätning av uppdrags varje allel separat. Dessutom kommer ytterligare minskning av sekvense kostnad möjliggör ökningen av upplösningen av kartor ToR, som kan ytterligare stöd möjliggöra identifiering av subtila förändringar mellan villkor. Andra framtida applikationer kan åstadkommas genom att förbättra de nuvarande metoderna och tillämpa ToR mätning på ett litet antal celler som gör det möjligt att mäta ToR in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi tackar Oriya Vardi för att få hjälp att generera siffror. Arbetet i IS-gruppen stöddes av Israel Science Foundation (bidrag nr 567/10) och Europeiska forskningsrådet Starting Grant (# 281.306).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS BI (Biological Industries) 02-023-1A
Trypsin-EDTA BI (Biological Industries) 03-052-1B
15 mL conical tube Corning 430790
5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap  BD-Falcon 352235
Ethanol Gadot 64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL Sigma R4875
Propidiom iodide 1 mg/mL Sigma P4170
Parafilm Parafilm PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes  Eppendorf 22431021
BSA Sigma A7906
1.7 mL MaxyClear tube  Axygen MCT-175-C
magnetic beads - Agencourt AMPure XP  Beckman Coulter A63881
Ultrasonicator Covaris M-series  -530092
50 µL microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm Covaris 520096
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Invitrogen Q32854
Electrophoresis 2200 Tape station system Agilent D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina NextSeq system Illumina SY-415-1001
Dneasy kit for DNA purification Qiagen 69504
PureProteom Magnetic Stand Millipore LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC DAKO F7210
FACS sorter BD FACSARIA III
FACS software BD FACSDiva v 8.0.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18, (1), 115-125 (2010).
  2. Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6, (7), e1001011 (2010).
  3. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6, (10), (2008).
  4. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25, (8), 1091-1103 (2015).
  5. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22, (10), 1833-1844 (2012).
  6. Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18, (10), 1562-1570 (2008).
  7. Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24, (1), 64-69 (2014).
  8. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10, (5), e1004319 (2014).
  9. McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25, (7), 647-656 (2003).
  10. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  11. Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44, (9), 4222-4232 (2016).
  12. Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
  13. Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
  14. Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, (1), 25-32 (2003).
  15. Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11, (3), 1217-1225 (1992).
  16. Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
  17. Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401, (6756), 929-932 (1999).
  18. Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. (1993).
  19. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91, (6), 1033-1040 (2012).
  20. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (8), a010132 (2013).
  21. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159, (5), 1015-1026 (2014).
Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).More

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter