Introduction
CF er forårsaget af mutationer i cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) gen, som koder for et epitel anion kanal. CF påvirker cirka 85.000 mennesker på verdensplan en. Over 2.000 CFTR mutationer er blevet identificeret ( www.genet.sickkids.on.ca ). Denne mangfoldighed delvist forklarer et bredt spektrum af observerede sygdomsfænotyper ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Seks klasser af CFTR-mutationer er defineret på grundlag af deres effekt på CFTR proteinekspression og funktion: (I) ingen syntese, (II) forringet menneskehandel, (III) defekt kanal gating, (IV) ændret ledningsevne, (V) reducerede niveauer af normalt fungerende CFTR, og (VI) forringet celleoverfladen stabilitet 4. Selvom de fælles CFTR mutationer godt undersøgt, CFTR-funktion og relation med klinisk status forbliver poorly forstås på samme niveau som den enkelte, især for den store gruppe af sjældne "sjældne" mutationer ( www.CFTR2.org ) 1, 3.
For nylig er lægemidler blevet udviklet, der målretter CFTR-proteinet i en mutation-specifik måde. To klasser af CFTR-protein-targeting lægemidler er i klinisk brug og har forskellige virkningsmekanismer. Potentiatorer, såsom VX-770, forbedre den åbne sandsynlighed for apikalt lokaliseret mutant CFTR og handle direkte på deres tilsætning til celler 5. Korrektorer, såsom VX-809, genoprette handel med endoplasmatisk reticulum-lokaliserede fejlfoldet CFTR og kræver pre-inkubation med celler, før effekterne observeres 6. CFTR potentiator, VX-770, er blevet registreret for motiver med G551D mutationen 7, 8, såvel som for otte andreCFTR gating mutationer, herunder S1251N 9; sammen er disse mutationer båret af 5% af alle CF fag. Andre kliniske forsøg har indikeret, at VX-770, kombineret med korrektion VX-809, har begrænset endnu signifikante virkninger på lungefunktion og forårsager et fald i eksacerbationer satser i fag homozygot for F508del mutation båret af 45-50% af patienterne 10, 11.
Konventionelle kliniske forsøg for at identificere narkotika-responsive emner inden de resterende 50% af CF-patienter er dyre og tidskrævende og er ikke muligt for personer med ekstremt sjældne CFTR genotyper. Roman, omkostningseffektive, personlige metoder er afgørende for at matche det stigende antal CFTR modulatorer til enkeltpersoner bærer nogen form for CFTR mutation. Indtil nu har retssagen inddragelse af patientgrupper bærer specifikke CFTR mutationer, været styret af undersøgelser med anvendelse af mutant CFTR-genet transfektion i heterologous cellesystemer, efterfulgt af elektrofysiologiske undersøgelser i Ussing kamrene 5, 6, 12. På grund af en mangel på passende CF dyremodeller, narkotika effektstudier i luft-væske-grænseflade-opdelte bronchiale epitelceller afledt af CF lunge eksplantatpartikler materialer er blevet brugt til udvikling af lægemidler 13, 14, 15. Men for at den begrænsede adgang til lunge eksplantatpartikler væv og de invasive procedurer opnå bronchiale celler fra personer uden slutstadiet sygdom hæmme analysen af mindre almindelige CFTR mutationer og forhindre test lægemiddel i en personlig måde. For at overvinde disse begrænsninger, "let adgang" væv, såsom kolorektale organoids, nasale luftvejs celler og luftvejs celler fra inducerede pluripotente stamceller, bliver i øjeblikket undersøgt for personlig medicinsk behandling.
16, 17. For den menneskelige tyktarm / endetarm, involverer de dyrkningsbetingelser definerede vækstfaktorer (Epithelial vækstfaktor (EGF), gastrin, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), og Noggin) kombineret med små molekyler (Nicotinamid, A83-01, og SB202190) i en basalmembran matrix. Under disse betingelser enkelt stamceller eller små vævsfragmenter vokse ud i lukkede, cystisk, 3D strukturer dannet af stærkt polariseret epitel med sin basale side orienteret mod ydersiden. Alle celletyper forekommer typisk i deres normale forhold og positioner. Organoids kan udvides over lange perioder med ugentlig mekanisk ødelæggelse og re-plating. De er genetisk og fænotypisk stabile og kan opbevares, tillader langsigtet ekspansion og bio-banking 17. De er modtagelige foralle standard celle-biologisk / genetiske manipulationer og analytiske teknikker udviklet til 2D-cellelinjer 18.
Vi har for nylig vist, at CFTR-funktion kan umiddelbart måles i kolorektale organoids i en forskolin-induceret kvældning (FIS) assay 19. 20. Ved udsættelse for forskolin (FSK) eller alternativt til kolera toksin, organoids hurtigt at øge deres cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) niveauer, som igen resulterer i åbningen af CFTR-kanal 19. Organoids fra raske individer eller fra personer med CFTR mutationer i forbindelse med resterende funktion, vil efterfølgende svulme som en konsekvens af ion og vand transport til organoide lumen, in vitro svarer til sekretorisk diarré. FIS respons kolorektale organoids er tidligere vist at være fuldt CFTR-afhængig, som angivet ved organoids afledt af CFTR-null individer ennd ved brug af specifikke farmakologiske CFTR hæmmere 19. Store fagspecifikke datasæt kan udledes inden for flere uger efter at have taget en biopsi.
For FIS assay beskrevet i detaljer her, organoids dyrkes fra rektal biopsier, der kan opnås i alle aldre og med kun begrænset ubehag 21. Organoids passeres ugentligt af mekanisk sprængning i enkelte krypter, der let genlukkelige og danner nye organoids. Til drift af FIS assay ~ 30-80 af disse nedbrudte små organoids udplades i hver brønd i en 96-brønds plade 19. På dagen for assayet er de organoids farvet med calcein green, en fluorescerende celle-permeable farvestof, den fastholdes i levende celler, hvilket letter direkte billedvisning. Derefter Fsk, som rejser intracellulær cAMP og derved aktiverer CFTR tilsættes for at stimulere organoide hævelse. Potentiatorer der virker på apikal CFTR tilsættes samtidig wed forskolin, mens korrektorer som genopretter CFTR menneskehandel tilføjes 24 timer før tilsætning af Fsk. Den organoide kvældning kvantificeres ved en automatiseret billedanalyse, der beregner den relative stigning i det samlede areal af alle fluorescerende objekter for hvert tidspunkt efter forskolin tilsætning.
3D organoide hævelse giver fordele og ulemper i forhold til eksisterende elektrofysiologiske CFTR udlæsninger i 2D dyrkede luftvejs celler i Ussing kamre. En stor fordel er gennemløbet af hævelse assay. Celler dyrkes og analyseres under anvendelse af en enkelt type dyrkningsmedium, og en erfaren tekniker kan kulturen op til 25 organoide prøver på ugebasis, mens kvantificere ca. 1.200 datapunkter pr uge i 12 patientprøver. Vi skriver traditionelt en enkelt eksperimentel tilstand ved dobbelte eller tredobbelte målinger per plade og gentag sådanne målinger på tre uafhængige inkubation tidspunkter. I alt, ca. 300-500 sIngle organoide strukturer er derefter målt pr eksperimentel betingelse, hvilket fører til meget præcise målinger af CFTR-funktion med begrænset teknisk variabilitet. Denne præcision giver os mulighed for klart at definere forskelle i residual funktion og reaktion på CFTR modulatorer og giver os mulighed for let afhente genetiske baggrund effekter mellem patienter bærer identiske CFTR mutationer 19, 22, 23, 24, 25. Datakvalitet kan let vurderes fra mikroskop billeder. Mens FIS er fuldt CFTR-afhængig, er det en indirekte effektmål for CFTR-funktion, dets udlæsning forårsaget af kobling af iontransport til væsketransport. Dette står i kontrast med direkte CFTR funktion målinger i Ussing kamre, der måler transepiteliale ionstrømme 26. Ussing kamre tillader vælge stimulering af apikale eller basolaterale compartments (som det organoide assay ikke tillader); ved permeabilisering basolaterale membraner, kan den apikale CFTR-afhængige anion sekretion selektivt måles 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter anvendes humane væv beskrevet heri blev godkendt af den etiske komité på University Medical Center Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). Informeret samtykke til væv indsamling, produktion, opbevaring og brug af organoids blev opnået fra patienterne på Wilhelmina børnehospital (WKZ) -UMCU.
| Udstyr | Forbrugsmaterialetype | Værktøj |
| Laminar flow hætte | 15 og 50 ml koniske rør | Zeiss LSM 800 - Zen 2 (blå udgave) software til måling af billeder |
| CO2-inkubator | mikrocentrifugerør | Microsoft Excel-programmet |
| Cellekultur Microscope (lys / optisk mikroskop) | 0,22 um filtre | |
| Centrifuge | serologiske pipetter | |
| Rolling Shaker | Mikropipette filter tips | |
| 4 ° C rum eller 4 ° C køleskab til inkubatoren | kryoglas | |
| CoolCell Cell Nedfrysning Container | ||
| serologisk Pipettor | ||
| Micropippette (1.000, 200 og 20 pi) | ||
| Viaflo Gentag pipette | ||
| (Live celle) konfokalmikroskop | ||
| Computer | ||
| Flydende nitrogen tanken | ||
| Multichannel (200 pi) |
1. Forberedelse Reagenser til Kultur
- Basal Medium Fremstilling
BEMÆRK: Basal medium (BM) henviser til Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium med Hams Nutrient Mixture F-12 (Ad-DF) suppleret med 4- (2-hydroxyethil) -1piperazineethanesulfonic syre (HEPES), glutamin og penicillin / streptomycin (Pen / Strep).- I en 500 ml Ad-DF-medium flaske, der tilsættes 5 ml 200 mM glutamin, 5 ml 1 M HEPES, og 5 ml pen / strep opløsninger (10.000 U / ml, 10.000 ug / ml).
- Store BM i køleskab ved 4 ° C i mindst 4 uger.
- Wnt-3A-conditioned Medium Forberedelse
BEMÆRK: Wnt-3A-medium er foretaget internt using cellelinjen L-Wnt-3A ifølge producentens anvisninger.- Til høst af Wnt-3A-konditioneret medium, indsamle mediet udsættes til cellerne i en uge og spinde det ned i 5 minutter ved 450 xg for at fjerne flydende celler.
- Foretage Wnt-3A-konditioneret medium gennem et 0,22 um filter og opdele det i 40 ml portioner i 50 ml koniske rør. Opbevare dem ved 4 ° C i mindst 4 måneder uden tab i aktivitet.
- Test aktiviteten af Wnt-3A-konditioneret medium i en top / FOP assay ved anvendelse af humant embryonisk nyre (HEK) -293-celler transficeret med over- og FOP-luciferase og TK Renilla og måles med en Renilla -luciferase assaykit ifølge producentens anvisninger.
BEMÆRK: TOP-luciferase er en reporter plasmid, der indeholder vildtype-TCF bindende regioner. Hvis Wnt-3A-medium er aktiv, er den kanoniske Wnt signalering aktiveret. Beta-catenin translokerer ind i kernen til at associere with TCF / LEF transkriptionsfaktorer og aktiverer transkription af luciferase reporter, inducerer en stigning i relativ luciferaseaktivitet, når der tilsættes substratet. Den FOP-luciferase anvendes som en negativ kontrol, fordi TCF bindende regioner opstrøms for luciferasegenet er muterede.
- Colon Medium Forberedelse
BEMÆRK: Forberede og fortyndes alle vækstfaktorer og reagenser efter producentens anbefalinger. Benytter små størrelse alikvoter en Undgå fryse-tø cykler. Funktionelle vækstfaktorer er afgørende for resultatet.- Forbered kolon medium (CM) ved at supplere BM med 1x B27, 1,25 mM N-acetylcystein, 50 ng / ml hEGF, 5 nM gastrin, 10 mM nikotinamid, 300 ng / ml hRspo3, 100 ng / ml hNoggin, 500 uM A83-01 , 10 uM SB202190, og 100 ug / ml af et antimikrobielt for primære celler.
- Opdel CM i alikvoter og fryse dem ved -20 ° C i op til 4 måneder. Optø alikvoter at forberede fuld kolonmedium (FCM) ved tilsætning af 50% Wnt-3A-conditoned medium til CM. Store FCM op til 7 dage ved 4 ° C uden tab i aktivitet.
- Til etablering af en organoide kultur fra rektal biopsier, supplere FCM med 50 ug / ml vancomycin, 50 ug / ml gentamycin og 10 pM rho-associeret coiled-coil-dannende protein serin / threonin kinase hæmmer (RhoKi). Bruge dette medium, kaldet isolation medium (IM), kun for de første to til tre dage i kultur.
- EDTA fremstillingen af stamopløsninger
- Forbered 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), pH 8, i ultrarent H2O, steriliseret med en 0,22 um filter.
- Manipulation af basalmembranmatrix
- Forbered basalmembranmatrix (BMM) ifølge producentens anbefaling.
- Thaw BMM natten på is.
- Ved overførsel af BMM fra flasken til en 15 ml konisk rør, brugen 5 ml pipette og et 15 ml konisk rør for-kølet ved -20 ° C.
- Når optøet, opbevares BMM i et køleskab ved 4 ° C og inkuberes på is i mindst 30-60 minutter før brug.
BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater, skal BMM være kold og blandes korrekt, før indlejring krypter eller organoids.
2. Etablering af Colon Organoids fra et CF Patient biopsi
BEMÆRK: Efter væv samling, er det vigtigt at fastholde prøven på is i saltvand, Dulbeccos phosphatbufret saltvand uden Ca2 + og Mg2 + (DPBS), eller BM. Hurtig behandling af biopsierne anbefales, men det har vist sig muligt at etablere organoide kulturer fra biopsier lagret på is i op til 7 dage.
- Lad biopsier sig på bunden af et 15 ml konisk rør og fjern supernatanten.
- Der tilsættes 10 ml DPBS til biopsier og pipette op og ned 10-20 gange med en 10 ml pipette.
BEMÆRK: Pipetten skal på forhånd befugtet med BM inden pipettering af biopsi. - Lad biopsier sig på bunden og fjern supernatanten.
- Gentag trin 2.2 og 2.3 4-5 gange, indtil supernatanten er klar.
- Der tilsættes 10 ml DBP under og 200 pi EDTA (0,5 M) til biopsier, og glasset anbringes på en vippende rør platform for 60-120 minutter ved 4 ° C.
BEMÆRK: Inkubationstid kan afvige per patient. Hvis krypter frigives, DPBS bliver uklar. EDTA-inkubation kan afsluttes, når der kan observeres krypter under et mikroskop. - Lad krypter at bosætte. Supernatanten kasseres.
- Tag 2 ml BM og føje den til en ny 15 ml konisk rør. Ryst denne nye rør manuelt på en sådan måde, at indersiden er dækket med BM.
- Ved hjælp af en pipette pre-fugtet med BM, tilsættes 2 ml DPBS til røret indeholdende biopsier og pipette op og ned 10-20 gange.
- Lad biopsier at bosætte sig og overføre DPBS med krypter til den nyerør indeholdende de 2 ml BM, der blev fremstillet i trin 2.7.
- Gentag trin 2.8 og 2.9 indtil der ikke længere krypter frigives.
- Spin krypterne ned ved 130 x g i 5 minutter ved 8 ° C.
- I mellemtiden overføre IM til sikkerheden skabet ved stuetemperatur (RT).
- Supernatanten kasseres, og der tilsættes 10 ml BM til krypten pellet og gentag trin 2.11.
- Pellet resuspenderes i 1 ml BM. Tag 5-10 pi og tælle antallet af krypter ved øjet under et mikroskop.
- Spin krypterne ned ved 130 x g i 5 minutter ved 8 ° C.
- Fjern supernatanten og pellet resuspenderes i 55% BMM (v BMM til v IM).
BEMÆRK: krypter resuspenderes i den tilsvarende mængde på 55% BMM på en krypt pr pl. Hvis der ikke er nok krypter, den mindste mængde af BMM er 40 pi. - Til såning, pipette 35 pi per brønd (i en plade med 24 brønde). Opdele de 35 pi BMM i 3-5 dråber separat for at forbedre diffusionen af groGJ faktorer i den BMM. Opret ikke bobler.
- Placer og lade pladen på hovedet i inkubatoren ved 37 ° C i mindst 20 min for BMM at størkne.
- Tilføj 500 pi IM per brønd og holde det i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
- Opdater mediet hver 2-3 dage. Fjern det gamle medium ved pipettering ud med en P1000 pipette, forlader BMM dråber intakt. Derefter tilsættes forsigtigt FCM ved pipettering det i siden af brønden, ikke direkte på BMM dråber.
BEMÆRK: Hvis der ikke krypter frigives i isolation protokollen, centrifugeres supernatanten, vaske pillen 2-3 gange med BM, og resuspender den i BMM. Tag den sidesten væv og skær den i små stykker med en barberkniv. Saml disse i en 15 ml konisk rør, centrifugeres dem, og resuspender dem i samme BMM. Hvis der epiteliale stamceller er til stede, vil disse også generere organoids.
3. Passage af Colon Organoids for Vedligeholdelse, Frysning, og Forskolin-induceret Hævelse Assay (FIS)
BEMÆRK: Hver organoide kultur har sin egen fordobling tid. Normalt kan kolorektale CF organoids udvides 1: 3-1: 5 gange hver 7-10 dage. Det er et godt tegn, hvis der observeres spirende strukturer. Kolorektal CF organoids er mindre cystisk (figur 2A - 2C) end kolorektale normale organoids (Figur 2D). For etablering og vedligeholdelse, organoids dyrkes i 24-brønds plader; til frysning, i 6-brønds plader; og for FIS assay i 96-brønds pates.
- Passage af Organoids
- Hold BMM på is i mindst 30-60 min før du bruger den.
- Hold FCM ved stuetemperatur i mindst 1 time, før du bruger den.
- Mærk et 15 ml konisk rør med navn prøven og et andet rør som "vasket".
- aspireres forsigtigt medium fra brønde med en P1000 pipette uden at forstyrre BMM dråber.
- Tilsæt 1 ml BM til en godt og break op BMM dråber ved hjælp af en P1000 pipette. Overføre denne 1 ml i 15 ml konisk rør med navnet prøven.
- Vask godt med en anden 1 ml BM og overføre det til den samme 15 ml rør.
- Gentag trin 3.1.5 og 3.1.6 med endnu 5 brønde (op til 6 brønde i en plade med 24 brønde vil blive vasket i en 15 ml konisk rør).
- Fyld røret op til 12 ml med BM. Pipette op og ned ved en forud befugtet 5 ml pipette.
- Centrifugering ved 85 x g i 5 minutter ved 8 ° C.
- Supernatanten kasseres, og der tilsættes 1 ml BM til pillen. Med samme P1000 pipettespids, tage en P10 spids uden filter, og pipette op og ned 20 gange. Kassér både P1000 og P10 tips.
- Tilsæt 4 ml BM med en 5 ml pipette, og hold røret vippes ved ca. 70 ° fra lodret til den ene side. Pre-våde en ny P1000 tip og bland energisk 2-3 gange med P1000 (1 ml volumen).
- Tæl til 10, mens de resterende i skrå stilling, indsamle det øverste lag omhyggeligt wed P1000 pipette, og overførsel 4 x 1 ml i røret mærket "vasket".
- Overhold organoids bilæggelse til bunden i skrå rør; uafbrudt organoids og større stykker vil synke til bunds. Centrifuger de 15 ml "vasket" rør i 5 minutter ved 85 xg og 8 ° C.
- Supernatanten fjernes, og tilføje den nødvendige mængde medium og BMM til organoide pellet til en slutkoncentration på 55% BMM. Bland ved pipettering op og ned uden at skabe bobler (figur 3B).
BEMÆRK: En god tæthed opnås ved såning 25-30 organoids i 10 pi BMM. - Følg trin 2,17-2,19.
- Passage til frysning
- Holde BM i is i mindst 30-60 minutter før brug. Hold FCM ved stuetemperatur i mindst 1 time før brug.
- Forbered FCM suppleret med RhoKi (trin 1.3.3).
- Tag trypsin ud af køleskabet og lad det ved stuetemperatur i mindst 30 minutter før brug.
- Følg trin 3.1.5-3.1.10.
- Fjern så meget supernatant som muligt, tilsættes 4 ml trypsin og vortex i 30 sek.
- Sætte røret i et varmt vandbad ved 37 ° C i 1 min og vortex kraftigt i 30 sek.
- Undersøg opløsningen i røret. Hvis intakte organoids er stadig synlige under mikroskopet, gentage trin 3.2.7.
- Når organoids sprænges, tilsættes 8 ml BM at neutralisere trypsin og pipette 10 gange.
- Spin i 3 minutter ved 450 xg ved 8 ° C.
- Supernatanten fjernes, og tilføje den nødvendige mængde af mellemstore og BMM til organoids at nå en 55% BMM løsning. Bland ved pipettering op og ned uden at skabe bobler.
BEMÆRK: frysning, skal organoids være seedet i en 1: 1-forhold efter trypsinisering. - Seed 250 pi i en enkelt brønd i en forvarmet 6-brønds vævskulturplade, der producerer bittesmå, adskilt dråber af ~ 10 pi. Pladen hovedet i inkubatoren ved 37 ° C og forladeBMM at størkne for 20-30 min.
- Tilsættes 2,5 ml frisk FCM + RhoKi i hver 6-brønds plade brønd og overføre pladen til inkubatoren (figur 3C).
- Passage Organoids for FIS Assay
BEMÆRK: Afhængigt af antallet og størrelsen af de organoids, mellem 4 og 6 brønde i en 24-brønds plade er nok til podning 27 brønde i en plade med 96 brønde.- Bearbejde organoids som beskrevet fra trin 3.1-3.1.13.
- Pellet resuspenderes i 120 pi 50% BMM.
- Bekræfte antallet af organoids (30-50) i en 3 pi BMM dråbe under mikroskopet.
- Plade de organoids anvendelse af en enkelt dråbe af 3 pi placeret i midten af hver brønd i en 96-brønds pate.
- Pladen anbringes i 37 ° C inkubator i 15 min for BMM at størkne; yderligere trin er beskrevet i trin 6.1.1.
4. Frysning Colon CF Organoids
BEMÆRK: Orgeloids er klar til at blive frosset ned 1-2 dage efter trypsinbehandling og dyrkning, så organoids vil stadig være små, hvilket øger effektiviteten af overlevelse efter optøning.
- Der tilsættes 1 ml BM og bryde op BMM dråber under anvendelse af en P1000 pipette. Overførsel til en 15 ml konisk rør.
- Vask godt med en anden 1 ml BM og overførsel til det samme 15 ml rør.
- Gentag trin 4.1 og 4.2 med alle brønde.
BEMÆRK: For at undgå overskydende BMM, er 3 brønde af en 6-brønds plade samlet i én 15 ml rør. - Fyld 15 ml rør indeholdende organoids med 12 ml koldt BM og pipette op og ned med en 5 ml pipette. Efterlad røret på is i 5 min.
- Spin i 3 min ved 450 xg og 8 ° C og fjern supernatanten.
- Opløs pellet af organoids med frysning medium og pipette op og ned til korrekt opblande organoids.
BEMÆRK: 500 pi frysning medium anvendes for hver 100 pi BMM. - Anvendelse af en 5 ml pipette, overfør 0,5 mlorganoids resuspenderes i frysning medium til sterile kryogene hætteglas.
- Overfør hætteglassene til en celle kølecontaineren og sætte det ved -80 ° C.
- Efter 24 timer overføre hætteglassene til opbevaring i flydende nitrogen.
5. Etablering Kulturer fra frosne Organoids
BEMÆRK: Optø BMM på is og holde det på is. Lad BM nå RT, og opvarme en 10 ml alikvot til 37 ° C, inden proceduren ifølge optøning én cryovial.
- Optø hætteglasset hurtigt ved omrøring i et 37 ° C vandbad, indtil der er stadig lidt frosne materiale.
- Overfør optøede organoids til en 15 ml konisk rør ved hjælp af en P1000 pipette.
- Umiddelbart efter, tilsættes 1 ml varmt BM dråbevis under omrystning bunden af røret. Når 1 ml medium tilsættes, blandes omhyggeligt ved pipettering op og ned et par gange for at fortynde frysemedium.
- Langsomt (dråbe for dråbe) tilsættes 9 ml varmt BM til den koniske rør contalingen de organoids. Vend et par gange.
- Spin cellesuspensionen i 3 min ved 85 xg og 8 ° C.
- Supernatanten kasseres forsigtigt uden at forstyrre pelleten. Resuspender organoide i 90 pi FCM suppleret med RhoKi (trin 1.3.3). Derefter tilsættes 110 ul BMM.
- Tilføj 35 pi til hver brønd i en forvarmet plade med 24 brønde, hvilket gør bittesmå, adskilt dråber.
- Overfør pladen til 37 ° C inkubator, hvorefter pladen på hovedet for 20-30 min.
- Der tilsættes 500 pi FCM med RhoKi til hver brønd og overføre pladen tilbage i inkubatoren (figur 4A - 4C).
- Når organoids har genvundet ordentligt fra optøning, fortyndes i mere BMM så hver 10 pi af BMM indeholder 25-30 organoids. Denne procedure kan udføres 2-3 dage efter optøning (figur 4D - 4G) og sikrer en korrekt vækst af organoide.
6. forskolininduceret hævelsesige (FIS)
BEMÆRK: Fsk titrering giver mulighed for måling af CFTR resterende funktion. For CFTR modulation, er organoids udsat for en given corrector (f.eks VX-809) og / eller potentiator (f.eks VX-770), afhængigt af genotypen. Normalt er VX-809 tilføjet 18-24 timer før målingen, mens VX-770 og Fsk tilføjes lige før du starter målingerne. Vær opmærksom på at nogle modulatorer (korrektorer / potentiatorer) kan binde til plastoverfladen af assaypladen.
- Plating for Assay
BEMÆRK: VX-809 lagre alikvoteres ved 20 mM og opbevaret ved -80 ° C. Når optøning, forlader ved stuetemperatur, og beskytte mod lys.- Bearbejde organoids som beskrevet i afsnit 3.3.
- Hvis teste VX-809 corrector, fremstille en dosisresponskurve tredobbelt med følgende koncentrationer: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 og 30 uM. Forbered fortyndinger i FCM.
- Til den 96-brønds plade tilsættes enten 100 μL FCM med de respektive VX-809 koncentration eller 100 pi FCM kun og inkuber pladen.
- Måling af Assay
BEMÆRK: VX-770 bestande alikvoteres ved 20 mM, mens Fsk er på 10 mM; begge opbevares ved -80 ° C. Når optøning, forlader ved stuetemperatur og beskyttet mod lys.- Tag et hætteglas af calcein og DMSO og henstår ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Tilføj 5.1 pi DMSO til hætteglasset, hvor calcein tilvejebringes som et pulver, hvis uåbnet. Ellers skal du bruge et allerede resuspenderes calcein hætteglas indeholdende 2,5 pi calcein.
- Tilføj 2,5 pi calcein til 580 pi BM i et 1,5 ml rør og mærke det.
- Tilsæt 10 pi af denne farveopløsning (BM + calcein) til hver brønd med en gentagelse pipette.
- Resuspendere en gang med en multikanal at sikre, at farvestoffet er blandet godt.
- Inkubér pladen i en 37 ° C inkubator i 30 min.
- Under calcein inkubation begynde at forberede FSKog VX-770 løsninger, hvis det er nødvendigt.
- Hvis der anvendes en VX-770 potentiator, fremstille en dosisresponskurve i tre eksemplarer med følgende koncentrationer: 0,0003, 0,003, 0,03, 0,3, 3,0 og 30 uM. I tilfælde af en Fsk titrering, koncentrationerne er: 0, 0,008, 0,02, 0,05, 0,12, 0,32, 0,8, 2,0, og 5,0 uM. Forbered fortyndinger i BM.
BEMÆRK: Fsk, VX-770, eller et andet lægemiddel, tilføjes på den anden dag, de fortyndinger skal fremstilles ved 2x endelig koncentration, da 100 pi af Fsk / drug titreringsopløsningen vil blive tilføjet til hver brønd, der allerede indeholder 100 pi FCM. - Overfør FSK og VX-770-løsninger, en P200 pipette, og tips til mikroskopet værelse.
- Til billeddannelse FIS-analysen, bruge en levende celler konfokal mikroskop udstyret med en automatiseret scene, et opvarmet kammer, og CO 2 flow.
BEMÆRK: Følgende trin henviser til en bestemt mikroskop. Forskellige opsætninger bør gælde for andre mikroskoper efter producentensinstruktioner. - Sæt plade med 96 brønde i pladeholderen.
- Indtast de konfokale indstillinger for billedbehandling.
- Forudindstil live imaging værktøj til 37 ° C og 5% CO2 og lad kammeret præinkuberes i mindst 30 minutter før måling.
- Brug "Smart setup" mulighed for at vælge Alexa fluor-488 spor.
- Sæt 5X objektiv og scanningsområdet til 0,6x for at zoome ud og fange hele godt.
- Tilpasse lasereffekten og detektor følsomhed for at muliggøre optimal detektering af calcein-grøn mærkede organoids over baggrunden. Pinhole kan øges til 130 um, og billedet gennemsnitsberegning kan indstilles til 2.
- Indstil bit dybde på 8 og rammen størrelse til 512 x 512.
- Brug tidsserien mulighed for at indstille måling tid, frekvens og intervaller.
BEMÆRK: Foreslået for regelmæssige målinger: 1 time med 10 min interval: cykler = 7 (cyklus 1 er T = 0). For målinger af reduceret hævelse, organoider kan afbildes i op til 3 timer. - Brug flise mulighed for manuelt at bestemme de enkelte brøndpositioner.
- Tilsættes 100 pi af FSK og / eller VX-770 løsninger til de tilsvarende brønde, efter samme rækkefølge som målingen. Begynd at tilføje løsningerne i den første afbildet godt og fortsætte med den billeddiagnostiske rækkefølge.
- Start målingen.
- Efter eksperimentet er færdig, skal du gemme filen.
- Analyse af FIS Assay Data
- Opret en "organoide analyse" makro til dataanalyse af FIS-analysen ved hjælp af analyseværktøjet i et billede analyse software, der genkender alle strukturer afbildet gennem Alexa-488 spor og fylder de identificerede strukturer til at beregne forøgelsen af den samlede organoide området over forskellige tidspunkter.
- Åbn datafil med de erhvervede billeder i billedet analyseprogram.
- Vælg makro til organoide analyse. <li> Indstil tærsklen for at afbalancere forholdet signal-støj i en brønd på tidspunkt 1 og sikre, at alle organoide strukturer anerkendes og fyldes.
- Check i 4-6 brønde for at se, om alle strukturer også indregnes på tidspunkt 7. Lidt ændre tærsklen til at sikre, at baggrunden signalerne ved tidspunkt 7 ikke er anerkendt som strukturer (det specifikke tærskel kan ændre sig lidt mellem forsøgene).
- Sæt kriterierne for minimal område størrelse af anerkendte objekter til 1000 um 2.
- Tryk på "analysere" for at starte. Analysen tager ca. 3 min, afhængigt af den anvendte software.
- Når softwaren er færdig, gå til "skabe bord" og vælg følgende data: godt tal (tabel bør stige i denne rækkefølge), tidspunkter, og det samlede areal per brønd.
- Gem filen som en .xlm at eksportere til et regnearksprogram.
- I dette program, beregne den relative stigning i areal pr well ved at indstille området for tiden punkt 1, på 100%. Beregne arealet under kurven (AUC) fra tidspunkter 1-7 pr tilstand; den nedre grænse af området (Y-værdi) er sat til 100%. FSK eller narkotika titreringer (X-akse) er afbildet mod AUC (Y-aksen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser et repræsentativt frisk isolering af krypter indlejret på BMM. De krypter er fra en kolorektal biopsi af en CF emne. Normalt er en organoide genereret fra hver crypt (figur 1A - C). På grund af den dysfunktion af CFTR, de fleste af kolon CF organoids ikke cystisk, men snarere er kompakte og med fremspring og buddings (figur 2A - 2B). Men nogle CF organoide kulturer, især med høj residual funktion, har et par organoids med cystisk form (figur 2C), som vildtype organoide kulturer (figur 2D).
Før passage af organoids til udvidelse af kulturen eller såning en FIS assay er vigtigt, at organoids har en stor størrelse med flere buddings, som vist i figur 3A. Hvis organoids er små og uden numerous buddings når forarbejdet til passage, er det organoide kultur påvirket negativt. Afhængigt af kvaliteten og aktiviteten af væsentlige vækstfaktorer såsom EGF, Wnt-3A, og Rspo3, de organoids nå den ønskede størrelse mellem 7 og 12 dage (figur 3A). Efter mekanisk ødelæggelse, er buddings forstyrret og anvendes til at generere nye organoids i følgende passage (figur 3B). Hvis det ved behandlingen af organoids til frysning, er det vigtigt, at de trypsiniseres til en lille størrelse, som vist i figur 3C. Efter trypsinisering, er organoids belagt til 1 eller 2 dage for at lade dem komme fra stress af manipulation. Dette trin, sammen med den lille størrelse af de organoids, sikrer en 98% celleindvinding efter optøning (figur 4A).
Når organoids optøs, er det vigtigt at have dem i høj tæthed, så normalt er de optøet i etlille volumen (Figure4A). Efter en eller to dage i kultur, og efter at have bemærket, at organoids er stigende størrelse (sammenlign figur 4A med figur 4B - 4C), de organoids fortyndes i et forhold på 20-30 organoids pr 10 pi BMM, der giver ret densitet at vokse til en større størrelse. Hvis organoids også fortyndes, kan de bremse væksten og kan endda differentiere og dø. Hvis organoids er for overfyldt, pladsmangel eller mangel på vækstfaktorer også forsinker væksten af organoids og reducerer antallet af buddings.
Yderklædningen af organoids fra levedygtige kulturer med begrænset cellerester bør resultere i tilstande, hvor> 95% af de organoids kvælder ved Fsk stimulering, forudsat at tilstrækkelig CFTR-funktion er til stede (figur 5A - 5B). Organoids svulme i en genotype- og lægemiddel-afhængig måde, somillustreret af repræsentative billeder af organoids med to F508del alleler (figur 5A) og organoids forbindelse-heterozygote for F508del og S1251N (figur 5B), en CFTR gating mutation forbundet med noget resterende funktion.
Til kvantificering hævelse forventes de samlede calceinholdige grøn overfladearealer udvalgt for hvert tidspunkt og udtrykt som procent af T = 0 (sat til 100%, figur 6A). Brudstykker og små, ikke-kvældende strukturer er typisk under 5% af det samlede overfladeareal. Det relative areal stigning udtrykkes pr 10 min tidsinterval, og AUC (arbitrære enheder) målinger genereret for hver betingelse (T = 0 til 60 min, baseline tærskelværdi sat til 100%, figur 6B). Vi fandt AUC at være den mest robuste, da det indeholder en vis variation i initiering af hævelse, samt en krum forhold ud over 30-40 min på Fsk ved høj CFTR funktionsniveauer.
figur 6C). Organoids forbundet med CFTR residualfunktion kan nå op til 4.500 AUC enheder efter 60 min på 5 uM Fsk stimulation i fravær af CFTR modulatorer (200-220% overfladeareal af præ-FSK betingelser). Organoide hævelse når et loft på ~ 4.500 AUC enheder, formentlig på grund af de fysiske begrænsninger for de organoide strukturer, det hastighedsbegrænsende virkning af basolaterale ion transport og etablering af ion- og væske-transport homeostase under "strakte" betingelser. FSK kan titreres til yderligere at udvide det dynamiske område for analysen ved disse høje CFTR residualfunktion niveauer for bedre at kvantificere tilbageværende funktion eller højeffektiv Forbindelse behandling (fx som vist ved den højere aktivitet af VX770 på ekspandering af S1251N organoids ved stimulering med lavere FSK koncentrationer, figur 6D).
Figur 1: Etablering af CF kolorektale organoids fra biopsier. (A) Repræsentative billeder af isolerede materiale fra en rektal biopsi efter at være blevet indlejret i BMM på isolation dag (passage 0, dag 0). Udvidelsen af den angivne krypt vises på den nederste højre panel. (B) De samme krypter blev fulgt efter 7 dage i kultur (passage 0, dag 7). Udvidelsen af samme krypt præsenteret i panel A er vist. (C) repræsentant billede af samme organoide kultur 11 dage efter at være split (passage 1, dag 11). Scale barer = 100 um.
159fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af CF kolorektale organoids afledt fra individer med forskellige CFTR mutationer. Repræsentative billeder af CF kolorektale organoids fra individer med F508del / F508del (A), F508del / R117H-7T (B), og F508del / S1251N (C) mutationer. (D) Repræsentant billede af en kolorektal organoide kultur fra en vildtype CFTR emne. Scale barer = 100 um. Disse billeder blev opnået med ingen Fsk stimulation. Klik her for at se en større version af dette tal.
5159 / 55159fig3.jpg "/>
Figur 3: Forarbejdning CF kolon organoids til vedligeholdelse og analyse eller til frysning. (A) Repræsentative billeder af et CF kolon organoide kultur klar til at blive forarbejdet til enten passage (B) eller frysning (C). (B) Efter deres mekaniske forstyrrelser, er små stykker dannet, som vil generere nye organoids i næste passage. (C) Efter trypsinisering, er meget små, runde organoids genereret, lette deres levedygtighed under fryseprocessen. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Opbygning af en CF kolorektal organoide kultur fra frosne organoids. (<strong> A - C) Repræsentative billeder af en CF kolorektal organoide kultur optøede på dag 0 (A). Billeder fra samme brønd blev taget on (B) og to (C) dage efter. (D - G) Repræsentative billeder af fortyndingen trin beskrevet i afsnit 5.9. Når organoids har genvundet korrekt fra optøning (dag 3 efter optøning), er de fortyndede, så de har plads til at vokse (D). Billeder fra samme brønd blev taget seks (E), ti (F), og femten (C) dage efter optøning. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: forskolininduceret hævelse af CForganoids. (A og B) Repræsentative billeder af F508del / F508del (A) eller F508del / S1251N (B) kolorektale organoids før-770 VX eller efter 60 min af stimulation med Fsk (5 um) i fravær eller tilstedeværelse af (3 um]) eller VX-770 i kombination med VX-809 (3 um). Scale barer = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kvantificering forskolin-induceret kvældning. (A) Repræsentative billeder af organoide områdevalg ved en billedanalyse software F508del / S1251N organoids før (0 min) og efter 60 min af stimulation med Fsk (5 uM) og VX770 (3 uM). Scale barer = 200 um. (B) repræsentant billeder af det relative areal forøgelse af F508del / F508del eller F508del / S1251N organoids løbet 60 min på Fsk (5 um) stimulation i fravær eller nærvær af VX770 (3 um) og / eller VX809 (3 um). (C) areal under kurven målinger af betingelser i (B) (T = 60 min, baseline tærskel = 100%). (D) areal under kurven målinger af F508del / F508del eller F508del / S1251N organoids ved forskellige koncentrationer af Fsk. Data repræsenterer gennemsnittene ± SD fra enkelte repræsentative eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her giver vi et komplet protokol til frembringelse, ekspansion, frysning, og optøning af humane kolorektale organoids. Mens vi har etableret menneskelige organoide kulturer nogen tid siden 17, har det nogle gange vist sig vanskeligt at etablere teknologien i andre laboratorier uden hands-on træning. Vi forventer, at disse protokoller vil erstatte en sådan uddannelse.
Wnt-3A-medium er en af de mest afgørende reagenser for at lykkes i at etablere og opretholde en langsigtet organoide kultur. Faktisk kunne organoide kulturer "crash", når de udsættes for Wnt-3A-conditoned medium med lav aktivitet. Siden Wnt-3A-medium er foretaget internt, er der flere aspekter, der skal tages i betragtning, når der genereres en aktiv medium. Aktiv Wnt-3A kan kun produceres i medium med høj kvalitet føtalt bovint serum (FBS), der tilvejebringer de rette vækstsignaler til L-celler og stabilisering af hydrofobeWnt-3A molekyler. Når Wnt-3A aktivitet er lav (dvs. lav TOP / FOP nøgletal, se nedenfor), er det normalt de FBS, der er årsag til problemet.
Kommerciel rekombinant Wnt fungerer dårligt, så vi anbefaler ikke at bruge det som positiv kontrol for TOP / FOP Wnt reporter assay. Forholdet mellem TOP / Renilla og FOP / Renilla er en indikation af Wnt aktivitet konditioneret medium, så en god portion af Wnt-3A-medium giver en TOP / FOP forhold højere end 25, sammenlignet med TOP / FOP værdi fra den negative kontrol: medium ikke er udsat for Wnt-3A-producerende celler. Rekombinant Noggin og R-spondin kan erstattes af Noggin og R-spondin konditioneret-medium 28, 29.
Den nuværende protokol beskriver også en funktionel test for CFTR-FIS-analysen. Vi har for nylig demonstreret forholdet mellem CFTR genotype og FIS og hvordan dette afspejler offentliggjort CFTR genotype-fænotype relationer opnået fra kliniske registre (www.CFTR2.org) 25. Anvendelse af dette assay blev to personer med ekstremt sjældne CFTR mutationer identificeret, hvis organoids var reagerer på ivacaftor (VX-770) 25. Efterfølgende ordination af dette stof resulterede i entydig klinisk respons, fremhæver værdien af FIS-analysen for at matche specifikke lægemidler med patienter med sjældne mutationer i mangel af kliniske forsøgsdata. Essential til kvantificering af FIS er optimale vækst- og assaybetingelser, kun angivet ved en begrænset fraktion af ikke-hævelse organoids (normalt under 5%). Høje niveauer af vragrester fører til undervurdering af hævelse, som en større andel af ikke-levedygtige, ikke-ekspandering strukturer er anerkendt af billedet analyse software.
Korrelationer mellem in vitro FIS svar og tidligere etablerede CFTR-afhængige biomarkører (sved klorid koncentration og INTESTnelle nuværende målinger) på den personlige niveau var let påviselige i vores tidligere undersøgelser 19, 25. Dette understøttes forestillingen om, at resterende funktion målinger ved hjælp af FIS om emner med CF kan supplere de nuværende tilgange som et diagnostisk eller prognostisk markør i en personlig mode. Den gennemløb af FIS-analysen i forhold til andre biomarkører for CFTR-funktion, såsom sved klorid koncentrationsmålinger in vivo og tarm aktuelle målinger i ex vivo rektal biopsier, giver mulighed for bedre kontrol med teknisk variabilitet. Det giver også et fuldt CFTR-afhængig udlæsning og et stort dynamikområde ved anvendelse af en titrering af Fsk som nøjagtigt typer residual CFTR-funktion.
Men FIS-analysen afspejler kun virkningen af den enkelte genotype på variabilitet narkotika effekt, mens modulation af CF sygdom er påvirket af mere end kun CFTR-funktion. For drug respons, er assayet reflekterende af en potentiel vævsreaktion. Selvom meget præcis i CFTR måling menneskelig variation i farmakokinetik ikke indarbejdet, i modsætning til andre in vivo 7, 8 eller direkte ex vivo CFTR målinger 32. Som tidligere omtalt, er ikke CF modifikatorer (både genetiske og miljømæssige) også påvirke fænotype, hvilket medfører en modsætning mellem in vitro-observationer eller CFTR biomarkører og kliniske fænotype 2. Endvidere er identifikation af potentielle responsive mutationer ved hjælp af cellelinjer 33 forbundet med mindre indvirkning på patienter, der har brug for at få en rektal biopsi for etablering af organoids.
Flere CFTR-targeting lægemidler er i øjeblikket under udvikling 1. Det forventes, at kliniske forsøg ikke vil tillade en korrekt forudsigelse af klinisk effekt Based på CFTR mutationsstatus alene. Som FIS assayet måler CFTR funktion og lægemiddelrespons funktionelt, kan det blive den foretrukne metode til at bestemme, hvilken lægemiddel virker bedst for hvilken patient. FIS assay kan også være nyttige til identifikation af patientgrupper, der skal indgå i registrerings- forsøg og til udvikling af hidtil ukendte modaliteter narkotika. Stimulering af kolorektale organoids med plasma før og under behandlingen kan yderligere bidrage til at kvantificere funktionelle mængder af cirkulerende CFTR modulatorer i blod, potentielt lette personlig dosering og udvælgelsen af medikamentdoser i kliniske forsøg 30, 31. Endelig kan FIS være nyttigt for en bedre grundlæggende forståelse af CFTR-funktion og dens interaktion med andre-så langt overvejende unknown- genetiske modifikatorer af dens funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af HIT-CF program af den hollandske CF fundamentet (NCFS), ZonMw (40-00812-98-14103), Wilhelmina Børns Research Fund Hospital og CZ, og Zilverenkruis / Achmea. Vi vil gerne takke S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, og G. Berkers (Department of Pediatric Pulmonology, Wilhelmina Børnehospital, UMC Utrecht), og RHJ Houwen (Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Børnehospital, UMC Utrecht) til at nærme patienterne og få biopsier til generering af en CF Biobank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100x | 1x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H2O | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1% BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H2O | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
References
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).
- Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).
- Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
- Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1 (1), e27112 (2014).
- Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
- Ommen, D. D. Z. -V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).
- Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. , (2016).
- Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. , (2016).
- Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84 (2016).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
- Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
- Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).
- Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).
