Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل Published: February 11, 2017 doi: 10.3791/55159
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 1, 2, 1,4
1Foundation Hubrecht Organoid Technology, 2Department of Pediatric Pulmonology, Regenerative Medicine Centre Utrecht, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Centre Utrecht, 3Department of Stem Cells and Cancer, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 4Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, University Medical Centre Utrecht

Introduction

ويتسبب CF عن طفرات في جين التليف الكيسي الغشاء تصرف المنظم (CFTR) الذي يشفر قناة أنيون الظهارية. CF يؤثر على ما يقرب من 85،000 شخص حول العالم 1. وقد تم تحديد أكثر من 2،000 طفرات CFTR ( www.genet.sickkids.on.ca ). هذا التنوع يفسر جزئيا طائفة واسعة من الظواهر المرض لوحظ ( www.CFTR2.org ) 2 و 3. يتم تعريف يستند ستة فصول من طفرات CFTR على تأثيرها على التعبير البروتين CFTR وظيفة: (I) لا التوليف، (الثاني) الاتجار ضعاف، (الثالث) المعيبة قناة النابضة، (رابعا) تصرف تتغير (V) مستويات عادة انخفاض الأداء CFTR، و (السادس) خلية ضعف استقرار سطح 4. على الرغم من أن الطفرات CFTR المشتركة ومدروسة، وظيفة CFTR والعلاقة مع الحالة السريرية لا تزال poorlفهم ذ على مستوى الفرد، لا سيما بالنسبة لمجموعة كبيرة من نادرة "اليتيمة" الطفرات ( www.CFTR2.org ) 1 و 3.

مؤخرا، تم تطوير عقاقير تستهدف بروتين CFTR في أزياء طفرة معينة. فئتين من CFTR الأدوية التي تستهدف البروتينات هي حاليا في الاستخدام السريري ولها طرق متميزة للعمل. Potentiators، مثل VX-770، وتعزيز الاحتمال مفتوحا من CFTR الطافرة المحلية apically وتعمل مباشرة على إضافة لخلايا 5. المصححين، مثل VX-809، واستعادة الاتجار اندوبلازمية مترجمة شبكية تتجمع CFTR وتتطلب مرحلة ما قبل الحضانة مع ويلاحظ الخلايا قبل آثار 6. وpotentiator CFTR، VX-770، وقد تم تسجيل للمواد الدراسية مع الطفرة G551D 7، 8، فضلا عن ثمانية أخرىCFTR النابضة الطفرات، بما في ذلك S1251N 9؛ معا، وتتم هذه الطفرات بنسبة 5٪ من جميع المواد CF. وقد أشارت التجارب السريرية الأخرى التي VX-770، جنبا إلى جنب مع مصحح VX-809، ويقتصر آثار بعد هامة على وظيفة الرئة ويؤدي إلى انخفاض في معدلات تفاقم في مواضيع متماثل لطفرة F508del التي يحملها 45-50٪ من المرضى 10، 11.

التجارب السريرية التقليدية لتحديد المواضيع التي تستجيب للأدوية داخل 50٪ المتبقية من مرضى التليف الكيسي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا وليست ذات جدوى بالنسبة للأفراد مع الأنماط الوراثية CFTR نادرة للغاية. الرواية، وطرق شخصية فعالة من حيث التكلفة ضرورية لتتناسب مع عدد متزايد من جهري CFTR إلى الأفراد تحمل أي نوع من CFTR التحور. حتى الآن، وقد استرشد إدراج محاكمة مجموعات المرضى تحمل طفرات CFTR محددة من الدراسات باستخدام متحولة ترنسفكأيشن CFTR الجينات في ح نظم خلايا eterologous، تليها الدراسات الكهربية في غرفة أوسينج 5 و 6 و 12. ونظرا لعدم وجود نماذج CF الحيوانية الكافية والدراسات فعالية الدواء في الخلايا الظهارية القصبية متباينة الهواء السائل واجهة المستمدة من المواد يزدرع CF الرئة استخدمت لتطوير العقاقير 13 و 14 و 15. ومع ذلك، فإن محدودية توافر أنسجة الرئة يزدرع وإجراءات الغازية للحصول على خلايا الشعب الهوائية من المواد دون المرض في نهاية المرحلة تعرقل تحليل طفرات CFTR أقل شيوعا ومنع اختبار المخدرات بطريقة شخصية. للتغلب على هذه القيود، الأنسجة "سهولة الوصول"، مثل organoids القولون والمستقيم، وخلايا الشعب الهوائية الأنفية، وخلايا الشعب الهوائية المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها، ويجري حاليا التنقيب فيها عن العلاج بالعقاقير شخصية.

= "jove_content"> سابقا، أنشأنا بروتوكولات للخلايا الجذعية ثقافة الظهارية من أي جهاز الهضمي في شكل 3D organoids 16 و 17. عوامل النمو في القولون البشري / المستقيم، والظروف ثقافة تنطوي على تعريف (طلائي عامل النمو (EGF)، الغاسترين، WNT-3A، R-spondin 3 (Rspo3)، ورأس) جنبا إلى جنب مع جزيئات صغيرة (نيكوتيناميد، A83-01، وSB202190) في مصفوفة الغشاء القاعدي. في ظل هذه الظروف، والخلايا الجذعية واحدة أو أجزاء الأنسجة الصغيرة على النمو للخروج الى مغلقة، الكيسي، هياكل 3D التي شكلتها ظهارة درجة عالية من الاستقطاب مع الجانب القاعدي لها موجهة نحو الخارج. تظهر جميع أنواع الخلايا عادة في النسب والمواقف المعتادة. Organoids يمكن توسيعها على مدى فترات زمنية طويلة بسبب عرقلة الميكانيكية الأسبوعية وإعادة الطلاء. هم جينيا ومستقر ظاهريا، ويمكن تخزينها، مما يتيح التوسع على المدى الطويل والحيوي المصرفي 17. وهي قابلة للجميع التلاعب القياسية الخلايا البيولوجية / الجينية والتقنيات التحليلية وضعت لخطوط الخلايا 2D 18.

نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن وظيفة CFTR يمكن قياسها بسهولة في organoids القولون والمستقيم في يسببها forskolin تورم (FIS) فحص 19 و 20. عندما تتعرض لforskolin (FSK) أو، بدلا من ذلك، لبكتيريا الكوليرا، organoids زيادة أعدادها بسرعة الأدينوزين الأدينوزين الحلقي (المخيم) المستويات، والتي تؤدي بدورها في افتتاح قناة CFTR 19. سوف Organoids من الأفراد الأصحاء، أو من الموضوعات مع طفرات CFTR المرتبطة مع وظيفة المتبقية، تضخم في وقت لاحق نتيجة لايون ونقل المياه إلى التجويف عضي، أي ما يعادل في المختبر من الإسهال إفرازية. وقد أظهرت استجابة الجبهة الإسلامية للإنقاذ من organoids القولون والمستقيم في السابق أن تكون تماما CFTR التي تعتمد، كما يتضح من organoids المستمدة من الأفراد CFTR باطل لالثانية عن طريق استخدام مثبطات CFTR محدد بالعقاقير 19. مجموعات البيانات موضوعا محددا كبيرة يمكن استخلاصها في غضون عدة أسابيع بعد أخذ الخزعة.

للمقايسة الجبهة الإسلامية للإنقاذ وصفها في التفاصيل هنا، organoids ومثقف من الخزعات المستقيم التي يمكن الحصول عليها في أي سن وفقط مع عدم الراحة محدود 21. و passaged Organoids أسبوعيا بسبب عرقلة الميكانيكية في الأقبية واحدة أن ختم بسهولة وتشكيل organoids الجديد. لتشغيل الفحص الجبهة الإسلامية للإنقاذ، ~ ومطلي 30-80 من هذه organoids القليل تعطلت في كل بئر من لوحة 96-جيدا 19. في يوم الفحص، ملطخة organoids مع الأخضر calcein، وهي خلايا قابلة للاختراق صبغة الفلورسنت التي يتم الاحتفاظ بها داخل الخلايا الحية، وتسهيل التصوير الحي. ثم، يضاف FSK، الأمر الذي يثير مخيم داخل الخلايا، وبالتالي ينشط CFTR من أجل تحفيز تورم عضوي الشكل. تضاف Potentiators التي تعمل على CFTR قمي في وقت واحد ثإيث forskolin، في حين أن المصححين أن استعادة الاتجار CFTR تضاف 24 ساعة قبل إضافة FSK. وكميا تورم عضوي الشكل عن طريق تحليل الصور الآلي التي تحسب الزيادة النسبية في مساحة إجمالية قدرها كافة الكائنات الفلورسنت لكل نقطة زمنية على إضافة forskolin.

عضي 3D تورم يوفر مزايا وعيوب على قراءات CFTR الكهربية الموجودة في 2D خلايا الشعب الهوائية مثقف في غرفة أوسينج. والميزة الرئيسية هي مرت من فحص التورم. الخلايا مثقف ويعاير باستخدام نوع واحد من مستنبت، ويمكن للفني من ذوي الخبرة ثقافة ما يصل الى 25 عينة عضي على أساس أسبوعي بينما قياس ما يقرب من 1200 نقطة البيانات أسبوعيا في 12 عينات من المرضى. نحن تقليديا اكتب حالة تجريبية واحدة من القياسات مكررة أو ثلاث نسخ لكل لوحة، وتكرار مثل هذه القياسات في ثلاث نقاط فترة حضانة مستقلة. في المجموع، ما يقرب من 300-500 قثم يتم قياس إنجل عضي الهياكل في حالة تجريبية، الأمر الذي يؤدي إلى قياسات دقيقة للغاية من وظيفة CFTR مع تقلب فنيا محدودا. هذه الدقة تتيح لنا أن تحدد بوضوح الاختلافات في وظيفة المتبقية وردا على جهري CFTR وتتيح لنا اختيار ما يصل بسهولة آثار خلفية وراثية بين المرضى الذين يحملون طفرات CFTR متطابقة 19، 22، 23، 24، 25. جودة البيانات التي يمكن تقييمها بسهولة من الصور المجهر. بينما الجبهة الإسلامية للإنقاذ هو تماما CFTR التي تعتمد، وهو قياس النتيجة غير المباشرة لوظيفة CFTR، للخروج قراءة الناجم عن اقتران النقل أيون لنقل السوائل. وهذا يتناقض مع القياسات وظيفة CFTR مباشرة في غرف Ussing، التي تقيس بطريق الظهارة التيارات أيون 26. غرف Ussing تسمح حدد تحفيز ج قمي أو basolateralompartments (الذي فحص عضوي الشكل لا يسمح)؛ بواسطة permeabilizing الأغشية basolateral، والقمي تعتمد على CFTR إفراز أنيون يمكن قياسها بشكل انتقائي (27).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام الأنسجة البشرية الموصوفة هنا من قبل اللجنة الأخلاقية في جامعة مركز اوتريخت الطبي (UMCU، TcBio # 14-008). تم الحصول على الموافقة المسبقة لجمع الأنسجة، وتوليد وتخزين واستخدام organoids من المرضى في مستشفى (WKZ) -UMCU يلهيلمينا الأطفال.

الرجعية مستهلكات أدوات
غطاء الجريان الصفيحي 15 و 50 مل أنابيب مخروطية زايس LSM 800 - زين 2 (الأزرق طبعة) برنامج لقياس الصور
CO 2 حاضنة أنابيب microfuge برنامج مايكروسوفت إكسل
مجهر الثقافة الخلية (ضوء المجهر / البصرية) 0.22 ميكرون مرشحات
جهاز الطرد المركزي الماصات المصلية
المتداول شاكر نصائح مرشح Micropipette
4 ° C الغرفة أو 4 درجات مئوية الثلاجة لحاضنة Cryovials
CoolCell خلية تجميد الحاويات
Pipettor المصلي
Micropippette (1000 و 200 و 20 ميكرولتر)
Viaflo كرر ماصة
(خلية حية) متحد البؤر مجهر
الحاسوب
خزان النتروجين السائل
متعددة القنوات (200 ميكرولتر)

1. الكواشف إعداد للثقافة

"jove_content"> ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وفقا للمبادئ التوجيهية القياسية للعمل مع الثقافات الخلية. من أجل تسهيل تشكيل قطرات لطيفة من الطابق السفلي غشاء المصفوفة، والحفاظ على المخزون قبل تحسنت من 96-، 24-، و 6 لوحات جيدة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.

  1. إعداد المتوسطة القاعدية
    ملاحظة: متوسطة بصل (BM) يشير إلى المتقدم Dulbecco لتعديل النسر متوسطة مع هام في خليط المغذيات F-12 (الإعلان-DF) تستكمل مع 4- (2-hydroxyethil) حمض -1piperazineethanesulfonic (HEPES)، الجلوتامين، والبنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا).
    1. في زجاجة 500 مل الإعلان-DF المتوسطة، إضافة 5 مل من 200 ملي الجلوتامين، 5 مل من 1 M HEPES، و 5 مل من ركلة جزاء حلول / بكتيريا (10،000 U / مل، 10000 ميكروغرام / مل).
    2. متجر BM في الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع على الأقل.
  2. إعداد المتوسطة مكيفة WNT-3A-
    ملاحظة: يتم المتوسطة مكيفة WNT-3A-في بيت النقيبز خط الخلية L-WNT-3A وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    1. لحصاد المتوسطة مكيفة WNT-3A، جمع المتوسطة تتعرض لالخلايا لمدة أسبوع واحد وتدور عليه لمدة 5 دقائق في 450 x ج لإزالة الخلايا العائمة.
    2. تصفية المتوسطة مكيفة WNT-3A-من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتقسيمه إلى 40 مل قسامات في أنابيب مخروطية 50 مل. تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 4 أشهر على الأقل من دون خسارة في النشاط.
    3. اختبار نشاط المتوسطة مكيفة WNT-3A في فحص TOP / غندورة باستخدام الكلى الجنينية البشرية (كلوة) -293 خلايا transfected مع الأعلى- غندورة و-وسيفيراز وTK- Renilla وقياسها مع Renilla -luciferase عدة الفحص وفقا ل تعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: TOP-وسيفيراز هو البلازميد مراسل يحتوي على النوع البري المناطق ملزمة تريليون قدم مكعب. إذا كان المتوسطة مكيفة WNT-3A-نشطا، يتم تنشيط إشارات Wnt الكنسي. بيتا-كاتينين translocates الى نواة لربط الطرافةح TCF / LEF عوامل النسخ وينشط النسخ لمراسل وسيفيراز، الأمر الذي أدى إلى زيادة في luciferase النشاط النسبي عند إضافة الركيزة. يتم استخدام-وسيفيراز غندورة كعنصر تحكم السلبية لأن TCF المناطق ملزم المنبع من الجين وسيفيراز وتحور.
  3. إعداد المتوسطة القولون
    ملاحظة: إعداد وتمييع كل عوامل النمو والكواشف وفقا لتوصيات الصانعين. استخدام قسامات صغيرة الحجم لتجنب تجميد أذاب دورات. عوامل النمو وظيفية أساسية للنتائج.
    1. إعداد المتوسطة القولون (CM) من خلال استكمال BM مع 1X B27، 1.25 ملي N-أسيتيل، 50 نانوغرام / مل hEGF، 5 نانومتر الغاسترين، 10 ملي نيكوتيناميد، 300 نانوغرام / مل hRspo3، 100 نانوغرام / مل hNoggin، 500 ميكرومتر A83-01 و 10 ميكرومتر SB202190، و 100 ميكروغرام / مل من مضادات الميكروبات للخلايا الأولية.
    2. تقسيم سم إلى قسامات وتجميدها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أشهر. ذوبان الجليد في قسامات لإعداد القولون الكاملالمتوسطة (FCM) وذلك بإضافة 50٪ المتوسطة WNT-3A-conditoned إلى سم. مخزن FCM يصل إلى 7 أيام في 4 درجات مئوية دون خسارة في النشاط.
    3. لإنشاء ثقافة عضي من الخزعات المستقيم، تكملة FCM مع 50 ميكروغرام / مل فانكومايسين، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، و 10 ميكرومتر المرتبطة رو ملفوف لفائف تشكيل البروتين سيرين / ثريونين كيناز (RhoKi). استخدام هذه الوسيلة، ودعا المتوسطة العزلة (IM)، فقط لأول 2-3 أيام في الثقافة.
  4. تحضير محلول المخزون EDTA
    1. تحضير 0.5 M ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، ودرجة الحموضة 8، في عالى النقاء H 2 O، تعقيمها مع مرشح 0.22 ميكرون.
  5. التلاعب في الطابق السفلي غشاء مصفوفة
    1. إعداد مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) وفقا لتوصية الشركة الصانعة.
    2. ذوبان الجليد BMM بين عشية وضحاها على الجليد.
    3. عند نقل BMM من الزجاجة إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، واستخدامماصة 5 مل و 15 مل أنبوب مخروطي قبل تبريده عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    4. إذابة مرة واحدة، وتخزين BMM في الثلاجة على 4 درجات مئوية، واحتضان على الجليد لمدة 30-60 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
      ملاحظة: من أجل الحصول على أفضل النتائج، يجب أن يكون BMM البارد ويخلط جيدا قبل تضمين الأقبية أو organoids.

2. إنشاء Organoids القولون من خزعة المريض CF

ملاحظة: بعد جمع الأنسجة، فمن المهم للحفاظ على عينة على الجليد في المياه المالحة، Dulbecco والفوسفات التخزين المؤقت المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ (DPBS)، أو BM. من المستحسن معالجة سريعة من الخزعات، لكن ثبت أنه من الممكن إنشاء الثقافات عضي من الخزعات المخزنة على الجليد لمدة تصل إلى 7 أيام.

  1. السماح الخزعات تستقر في أسفل أنبوب مخروطي 15 مل وإزالة طاف.
  2. إضافة 10 مل من DPBS إلى الخزعات وماصة صعودا وهبوطا 10-20 مرة باستخدام ماصة 10 مل.
    ملاحظة: تحتاج ماصة ليكون ما قبل مبلل مع BM قبل pipetting لخزعة.
  3. السماح الخزعات تستقر في القاع، وإزالة طاف.
  4. كرر الخطوات من 2.2 و 2.3 4-5 مرات حتى طاف هو واضح.
  5. إضافة 10 مل من DBPS و 200 ميكرولتر EDTA (0.5 M) إلى الخزعات ووضع أنبوب على منصة أنبوب هزاز لل60-120 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: قد تختلف فترة حضانة لكل مريض. إذا تم إصدارها الأقبية، DPBS يصبح غائما. ويمكن الانتهاء من حضانة EDTA عندما أقبية يمكن ملاحظتها تحت المجهر.
  6. السماح الخبايا إلى تسوية. تجاهل طاف.
  7. تناول 2 مل من BM وإضافته إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. يهز هذا الأنبوب الجديد يدويا في مثل هذه الطريقة التي يتم تغطيتها من الداخل مع BM.
  8. باستخدام ماصة قبل مبلل مع BM، إضافة 2 مل من DPBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخزعات وماصة صعودا وهبوطا 10-20 مرة.
  9. السماح للخزعات ليستقر ونقل DPBS مع الخبايا إلى الجديدالأنبوب الذي يحتوي على 2 مل من BM التي أعدت في الخطوة 2.7.
  10. كرر الخطوات من 2.8 و 2.9 حتى يتم الإفراج عن أي المزيد من الخبايا.
  11. تدور الخبايا إلى أسفل في 130 x ج لمدة 5 دقائق في 8 درجات مئوية.
  12. في غضون ذلك، نقل IM إلى مجلس الوزراء السلامة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  13. تجاهل طاف وإضافة 10 مل من BM لبيليه سرداب وكرر الخطوة 2.11.
  14. resuspend الكرية في 1 مل من BM. تأخذ 5-10 ميكرولتر وحساب عدد من الأقبية التي كتبها العين تحت المجهر.
  15. تدور الخبايا إلى أسفل في 130 x ج لمدة 5 دقائق في 8 درجات مئوية.
  16. إزالة طاف و resuspend بيليه في 55٪ BMM (ت BMM إلى IM الخامس).
    ملاحظة: يتم معلق الخبايا في حجم المماثل من 55٪ BMM في 1 سرداب في ميكرولتر. إذا كان هناك ما يكفي من الأقبية، وحجم الحد الأدنى من BMM 40 ميكرولتر.
  17. بذر، ماصة 35 ميكرولتر لكل بئر (في 24 لوحة جيدا). تقسيم 35 ميكرولتر من BMM إلى 3-5 قطرات على حدة من أجل تحسين نشر غرووث العوامل في BMM. لا خلق فقاعات.
  18. وضع وترك لوحة رأسا على عقب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لBMM لترسيخ.
  19. إضافة 500 ميكرولتر من IM لكل بئر وابقائه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  20. تحديث المتوسطة كل 2-3 أيام. إزالة المتوسطة من العمر من قبل pipetting خارج مع ماصة P1000، وترك BMM قطرات سليمة. بعناية إضافة FCM قبل pipetting في جانب البئر، وليس مباشرة على BMM يسقط.
    ملاحظة: إذا صدر أي الأقبية في بروتوكول العزلة، أجهزة الطرد المركزي لطاف، ويغسل بيليه 2-3 مرات مع BM، و resuspend في BMM. أخذ الأنسجة المتبقية وتقطع الى قطع صغيرة مع أسلاك شائكة. جمع هذه في أنبوب مخروطي 15 مل، الطرد المركزي لهم، و resuspend لهم في نفس BMM. إن وجدت الخلايا الجذعية الظهارية موجودة، وهذه أيضا إنشاء organoids.

3. الركض من Organoids القولون للصيانة، تجمد، ولskolin الناجم عن تورم الفحص (FIS)

ملاحظة: كل ثقافة عضي ديها وقت مضاعفة الخاص بها. عادة، organoids CF القولون والمستقيم يمكن توسيع 1: 3-1: 5 مرات كل 7-10 أيام. إنها علامة جيدة إذا لوحظ الهياكل الناشئة. organoids القولون CF هي أقل الكيسي (الشكل 2A - 2C) من organoids العادي القولون والمستقيم (الشكل 2D). لإنشاء وصيانة، organoids ومثقف في 24 لوحات جيدا. لتجميد، في 6 لوحات بشكل جيد؛ وللمقايسة الجبهة الإسلامية للإنقاذ، في باتيس 96-جيدا.

  1. الركض من Organoids
    1. الحفاظ على BMM على الجليد لمدة 30-60 دقيقة على الأقل قبل استخدامه.
    2. الحفاظ على FCM على RT لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل استخدامه.
    3. تسمية أنبوب واحد 15 مل المخروطية مع اسم العينة وأنبوب آخر باسم "غسلها".
    4. بعناية نضح المتوسط ​​من الآبار باستخدام ماصة P1000 من دون إزعاج BMM يسقط.
    5. إضافة 1 مل من BM إلى 1 جيدا وبREAK حتى BMM قطرات باستخدام ماصة P1000. نقل هذا 1 مل إلى 15 مل أنبوب مخروطي مع اسم العينة.
    6. يغسل جيدا مع 1 مل أخرى من BM وتحويلها إلى نفس أنبوب 15 مل.
    7. كرر الخطوات من 3.1.5 و 3.1.6 مع 5 المزيد من الآبار (تصل إلى 6 آبار من 24 لوحة جيدا وغسلها في واحد 15 مل أنبوب مخروطي).
    8. ملء أنبوب يصل إلى 12 مل مع BM. ماصة صعودا وهبوطا باستخدام مل ماصة المبللة قبل 5.
    9. تدور في 85 x ج لمدة 5 دقائق في 8 درجات مئوية.
    10. تجاهل طاف وإضافة 1 مل من BM لبيليه. بنفس طرف P1000 ماصة، تناول طرف P10 بدون فلتر، وماصة صعودا وهبوطا من 20 مرات. تجاهل كلا P1000 ونصائح P10.
    11. إضافة 4 مل من BM مع ماصة 5 مل وعقد أنبوب يميل في حوالي 70 درجة من رأسي إلى جانب واحد. قبل الرطب طرف P1000 الجديد وتخلط بقوة 2-3 مرات مع P1000 (حجم 1 مل).
    12. العد إلى 10 في حين تبقى في وضع مائل، وجمع الطبقة العليا بعناية ثإيث ماصة P1000، ونقل 4 × 1 مل في أنبوب وصفت بانها "غسلها".
    13. مراقبة organoids تسوية إلى أسفل في أنبوب مائل. سوف organoids undisrupted وقطع أكبر تنزل الى القاع. أجهزة الطرد المركزي ال 15 مل "غسلها" أنبوب لمدة 5 دقائق في 85 x ج و 8 درجات مئوية.
    14. تجاهل طاف وإضافة الكمية المطلوبة من المتوسط ​​وBMM لبيليه عضوي الشكل إلى تركيز النهائي من 55٪ BMM. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا دون خلق فقاعات (الشكل 3B).
      ملاحظة: ويتحقق كثافة جيدة من قبل البذر 25-30 organoids في 10 ميكرولتر من BMM.
    15. اتبع الخطوات 2،17-2،19.
  2. الركض لتجميد
    1. الحفاظ على BM في الثلج لمدة 30-60 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. الحفاظ على FCM على RT لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل الاستخدام.
    2. إعداد FCM تستكمل مع RhoKi (الخطوة 1.3.3).
    3. خذ التربسين من الثلاجة واتركه على RT لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    4. اتبع الخطوات 3.1.5-3.1.10.
    5. إزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن، إضافة 4 مل من التربسين، ودوامة لمدة 30 ثانية.
    6. وضع الأنبوب في حمام ماء دافئ عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ودوامة بقوة لمدة 30 ثانية.
    7. تفقد الحل في أنبوب. إذا organoids سليمة لا تزال مرئية تحت المجهر، كرر الخطوة 3.2.7.
    8. عندما تتعطل في organoids، إضافة 8 مل من BM لتحييد التربسين وماصة 10 مرات.
    9. تدور لمدة 3 دقائق في 450 x ج في 8 درجات مئوية.
    10. تجاهل طاف وإضافة الكمية المطلوبة من المتوسط ​​وBMM إلى organoids للتوصل الى حل BMM 55٪. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا دون خلق فقاعات.
      ملاحظة: للحصول على تجميد، يجب المصنف organoids في نسبة 1: 1 بعد trypsinization.
    11. البذور 250 ميكرولتر في بئر واحدة من 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة استعد مسبقا، إنتاج صغيرة، قطرات فصل من ~ 10 ميكرولتر. وضع لوحة رأسا على عقب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية وتتركBMM لترسيخ لمدة 20-30 دقيقة.
    12. إضافة 2.5 مل من FCM طازج + RhoKi في كل لوحة 6 جيدا بشكل جيد ونقل لوحة إلى الحاضنة (الشكل 3C).
  3. الركض Organoids لفحص الجبهة الإسلامية للإنقاذ
    ملاحظة: اعتمادا على عدد وحجم organoids، ما بين 4 و 6 آبار من 24 لوحة جيدا ما يكفي لبذر 27 بئرا لوحة 96-جيدا.
    1. معالجة organoids كما هو موضح من الخطوات 3.1-3.1.13.
    2. Resuspend وبيليه في 120 ميكرولتر من 50٪ BMM.
    3. تأكيد عدد من organoids (30-50) في قطرة BMM 3 ميكرولتر تحت المجهر.
    4. لوحة للorganoids باستخدام قطرة واحدة من 3 ميكرولتر وضعت في منتصف كل بئر من بات 96-جيدا.
    5. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لBMM لترسيخ؛ ويرد المزيد من الخطوات في الخطوة 6.1.1.

4. تجميد القولون CF Organoids

ملاحظة: الجهازالكويكبات على استعداد لتجميد منصبه بعد 1-2 أيام trypsinization وزراعة، لذلك سوف يكون organoids تزال صغيرة، مما يزيد من كفاءة البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد.

  1. إضافة 1 مل من BM وتفريق BMM قطرات باستخدام ماصة P1000. نقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  2. يغسل جيدا مع 1 مل أخرى من BM ونقل إلى نفس أنبوب 15 مل.
  3. كرر الخطوات من 4.1 و 4.2 مع جميع الآبار.
    ملاحظة: لتجنب زيادة BMM، يتم تجميع 3 آبار لوحة 6 جيدا في أنبوب واحد 15 مل.
  4. ملء أنبوب 15 مل تحتوي على organoids مع 12 مل من BM البارد وماصة صعودا وهبوطا مع ماصة 5 مل. ترك الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق.
  5. تدور لمدة 3 دقائق في 450 x ج و 8 درجة مئوية وإزالة طاف.
  6. حل بيليه من organoids مع تجميد المتوسطة وماصة صعودا وهبوطا ل resuspend صحيح organoids.
    ملاحظة: يتم استخدام 500 ميكرولتر من تجميد المتوسطة لكل 100 ميكرولتر من BMM.
  7. باستخدام الماصة 5 مل، ونقل 0.5 مل منorganoids معلق في تجميد المتوسطة إلى معقمة قارورة المبردة.
  8. نقل قوارير إلى حاوية زنزانة شديدة البرودة ووضعها في -80 درجة مئوية.
  9. بعد 24 ساعة، ونقل قوارير للتخزين في النيتروجين السائل.

5. إنشاء الثقافات من Organoids المجمدة

ملاحظة: ذوبان الجليد في BMM على الجليد والحفاظ على الجليد. دع BM الوصول RT، وتدفئة قسامة 10 مل إلى 37 درجة مئوية قبل البدء في إجراءات ذوبان cryovial واحد.

  1. ذوبان الجليد في قارورة بسرعة عن طريق التحريض في 37 ° C حمام الماء حتى لا يزال هناك مادة المجمدة قليلا.
  2. نقل organoids إذابة إلى أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام ماصة P1000.
  3. فورا بعد، إضافة 1 مل من قطرة BM الحار قطرة في حين هز الجزء السفلي من الأنبوب. حالما يتم إضافة 1 مل من المتوسط، مزيج بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات لتخفيف المتوسطة التجميد.
  4. ببطء (قطرة قطرة) إضافة 9 مل من BM الحار المآخذ الكهربائية أنبوب مخروطيining وorganoids. عكس عدة مرات.
  5. تدور تعليق خلية لمدة 3 دقائق في 85 x ج و 8 درجات مئوية.
  6. تجاهل طاف بعناية من دون إزعاج بيليه. Resuspend وعضي في 90 ميكرولتر من FCM تستكمل مع RhoKi (الخطوة 1.3.3). ثم، إضافة 110 ميكرولتر من BMM.
  7. إضافة 35 ميكرولتر من كل بئر من 24 لوحة جيدا استعد مسبقا، مما يجعل صغيرة، قطرات فصل.
  8. نقل لوحة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية، وترك لوحة رأسا على عقب لمدة 20-30 دقيقة.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من FCM مع RhoKi إلى كل بئر ونقل لوحة العودة إلى الحاضنة (الشكل 4A - 4C).
  10. مرة واحدة قد تعافى organoids بشكل صحيح من الذوبان، ويخفف بمزيد من BMM ذلك كل 10 ميكرولتر من BMM يحتوي على 25-30 organoids. هذا الإجراء يمكن أن يعمل 2-3 أيام بعد ذوبان (الشكل 4D - 4G) ويضمن النمو السليم للعضي.

6. Forskolin الناجم عن تورم ويقول (FIS)

ملاحظة: FSK المعايرة تسمح لقياس CFTR ظيفة المتبقية. لتعديل CFTR، تتعرض organoids إلى مصحح معين (على سبيل المثال، VX-809) و / أو potentiator (على سبيل المثال، VX-770)، اعتمادا على النمط الجيني. عادة، يتم إضافة VX-809 18-24 ساعة قبل قياس، بينما تضاف VX-770 وFSK الحق قبل بدء القياسات. كن على علم بأن بعض جهري (المصححين / potentiators) يمكن ربط سطح البلاستيك لوحة الفحص.

  1. طلاء للفحص
    وaliquoted VX-809 أسهم في 20 ملي وتخزينها في -80 ° C: ملاحظة. عندما يذوب، وترك في RT وحماية من ضوء.
    1. معالجة organoids كما هو موضح في القسم 3.3.
    2. إذا اختبار مصحح VX-809، وإعداد منحنى الاستجابة للجرعة في يثلث مع التركيزات التالية: 0.0003، 0.003، 0.03، 0.3، 3.0، و 30 ميكرومتر. إعداد التخفيفات في FCM.
    3. لوحة 96-جيدا، إضافة إما 100 μ؛ ل من FCM مع VX-809 تركيز أو 100 ميكرولتر كل من FCM فقط واحتضان لوحة.
  2. قياس الفحص
    ملاحظة: يتم aliquoted VX-770 أسهم بنسبة 20 ملم، في حين FSK هو في 10 ملم. يتم تخزين كل من في -80 درجة مئوية. عندما يذوب، وترك في درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء.
    1. خذ قنينة من calcein وDMSO وترك في RT لمدة 15 دقيقة.
    2. إضافة 5.1 ميكرولتر من DMSO إلى قارورة حيث يتم توفير calcein على شكل مسحوق، إذا فتحها. خلاف ذلك، استخدم قارورة calcein معلق بالفعل تحتوي على 2.5 ميكرولتر من calcein.
    3. إضافة 2.5 ميكرولتر من calcein إلى 580 ميكرولتر من BM في أنبوب 1.5 مل وتسميته.
    4. إضافة 10 ميكرولتر من هذا الحل صبغ (BM + calcein) لكل جيدا باستخدام تكرار ماصة.
    5. و resuspend مرة واحدة مع متعددة لضمان أن الصبغة يخلط جيدا.
    6. احتضان لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    7. أثناء الحضانة calcein، البدء في إعداد FSKوالحلول VX-770، إذا لزم الأمر.
    8. في حالة استخدام potentiator VX-770، وإعداد منحنى الاستجابة للجرعة في ثلاث نسخ مع التركيزات التالية: 0.0003، 0.003، 0.03، 0.3، 3.0، و 30 ميكرومتر. في حالة المعايرة FSK، وتركيزات هي: 0، 0.008، 0.02، 0.05، 0.12، 0.32، 0.8، 2.0، و 5.0 ميكرومتر. إعداد التخفيفات في BM.
      ملاحظة: للحصول على FSK، VX-770، أو أي عقار آخر وأضاف في اليوم الثاني، يجب أن يكون مستعدا التخفيفات في التركيز النهائي 2X، منذ 100 ميكرولتر من FSK ستضاف / المخدرات المعايرة حل كل بئر، والذي يحتوي بالفعل على 100 ميكرولتر من FCM.
    9. نقل FSK و VX-770 حلول، ماصة P200، ونصائح لغرفة المجهر.
    10. لتصوير فحص الجبهة الإسلامية للإنقاذ، واستخدام يعيش التصوير الخلية متحد البؤر المجهر مجهزة مرحلة الآلي، وغرفة ساخنة، وتدفق CO 2.
      ملاحظة: الخطوات التالية تشير إلى المجهر معين. وينبغي أن تطبق على الاجهزة المختلفة لالمجاهر الأخرى التالية الشركة المصنعةتعليمات.
    11. وضع لوحة 96-جيدا في حامل لوحة.
    12. أدخل الإعدادات مبائر للتصوير.
      1. مسبقا الأداة التصوير الحية إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، والسماح للغرفة ما قبل احتضان لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل قياس.
      2. استخدام الخيار "النظام الذكي" لتحديد المسار اليكسا فلور-488.
      3. تعيين عدسة 5X ومنطقة المسح الضوئي إلى 0.6X للتصغير والتقاط البئر كله.
      4. التكيف مع حساسية قوة الليزر وكاشف لتمكين الكشف عن الأمثل للorganoids المسمى calcein الأخضر على مر الخلفية. ويمكن زيادة الثقب إلى 130 ميكرون والمتوسط ​​صورة يمكن وضعها في 2.
      5. تعيين عمق بت في 8 و حجم الإطار إلى 512 × 512.
      6. استخدام الخيار سلسلة زمنية لضبط قياس الوقت، والتردد، وفترات.
        ملاحظة: مقترح لإجراء القياسات الدورية: 1 ساعة 10 دقيقة مع فاصل: دورات = 7 (دورة 1 هو T = 0). لقياس انخفاض التورم، ORGAnoids يمكن تصوير لمدة تصل إلى 3 ساعات.
      7. استخدام الخيار البلاط لتحديد مواقع كل بئر على حدة يدويا.
    13. إضافة 100 ميكرولتر من FSK و / أو VX-770 حلول للآبار المقابلة، وفقا لنفس النظام والقياس. البدء في إضافة الحلول في أول تصويرها بشكل جيد وتواصل مع النظام التصوير.
    14. بدء القياس.
    15. بعد الانتهاء من التجربة، وحفظ الملف.
  3. تحليل الجبهة الإسلامية للإنقاذ بيانات الفحص
    1. إنشاء ماكرو "تحليل عضوي الشكل" لتحليل البيانات للمقايسة الجبهة الإسلامية للإنقاذ باستخدام أداة التحليل في صورة برامج التحليل أن تعترف جميع الهياكل تصويرها من خلال المسار اليكسا-488 ويملأ الهياكل التي تم تحديدها لحساب الزيادة من إجمالي مساحة عضي على نقاط زمنية مختلفة.
    2. فتح ملف البيانات مع الصور المكتسبة في برنامج تحليل الصور.
    3. حدد الماكرو لتحليل عضوي الشكل.
      4. <لى> تعيين عتبة لتحقيق التوازن في نسبة الإشارة إلى الضوضاء في بئر واحدة في نقطة زمنية 1 والتأكد من أن جميع الهياكل عضي معترف بها وشغلها.
      1. تحقق في 4-6 الآبار لمعرفة ما إذا كان يتم إدراج جميع الهياكل أيضا في نقطة زمنية 7. تعديل طفيف عتبة لضمان أن الإشارات الخلفية في نقطة زمنية 7 لا يتم التعرف عن الهياكل (عتبة معينة قد تتغير إلى حد ما بين التجارب).
    4. ضبط معايير الحد الأدنى من حجم منطقة من الأجسام المعترف بها إلى 1000 ميكرون 2.
    5. اضغط على "تحليل" للبدء. ويأخذ التحليل حوالي 3 دقائق، اعتمادا على البرمجيات المستخدمة.
    6. عند الانتهاء من البرنامج، انتقل إلى "إنشاء جدول" وحدد البيانات التالية: حسنا (ينبغي أن تزيد الجدول في هذا النظام) أرقام ونقاط الوقت، وتبلغ المساحة الإجمالية لكل بئر.
    7. حفظ الملف ك .xlm للتصدير إلى برنامج جدول بيانات.
    8. في هذا البرنامج، وحساب الزيادة النسبية في المنطقة في أهلا وسهلال من خلال تحديد مجال نقطة زمنية 1 في 100٪. حساب المساحة تحت منحنى (AUC) من نقطة زمنية 1-7 في شرط؛ تم تعيين الحد الأدنى للمنطقة (Y-قيمة) في 100٪. يتم رسم FSK أو المخدرات المعايرة (المحور السيني) ضد الجامعة الأمريكية بالقاهرة (العمودي).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1A عزلة جديدة تمثيلية من أقبية جزءا لا يتجزأ من على BMM. الخبايا هي من خزعة القولون والمستقيم من موضوع CF. عادة، يتم إنشاء عضي من كل سرداب (الشكل 1A - C). ويرجع ذلك إلى خلل في CFTR، أكثر من organoids القولون CF لا الكيسي، وإنما هي المدمجة ومع التوقعات وbuddings (الشكل 2A - 2B). ومع ذلك، عضي بعض CF الثقافات، خاصة مع وظيفة متبقية عالية، ولها عدد قليل من organoids مع شكل الكيسي (الشكل 2C)، مثل النوع البري الثقافات عضي (الشكل 2D).

قبل الركض organoids لتوسيع ثقافة أو بذر فحص الجبهة الإسلامية للإنقاذ، من المهم أن organoids لديها حجم كبير مع buddings متعددة، كما هو مبين في الشكل 3A. إذا كان organoids صغيرة ودون نbuddings umerous عند معالجتها لالركض، يتأثر سلبا على ثقافة عضي. اعتمادا على نوعية والنشاط عوامل النمو الأساسية مثل EGF، WNT-3A، وRspo3، وorganoids تصل إلى الحجم المطلوب بين 7 و 12 أيام (الشكل 3A). بعد انقطاع الميكانيكية، وتعطل buddings واستخدامها لتوليد organoids جديد في المقطع التالي (الشكل 3B). إذا تجهيز organoids لتجميد، فمن المهم أن يتم trypsinized إلى حجم صغير، ممثلا في الشكل 3C. بعد trypsinization، ومطلي من organoids ل 1 أو 2 أيام من أجل السماح لهم التعافي من الإجهاد من التلاعب. هذه الخطوة، جنبا إلى جنب مع صغر حجم organoids، يضمن انتعاش خلية 98٪ بعد ذوبان (الشكل 4A).

عندما يتم إذابة organoids، فمن المهم أن يكون لهم في كثافة عالية، لذلك عادة، يتم إذابة أنها فيحجم صغير (Figure4A). بعد يوم أو يومين في الثقافة، وبعد أن لاحظت أن organoids تتزايد حجم (قارن الشكل 4A مع الشكل 4B - 4C)، وتضعف organoids في نسبة 20-30 organoids في 10 ميكرولتر من BMM، وتوفير الكثافة الصحيحة لتنمو لتصبح أكبر حجما. إذا كانت مخففة جدا في organoids، فإنها يمكن أن يبطئ النمو وحتى يمكن التفريق ويموت. إذا كان organoids ومزدحمة للغاية، وعدم وجود مساحة أو نقص في عوامل النمو يتباطأ أيضا نمو organoids ويقلل من عدد من buddings.

تصفيح organoids من ثقافات قابلة للحياة مع الحطام الخلوي محدود ينبغي أن يؤدي إلى الظروف التي> 95٪ من organoids تنتفخ على التحفيز FSK، شريطة أن وظيفة CFTR كافية موجودة (الشكل 5A - 5B). Organoids تضخم بطريقة genotype- والمخدرات التي تعتمد، كما يتضح من الصور ممثل organoids مع اثنين من الأليلات F508del (الشكل 5A) وorganoids مجمع متخالف لF508del وS1251N (الشكل 5B)، طفرة CFTR النابضة المرتبطة ببعض الوظائف المتبقية.

ل quantitate تورم، يتم تحديد مجموع المساحات السطحية calcein الأخضر لكل نقطة زمنية وأعرب عن كنسبة مئوية من T = 0 (وضعت في 100٪؛ الشكل 6A). الحطام و، هياكل صغيرة غير تورم وعادة ما تكون أقل من 5٪ من مجموع مساحة السطح. وأعرب عن الزيادة النسبية في منطقة 10 دقيقة الفاصل الزمني، ويتم إنشاء الجامعة الأمريكية بالقاهرة (وحدات التعسفي) القياسات لكل حالة (T = 0-60 دقيقة، عتبة أساسية وضعت في 100٪؛ الشكل 6B). لقد وجدنا الجامعة الأمريكية بالقاهرة لتكون أكثر قوة، كما أنه يشتمل على بعض الاختلاف في بدء تورم، فضلا عن وجود علاقة منحنية إلى ما بعد 30-40 دقيقة من FSK على مستويات عالية وظيفة CFTR.

"jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> قياسات وظيفة المتبقية في F508del / organoids F508del تصل عادة 0-200 وحدات الدفاع الذاتي (100-110٪ من زيادة مساحة السطح بعد 60 دقيقة من 5 ميكرومتر العلاج FSK) ، والتي يمكن أن تزيد إلى ~ 2،500-3،500 حدات AUC على الحضانة مع جهري CFTR (VX770 + VX809، الشكل 6C). يمكن Organoids المرتبطة CFTR ظيفة متبقية تصل إلى 4500 وحدة الدفاع الذاتي بعد 60 دقيقة من 5 ميكرومتر FSK التحفيز في غياب جهري CFTR (مساحة 200-220٪ من الظروف قبل FSK). تورم عضوي الشكل يصل إلى السقف في ~ 4500 وحدة الدفاع الذاتي، ويفترض نظرا للقيود المادية للهياكل عضي، وتأثير الحد من معدل نقل أيون basolateral، وإقامة التوازن ion- وسائل النقل في ظل ظروف "تمدد". يمكن معاير FSK لتوسيع النطاق الديناميكي للمقايسة في هذه عالية CFTR مستويات وظيفة متبقية ل quantitate أفضل وظيفة المتبقية أو درجة عالية من فعالية علاج مركب (على سبيل المثال، كما يدل على النشاط أعلى من VX770 على تورم organoids S1251N على التحفيز مع تركيزات FSK الدنيا؛ الشكل 6D).

شكل 1
الشكل 1: إنشاء CF organoids القولون والمستقيم من الخزعات. (A) صور الممثل المواد المعزولة من خزعة المستقيم بعد جزءا لا يتجزأ من BMM يوم العزلة (مرور 0، يوم 0). يظهر توسيع سرداب المحددة على لوحة اليمنى السفلى. وتلت (ب) نفس الأقبية بعد 7 أيام في الثقافة (مرور 0، يوم 7). ويرد توسيع نفس سرداب المعروضة في لوحة و. (C) صورة الممثل من نفس الثقافة عضي 11 يوما بعد أن الانقسام (مرور 1، يوم 11). الحانات النطاق = 100 ميكرون.
159fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: صور الممثل organoids القولون CF المستمدة من الموضوعات مع طفرات CFTR مختلفة. صور الممثل CF organoids القولون والمستقيم من الموضوعات مع F508del / F508del (A)، F508del / R117H-7T (B)، وF508del / S1251N (C) الطفرات. (D) صورة الممثل ثقافة عضي القولون والمستقيم من موضوع wildtype CFTR. الحانات النطاق = 100 ميكرون. تم الحصول على هذه الصور مع عدم وجود التحفيز FSK. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5159 / 55159fig3.jpg "/>
الرقم 3: معالجة CF organoids القولون لصيانة وفحص أو التجميد. (A) صور الممثل ثقافة عضي CF القولون على استعداد لتتم معالجتها إما الركض (ب) أو تجميد (C). (ب) بعد تعطل بهم الميكانيكية، تتشكل قطع صغيرة، والتي سوف تولد organoids جديد في الممر المقبل. (C) بعد trypsinization، يتم إنشاؤها، organoids جولة صغيرة جدا، وتسهيل قدرتها على الاستمرار خلال عملية التجميد. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: إرساء ثقافة عضي القولون والمستقيم التليف الكيسي من organoids المجمدة. (<قوية> A - C) صور الممثل ثقافة عضي القولون والمستقيم CF إذابة يوم 0 (A). واتخذت صورة من نفس البئر واحد (ب) واثنين من (C) أيام بعد. (D - G) صور الممثل الخطوة تخفيف موضح في القسم 5.9. بمجرد استرداد organoids بشكل صحيح من الذوبان (يوم 3 بعد ذوبان الجليد)، وتضعف حتى انهم لديهم مساحة للنمو (D). واتخذت صورة من نفس البئر ستة (E)، عشرة (F)، وخمسة عشر (C) يوما بعد الذوبان. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الناجم عن Forskolin تورم CForganoids. (A و B) صور الممثل F508del / F508del (A) أو F508del / S1251N (ب) organoids القولون والمستقيم قبل أو بعد 60 دقيقة من التحفيز مع FSK (5 ميكرون) في غياب أو وجود VX-770 (3 ميكرون]) أو VX-770 في تركيبة مع VX-809 (3 ميكرون). الحانات النطاق = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: تورم تحديد مقدار Forskolin التي يسببها. (A) صور الممثل اختيار منطقة عضي من برمجيات تحليل صورة F508del / S1251N organoids قبل (0 دقيقة)، وبعد 60 دقيقة من التحفيز مع FSK (5 ميكرومتر) وVX770 (3 ميكرومتر). الحانات النطاق = 200 ميكرون. (ب) Represصور entative لزيادة مساحة النسبية F508del / F508del أو F508del organoids / S1251N خلال 60 دقيقة من FSK (5 ميكرون) التحفيز في غياب أو وجود VX770 (3 ميكرون) و / أو VX809 (3 ميكرون). (ج) المساحة تحت منحنى القياسات من الظروف المشار إليها في الفقرة (ب) (T = 60 دقيقة، أساسية عتبة = 100٪). (D) المساحة تحت منحنى القياسات من F508del / F508del أو organoids F508del / S1251N بتركيزات مختلفة من FSK. تمثل البيانات المتوسطات ± SD من تجارب تمثيلية واحدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، ونحن نقدم بروتوكول كامل للجيل، والتوسع، التجمد، وذوبان organoids القولون البشري. في حين أنشأنا الثقافات عضي الإنسان منذ بعض الوقت 17، فقد ثبت في بعض الأحيان من الصعب تحديد التكنولوجيا في مختبرات أخرى دون التدريب العملي على التدريب. ونحن نتوقع أن هذه البروتوكولات سوف يحل محل هذا التدريب.

متوسطة مكيفة WNT-3A-هي واحدة من أهم الكواشف لكي تنجح في إنشاء وصيانة طويلة الأجل عضي الثقافة. في الواقع، قد الثقافات عضي "تحطم" عندما يتعرض إلى متوسطة conditoned WNT-3A مع انخفاض النشاط. منذ مصنوع المتوسطة مكيفة WNT-3A-في المنزل، وهناك العديد من الجوانب التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند إنشاء وسيلة نشطة. نشط WNT-3A لا يمكن إلا أن تنتج في المتوسط ​​مع ذات جودة عالية مصل بقري جنيني (FBS) التي توفر إشارات النمو السليم للخلايا L واستقرار مسعورجزيئات WNT-3A. عندما النشاط WNT-3A منخفضة (أي، وانخفاض TOP / نسب غندورة، أنظر أدناه)، فإنه عادة ما يكون FBS الذي يسبب المشكلة.

يعمل المؤتلف WNT التجاري ضعيفا، ولذا فإننا لا ننصح باستخدامه السيطرة الإيجابية لمراسل فحص TOP / غندورة WNT. النسبة بين TOP / Renilla غندورة و/ Renilla هي مؤشر النشاط WNT من المتوسط ​​مكيفة، وذلك على دفعة جيدة متوسطة مكيفة WNT-3A-يعطي نسبة TOP / غندورة أعلى من 25، بالمقارنة مع قيمة TOP / غندورة من سيطرة سلبية: المتوسطة الذين لم يتعرضوا للخلايا المنتجة لل3A WNT. يمكن استبدال رأس المؤتلف وR-spondin من رأس وR-spondin مشروطة متوسطة 28 و 29.

يصف البروتوكول الحالي أيضا اختبار وظيفي لCFTR-الفحص الجبهة الإسلامية للإنقاذ. لقد أثبتنا مؤخرا العلاقة بين النمط الجيني CFTR والجبهة الإسلامية للإنقاذ وكيف أن هذا يعكس نشرت genoty CFTRعلاقات بي-النمط الظاهري تم الحصول عليها من السجلات السريرية (www.CFTR2.org) 25. باستخدام هذا الاختبار، تم التعرف على اثنين من الأفراد مع طفرات CFTR نادرة للغاية التي كانت تستجيب لivacaftor (VX-770) 25 organoids. أسفرت وصفة طبية لاحقة من هذا الدواء في استجابة سريرية واضحة، وتسليط الضوء على قيمة مقايسة الجبهة الإسلامية للإنقاذ لتتناسب مع أدوية محددة مع المرضى الذين يعانون من الطفرات النادرة في غياب معطيات التجارب السريرية. ضروري لتقدير حجم الجبهة الإسلامية للإنقاذ هي النمو وفحص الظروف المثلى، وأشار فقط من قبل جزء محدود من organoids غير تورم (عادة أقل من 5٪). مستويات عالية من الرصاص الحطام إلى التقليل من التورم، كما هي متعارف نسبة أكبر من غير قابلة للحياة، والهياكل غير تورم بواسطة برنامج تحليل الصور.

الارتباط بين في المختبر الجبهة الإسلامية للإنقاذ الردود وأنشئت سابقا المؤشرات الحيوية التي تعتمد على CFTR (تركيز كلوريد العرق وintestوكانت القياسات الحالية إينال) على مستوى شخصي يمكن إثباته بسهولة في دراساتنا السابقة 19 و 25. يدعم هذا فكرة أن القياسات وظيفة المتبقية باستخدام الجبهة الإسلامية للإنقاذ على المواضيع مع قوات التحالف قد تكمل النهج الحالية كعلامة التشخيص أو النذير بطريقة شخصية. الإنتاجية للمقايسة الجبهة الإسلامية للإنقاذ مقارنة المؤشرات الحيوية الأخرى من وظيفة CFTR، مثل قياسات تركيز العرق الكلوريد في الجسم الحي والقياسات الحالية الأمعاء في الجسم الحي السابقين الخزعات المستقيم، ويسمح لتحسين السيطرة على التغير التقني. كما أنها توفر قراءات تماما CFTR التي تعتمد ومجموعة ديناميكية كبيرة باستخدام المعايرة من FSK أن بدقة أنواع المتبقية وظيفة CFTR.

ومع ذلك، يعكس فحص الجبهة الإسلامية للإنقاذ فقط تأثير التركيب الوراثي الفردي على تنوع نجاعة الأدوية، في حين يتأثر تعديل من مرض التليف الكيسي عن طريق أكثر من وظيفة CFTR فقط. لدرواستجابة ز، والاختبار هو انعكاس لاستجابة الأنسجة المحتملة. على الرغم من دقيقة جدا في قياس CFTR، لم تدرج التباين البشري في الدوائية، على عكس البعض في الجسم الحي 7 أو 8 أو القياسات CFTR فيفو السابقين مباشرة (32). كما نوقش سابقا، معدلات CF غير (على حد سواء وراثية وبيئية) تقوم أيضا بالتأثير النمط الظاهري، مما تسبب في قطع الاتصال بين المختبر في الملاحظات أو المؤشرات الحيوية CFTR والنمط الظاهري السريري 2. وعلاوة على ذلك، ويرتبط تحديد الطفرات استجابة المحتملة باستخدام خطوط الخلايا 33 مع أقل تأثير على المرضى الذين يحتاجون إلى الحصول على خزعة المستقيم لإنشاء organoids.

عقاقير تستهدف CFTR متعددة هي قيد التطوير حاليا 1. ومن المتوقع أن التجارب السريرية لن تسمح التنبؤ الصحيح السريرية فعالية بASED على CFTR وضع تغيري وحدها. كما يقيس الفحص الجبهة الإسلامية للإنقاذ وظيفة CFTR والاستجابة للدواء وظيفيا، قد أصبح الأسلوب المفضل لتحديد نوع الدواء يعمل بشكل أفضل والتي مريض. قد يكون فحص الجبهة الإسلامية للإنقاذ مفيدة أيضا لتحديد مجموعات المرضى ليتم تضمينها في التجارب التسجيل ولتطوير طرائق عقار جديد. تحفيز organoids القولون والمستقيم مع البلازما قبل وأثناء العلاج قد مزيد من المساعدة ل quantitate مبالغ الوظيفية تعميم جهري CFTR في الدم، مما قد يسهل الجرعات الشخصية واختيار من جرعات الدواء في التجارب السريرية 30 و 31. وأخيرا، قد يكون من المفيد الجبهة الإسلامية للإنقاذ لفهم أساسي أفضل من وظيفة CFTR وتفاعلاته مع المعدلات الوراثية-حتى الآن unknown- إلى حد كبير غير ذلك من وظيفتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل برنامج HIT-CF من CF الأساس الهولندية (NCFS)، ZonMW (40-00812-98-14103)، وصندوق أبحاث مستشفى يلهيلمينا الأطفال وتشيكوسلوفاكيا، وZilverenkruis / Achmea. ونود أن نشكر S. Heida ميشيل، M. GEERDINK، KM دي وينتر دي غروت، وG. Berkers (قسم أمراض الأطفال أمراض الرئة، ومستشفى يلهيلمينا الأطفال، UMC اوتريخت)، وRHJ هوفن (قسم أمراض الأطفال أمراض الجهاز الهضمي، ويلهيلمينا مستشفى الأطفال، UMC أوتريخت) لتقترب من المرضى والحصول على خزعات لجيل من CF البنك الحيوي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #12634 stored at 4 °C
GlutaMax Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #35050 stored at 4 °C
Hepes Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen # 15630-056 stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #15140-122 stored at -20 °C
96 well culture plate Cellstar #655180
24 well culture plate Cellstar #662160
6 well culture plate Cellstar #657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) Life Technologies: Gibco #14190-094 stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500 ml  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #31966-021 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Bovogen #SFBS LOT#11113 For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line ATCC #CRL-2647 For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids Millipore  #17-285 For measuring Wnt activity
pTK-Renilla Promega  #E2241 For measuring Wnt activity
HEK-293 ATCC #CRL-1573 For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega  #E1910 For measuring Wnt activity
Zeocin  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #R250-01 For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement  Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen #17504-044 stored at -20 °C
N-Acetylcysteine Sigma Aldrich #A9165-5G stored at -20 °C
Nicotinamide Sigma Aldrich #N0636 stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) PrepoTech #AF-100-15 stored at -20 °C
Gastrin Sigma Aldrich #G9145 stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  Tocris #2939 stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) Selleckchem #S1049 stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma Aldrich #S7067 stored at -20 °C
Primocin InvivoGen #ant-pm-1 stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin) PrepoTech #120-10C stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3) R&D Systems #3500-RS/CF stored at -20 °C
Vancomycin Sigma Aldrich #861987- 250mg stored at -20 °C
Gentamycin Life Technologies: Gibco #15710-049 stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich #431788 Stored at 4 °C
Matrigel Corning #354230 stored at -80 °C
TryplE Express  Life Technologies: Gibco #12605-010 for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium Life Technologies: Gibco #12648010 for freezing
Calcein Life Technologies: Gibco #C3100MP stored at -20 °C
Forskolin R&D Systems #1099-50 mg stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809) Selleckchem #s1565 stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770) Selleckchem #s1144 stored at -80 °C
Name of Reagents/Material Solvent Stock Concentration Final Concentration
GlutaMax 200 mM 2 mM
Hepes 1 M 10 mM
Penicillin/Streptomycin 10K U/ml 10K µg/ml 100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin  100 mg/ml  125 µg/ml
B27 supplement  100x 1x
N-Acetylcysteine MiliQ H2O 500 mM
Nicotinamide DPBS 1 M 10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) DPBS 0.1% BSA 0.5 mg/ml 50 ng/ml
Gastrin DPBS 100 µM 10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)  DMSO 5 mM 500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) DMSO 10 mM 10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) DMSO 30 mM 10 µM
Primocin 50 mg/ml  100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin) DPBS 0.1%BSA 100 µg/ml 100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3) varies per lot 300 ng/ml
Vancomycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Gentamycin 10 mg/ml 50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) MiliQ H2O 0.5 M 2 mM
Calcein DMSO 10 µg/ml 3.3 ng/ml
Forskolin DMSO 10 mM variable
Lumacaftor (VX-809) DMSO 20 mM variable
Ivacaftor (VX-770) DMSO 20 mM variable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
  3. Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).
  4. Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).
  5. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).
  6. Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  7. Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  8. Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  9. De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  10. Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).
  11. Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
  12. Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).
  13. Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
  14. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  15. Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
  16. Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1 (1), e27112 (2014).
  21. Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
  22. Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).
  23. Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. , (2016).
  24. Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. , (2016).
  25. Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84 (2016).
  26. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
  27. Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
  28. Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
  29. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  30. Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).
  31. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  32. Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).
  33. Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).

Tags

الطب، العدد 120، organoids القولون البشري والثقافة الخلية الأولية، خزعة، والتليف الكيسي، وتورم عضوي الشكل، وظيفة CFTR، Forskolin، Ivacaftor (VX-770)، Lumacaftor (VX-809)
Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم الاستجابة للدواء في التليف الكيسي المرضى
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., … More

Boj, S. F., Vonk, A. M., Statia, M., Su, J., Dekkers, J. F., Vries, R. R. G., Beekman, J. M., Clevers, H. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (120), e55159, doi:10.3791/55159 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter