Introduction
CF는 상피 음이온 채널을 암호화하는 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도도 조정기 (CFTR) 유전자의 돌연변이에 의해 발생합니다. CF는 전 세계적으로 1 약 85,000명에 영향을 미친다. 2,000 CFTR 돌연변이는 (확인되었다 www.genet.sickkids.on.ca ). 이러한 다양성은 부분적으로 관찰 질환 표현형 (넓은 스펙트럼을 설명 www.CFTR2.org ) 2, 3. CFTR 돌연변이 여섯 클래스 CFTR 단백질 발현과 기능에 미치는 영향에 기초하여 정의된다 : (I)없이 합성 (II) 손상 피킹 (III) 불량 채널 게이팅 (IV)가 변경 컨덕턴스 (V하면) 보통의 수준을 감소 CFTR를 작동하고 (VI) 손상된 세포 표면 안정성 4. 일반적인 CFTR 돌연변이가 잘 연구되어 있지만, CFTR 기능과 임상 적 상태와 관계 poorl 유지Y는 특히 드문 "고아"돌연변이 (의 큰 그룹에 대해 각 레벨에서 이해 www.CFTR2.org ) 1,3.
최근 약물 돌연변이 특정 방식으로 CFTR 단백질을 대상으로 개발되어왔다. CFTR 단백질 표적 약물의 두 클래스는 임상 현재 사용중인 액션의 독특한 모드가 있습니다. 이러한 VX-770과 같은 강화제는 치근단 지역화 돌연변이 CFTR의 개방 가능성을 향상시키고 세포 5에 자신의 추가에 직접 작용한다. 이러한 VX-809과 같은 교정기는 소포체 지역화 잘못 폴딩의 CFTR의 인신 매매를 복원하고 효과 전에 세포가 6 관찰과 사전 배양이 필요합니다. CFTR의 강화제, VX-770과 같은 다른 팔에 관해서는, G551D 돌연변이 7,8 피험자에 등록되었습니다CFTR은 S1251N (9)를 포함하여, 돌연변이를 게이팅; 함께, 이러한 돌연변이는 모든 CF 과목의 5 %에 의해 수행된다. 다른 임상 시험, VX-770, 보의 VX-809과 결합이 폐 기능에 아직 심각한 영향을 제한 한 것으로 나타났다 환자 10 45-50%에 의해 전달되는 F508del 돌연변이에 대한 동형 접합을 대상으로 악화 속도의 감소가 발생했습니다 11.
CF 환자의 나머지 50 % 이내 약물 반응 주체를 식별하는 종래의 임상 비용과 시간을 소모하며, 매우 드문 CFTR 유전자형을 가진 개인 가능하지 않다. 신규 비용 효과적인 개인화 방법 CFTR 돌연변이 임의의 타입을 운반하는 개인 CFTR 조절제의 증가와 일치하는 것이 중요하다. 지금까지 특정 CFTR 돌연변이를 운반하는 환자 그룹의 시험 포함은 시간에 돌연변이 CFTR 유전자 형질 전환을 사용하여 연구에 의해 유도 된챔버들 (5, 6), (12)를 전기 생리 학적 연구에 Ussing 하였다 eterologous 전지 시스템. 때문에 CF 폐 이식편 재료로부터 유도 된 공기 - 액체 계면 분화 기관지 상피 세포에서의 CF 적절한 동물 모델 약물 효능 연구의 부족 약물 개발 13, 14, 15에 사용되었다. 그러나, 폐 절편 조직 및 침습적 제한된 가용성 흔하지 CFTR 돌연변이의 분석을 방해 말기 질환이없는 환자에서 기관지 세포를 수득하고, 개인화 된 방식으로 약물 검사를 방지 할 수있다. 이러한 제한 등 대장 organoids, 비강기도 세포와 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된기도 세포와 같은 "쉽게 접근"조직을 극복하기 위해, 현재 맞춤 약물 치료에 대한 탐구되고있다.
(16), (17)의 형태로 어떤 위장 기관에서 배양 상피 줄기 세포에 대한 프로토콜을 설립했다. 인간 대장 / 직장 들면, 배양 조건이 정의 된 것을 포함 성장 인자 (상피 성장 인자 (EGF), 가스트린,이 Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3) 및 소량) 소분자 (니코틴 A83-01와 결합 지하실 막 매트릭스 및 SB202190). 이러한 조건에서, 하나의 줄기 세포 또는 소규모 조직 단편 바깥쪽으로 향한 기부 쪽 고도로 편광 된 상피 세포에 의해 형성된 폐쇄, 낭포, 3 차원 구조 속으로 성장한다. 모든 세포 유형은 일반적으로 정상 비율과 위치에 나타납니다. Organoids 주간 기계적 파괴 및 재 도금에 의해 장기간에 걸쳐 확장 될 수있다. 그들은 유전자 표현형과 안정하고 장기간 팽창 바이오 뱅킹 17 있도록 저장 될 수있다. 그들은 의무가 있습니다모든 표준 세포 생물 / 유전자 조작 및 분석 기술은 2D 셀 라인 (18)을 위해 개발.
최근 CFTR 기능이 용이 포스 콜린 - 유도 부종 (FIS) 분석 19 (20) 대장 organoids 측정 할 수 있음을 보여 주었다. 콜레라 독소 대안 포스 콜린 (FSK) 또는에 노출되면 organoids 급속히 그들 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 수준을 증가되는 CFTR 채널 (19)의 개구부에 회전 결과이다. 건강한 사람에서, 또는 잔여 기능과 관련된 CFTR 돌연변이와 과목에서 Organoids는 이후 organoid 루멘, 분비 성 설사의 체외 상당 이온과 물 수송의 결과로 팽창 할 것이다. CFTR 널 개체로부터 유래 organoids으로 나타낸 바와 같이 대장 organoids FIS의 응답은 이전에 완전히 CFTR 의존적 도시 된특정 약리학 CFTR 억제제 (19)의 사용에 의해 찾지. 큰 주제 특정 데이터 세트는 조직 검사를 복용 후 몇 주 내에 유도 될 수있다.
여기에 상세하게 설명 FIS 분석의 경우, organoids는 나이와 제한된 불편 (21)를 얻을 수있다 직장 생검에서 배양한다. Organoids 쉽게 다시 봉인하고 새로운 organoids을 형성 한 지하실에 기계 중단으로 매주 계대 있습니다. FIS 분석을 실행하는 경우, ~이 중단 작은 organoids의 30 ~ 80은 96 웰 플레이트 (19)의 각 웰에 도금되어있다. 분석의 일에서, organoids는 칼 세인 녹색, 그것은 라이브 영상을 용이하게 살아있는 세포 내에서 유지되는 형광 세포 투과성 염료로 염색한다. 그런 다음, 세포 내 cAMP를 제기하여 CFTR을 활성화 FSK는 organoid 부종을 자극하기 위해 추가됩니다. 혀끝의 CFTR에 따라 행동 강화제를 동시에 w 추가포스 콜린 i 번째, CFTR 인신 매매를 복원 보정기 반면 FSK를 추가하기 전에 24 시간을 추가됩니다. organoid 붓기는 포스 콜린을 첨가 할 때마다 포인트에 대한 모든 형광 객체의 전체 면적의 상대적인 증가를 계산하는 자동화 된 이미지 분석에 의해 정량화한다.
3D는 붓기가 챔버 Ussing에서 2D 배양기도 세포에서 기존의 전기 생리 CFTR 판독을 통해 장점과 단점을 제공 organoid. 주요 장점은 부종 검정의 스루풋이다. 세포 배양 배지의 한 유형을 이용하여 분석하고, 숙련 된 기술자는 12 환자 샘플에서 주당 약 1,200 데이터 포인트를 배양 매주 25 organoid 샘플까지 정량화 할 수있다. 우리는 통상적으로 판 당 중복 또는 세중의 측정에 의해 하나의 실험 조건을 입력하고 3 개의 독립적 인 배양 시간 지점에서 이러한 측정을 반복합니다. 총, 약 300-500의화롯불 organoid 구조는 다음 제한 기술 변화와 CFTR 기능의 매우 정확한 측정에 리드 실험 조건에 따라 측정된다. 이 정밀도는 우리가 명확하게 CFTR 변조기에 잔류 기능 및 응답의 차이를 정의 할 수 있습니다 용이 동일 CFTR 돌연변이 19, 22, 23, 24, 25를 들고 환자 사이의 유전 적 배경 효과를 데리러 우리를 할 수 있습니다. 데이터 품질 용이 현미경 이미지에서 평가 될 수있다. FIS가 완전히 CFTR에 의존하지만,이 CFTR 기능에 대한 간접적 인 결과 측정, 유체 수송에 이온 수송의 결합에 의한 그 판독. 이 transepithelial 이온 전류 (26)를 측정 Ussing 실에서 직접 CFTR 기능 측정과 대조. Ussing 챔버 꼭대기 또는 기저 (c)의 선택 자극을 허용ompartments합니다 (organoid 분석이 허용하지 않는); 기저 막을 permeabilizing함으로써, 정점 CFTR 의존성 음이온 분비 선택적 (27)를 측정 할 수있다.
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Protocol
여기에 설명 된 인체 조직을 사용하는 모든 실험은 대학 의료 센터 위트 레흐트에서 윤리위원회에 의해 승인되었다 (UMCU, TcBio 번호 14-008)를. 조직 수집, 생성, 저장 및 organoids의 사용에 대한 동의는 빌헬미나 어린이 병원 (WKZ) -UMCU에서 환자로부터 얻은 것입니다.
| 장비 | 소모품 | 도구 |
| 층류 후드 | 도 15 및 50 ㎖ 원뿔형 튜브 | 자이스 혈구 LSM 800 - 이미지를 측정하는 젠 2 (블루 에디션) 소프트웨어 |
| CO 2 배양기 | 의 microfuge 튜브 | 마이크로 소프트 엑셀 프로그램 |
| 세포 배양 현미경 (조명 / 광학 현미경) | 0.22 μm의 필터 | |
| 원심 분리기 | 혈청 학적 피펫 | |
| 롤링 셰이커 | 마이크로 피펫 필터 팁 | |
| 인큐베이터 4 ° C 형 방 4 ° C 형 냉장고 | 크리오 바이알 (cryovial) | |
| 컨테이너 냉동 CoolCell 셀 | ||
| 혈청 학적 피펫 | ||
| Micropippette (1000, 200, 20 μL) | ||
| Viaflo 반복 피펫 | ||
| (라이브 셀) 공 초점 현미경 | ||
| 컴퓨터 | ||
| 액체 질소 탱크 | ||
| 멀티 채널 (200 μL) |
문화 1. 준비 시약
- 기초 배지 제조
참고 : 기저 매체 (BM)는 (4- (2-hydroxyethil)로 보충 햄의 영양 혼합물 F-12 (AD-DF) -1piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 글루타민, 페니실린 / 스트렙토 마이신과 고급 둘 베코의 변형 이글 중간에 펜을 의미 / 연쇄상 구균).- 500㎖의 AD-DF 매체 병, 5 내지 200 mM의 글루타민의 ㎖, 1 M HEPES 5 ㎖, 펜 / 패 혈성 용액 5 ㎖ (10,000 U / ㎖, 10,000 μg의 / ㎖)을 추가한다.
- 적어도 4 주 동안 4 ° C의 냉장고에 보관 BM.
- 이 Wnt-3A 에어컨 중간 준비
참고 :이 Wnt-3A 에어컨 매체를 만들어 사내 날기g 제조업체의 지시에 따라 세포주의 Wnt-L-3A.- 의 Wnt-3A 에어컨 매체를 수확를 들어, 한 주 동안 세포에 노출 매체를 수집하고 부유 세포를 제거하기 위해 450 XG에서 5 분 정도 스핀 다운.
- 0.22 μm의 필터를 통해이 Wnt-3A 에어컨 매체 필터 50 ML 원뿔 튜브에 40 ml의 분취 량으로 나눕니다. 활성의 손실없이 최소 4 개월 동안 4 ° C에 저장합니다.
- 인간 배아 신장 (HEK)를 사용하여 TOP / FOP 분석법에서 레 닐라와 리면 FOP-루시페라아제 및 TK- 레 닐라 형질 측정 -293 세포를이 Wnt-3A - 조정 배지의 활성을 테스트하기에 따라 분석 키트를 -luciferase 제조업체의 지침.
참고 : TOP-루시 페라 제는 야생형 TCF 결합 영역을 포함하는 리포터 플라스미드이다. 의 Wnt-3A 에어컨 매체가 활성화 된 경우, 정식 Wnt 신호가 활성화됩니다. 베타 - 카테닌은 재치를 연결하는 핵으로으로 전위시간 TCF / LEF 전사 인자 및 상기 기판이 첨가 될 때 상대적 루시 페라 제 활성 증가를 유도 루시퍼 라제 리포터의 전사를 활성화시킨다. TCF의 돌연변이 된 루시 페라 제 유전자의 상류 영역이 결합하기 때문에 FOP-루시페라아제를 음성 대조군으로서 사용된다.
- 콜론 중간 준비
참고 : 준비하고 제조업체의 권장 사항에 따라 모든 성장 인자 및 시약을 희석. 소형 분취에게 피 동결 - 해동 사이클을 사용한다. 기능성 성장 인자 결과 필수적이다.- 1 배 B27, 1.25 mM의 N 아세틸 시스테인, 50 NG / ㎖ hEGF, 5 나노 가스트린, 10 MM의 니코틴, 300 NG / ㎖ hRspo3, 100 NG / ㎖ hNoggin, 500 μM A83-01으로 BM을 보완하여 대장 매체 (CM)를 준비 일차 세포 항균 10 μM SB202190, 100 μg의 / ㎖.
- 분취 액에 CM을 나누고 최대 4 개월 동안 -20 ° C에서 그들을 고정. 전체 대장을 준비하는 분취 액을 해동50 % 추가하여 매체 (FCM)가 CM에 매체의 Wnt-3A는-conditoned. 활성의 손실없이 최대 4 ° C에서 7 일 저장 FCM.
- 직장 생검에서 organoid 문화의 설립, 50 μg의 / ㎖ 반코마이신, 50 μg의 / ㎖ 겐타 마이신과 FCM을 보완, 10 μM (ρ) 관련 코일 코일 형성 단백질의 세린 / 트레오닌 키나제 억제제 (RhoKi). 단지 문화의 첫 2 ~ 3 일의 경우,이 매체라는 절연 매체 (IM)를 사용합니다.
- EDTA 원액 준비
- 0.22 μm의 필터로 멸균 초순수 H 2 O에 0.5 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), pH가 8을 준비한다.
- 지하실 막 매트릭스의 조작
- 제조업체의 권장 사항에 따라 기저막 매트릭스 (BMM)을 준비합니다.
- 하룻밤 얼음 해동 BMM.
- 15 ML 원뿔 관, 사용 병에서 BMM를 전송하는 경우5 ML의 피펫과 원뿔 튜브는 -20 ° C에서 미리 냉각 된 15 ml의.
- 해동 후, 4 ℃의 냉장고에 BMM을 저장하고 사용하기 전에 최소 30 ~ 60 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
참고 : 순서가 가장 좋은 결과를 얻을 수에서 BMM은 추위와 제대로 지하실 또는 organoids를 삽입하기 전에 혼합해야합니다.
2. CF 환자의 조직 검사에서 대장 Organoids 구축
주 : 조직 수집 후 식염수 얼음 위에 시료를 유지하는 것이 중요하고, 칼슘 이온과 마그네슘 2+ (DPBS) 또는 BM이없는 둘 베코 인산염 완충 식염수. 생검의 신속한 처리가 권장되지만 최대 7 일 동안 얼음에 저장 생검에서 organoid 문화를 구축 할 수 입증했다.
- 생검은 15 ML 원뿔 튜브의 아래쪽에 정착하고 뜨는을 제거 할 수 있습니다.
- 10 ML의 피펫을 사용하여 상하 조직 검사 및 피펫에 10 ~ 20 회 DPBS의 10 ML을 추가합니다.
참고 : 피펫은 조직 검사를 피펫 팅 전에 BM으로 미리 습윤 될 필요가있다. - 생검이 바닥에 정착하고 뜨는을 제거 할 수 있습니다.
- 상층 액이 깨끗해질 때까지 반복 2.2 및 2.3 ~ 5 번 단계를 반복합니다.
- 생검에 admin으로 10 ml의 200 μL의 EDTA (0.5 M)를 추가하고 4 ℃에서 60 ~ 120 분 동안 흔들 튜브 플랫폼에서 튜브를 배치합니다.
참고 : 배양 시간은 환자마다 다를 수 있습니다. 지하실이 해제되는 경우, DPBS 흐린된다. 지하실는 현미경으로 관찰 될 때 EDTA 배양이 완료 될 수있다. - 지하실 정착하도록 허용합니다. 상층 액을 버린다.
- 최대 BM의 2 mL를 취하여 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 추가합니다. 내부가 BM 덮여있는 방식으로 수동으로 새로운 관을 흔들어.
- 피펫을 사용하는 것은 BM으로 미리 습윤, 위아래로 10 ~ 20 번 생검과 피펫을 포함하는 튜브에 DPBS 2 ㎖를 추가합니다.
- 생검이 정착하고 새에 지하실로 DPBS를 전송하도록 허용단계 27에서 제조 된 BM의이 용액을 함유하는 관.
- 더 이상 지하실이 해제되지 않을 때까지 반복 2.8 및 2.9 단계를 반복합니다.
- 8 ° C에서 5 분 동안 130 XG에 지하실을 스핀.
- 한편, 실온에서 안전 캐비닛 (RT)에 IM을 전송합니다.
- 뜨는을 취소하고 지하실 펠렛 단계를 반복 2.11 BM 10 ㎖를 추가합니다.
- BM 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 5 ~ 10 μl를 타고 현미경으로 눈으로 지하실의 수를 계산합니다.
- 8 ° C에서 5 분 동안 130 XG에 지하실을 스핀.
- 상층 액을 제거하고 55 % BMM (V의 IM에 V의 BMM)에서 펠렛을 재현 탁.
참고 : 지하실은 μL 당 1 토굴에서 55 % BMM의 해당 볼륨에 재현 탁하고 있습니다. 충분한 지하실이 없으면 BMM의 최소 부피는 40 μL이다. - 시드를 들어, 잘 당 피펫 35 μL (24 웰 플레이트에서). 3-5로 BMM의 35 μl를 분할하는 촉진제의 확산을 개선하기 위해 별도로 삭제BMM에 요소 WTH. 거품을 만들지 마십시오.
- 놓고 BMM이 응고하는 적어도 20 분 동안 37 ° C에서 거꾸로 인큐베이터에서 접시를 둡니다.
- 물론 당 IM 500 μl를 추가하고 CO 2를 37 ° C에서 인큐베이터에 보관 5 %.
- 2-3 일마다 배지를 새로 고칩니다. BMM은 그대로 떨어 남겨두고 P1000 피펫 함께 피펫 팅에 의해 기존의 매체를 제거합니다. 조심스럽게하지 직접 BMM 방울에 잘의 측면에서 피펫 팅에 의해 FCM을 추가합니다.
참고 : 더 지하실이 분리 프로토콜에 출시되지 않은 경우, 상층 액을 원심 분리 BM으로 펠릿을 2 ~ 3 회 세척하고, BMM에서 그것을 재현 탁. 남은 조직을 가지고 면도칼 작은 조각으로 잘라. , 15 ml의 원추형 튜브에 이들을 모아서 이들을 원심 분리하고, 동일한 BMM에이를 재현 탁. 어떤 상피 줄기 세포가 존재하는 경우,이 또한 organoids를 생성합니다.
유지 보수, 냉동 및 용에 대한 콜론 Organoids의 3과 Passagingskolin 유도 붓기 분석 (FIS)
주 : 모든 organoid 문화가 자신의 배로 시간이 있습니다. 일반적으로 대장 CF의 organoids 1 확장 할 수 있습니다 : 3-1 : 5 시간마다 7~10일. 신진 구조가 관찰되는 경우 그것은 좋은 징조입니다. 대장 정상 organoids (그림 2D) 이상 - 대장 CF의 organoids는 작은 낭종 (2C 그림 2A)에 있습니다. 설치 및 유지 보수를 들어, organoids 24 웰 플레이트에서 배양; 냉동 용, 6 웰 플레이트에; 96 웰 만나고 있습니다에서 FIS 분석을위한.
- Organoids의 계대
- 사용하기 전에 적어도 30 ~ 60 분 동안 얼음에 BMM을 유지합니다.
- 사용하기 전에 적어도 1 시간 동안 RT에서 FCM을 유지합니다.
- 샘플 이름과 같은 다른 관 한 15 ML 원뿔 튜브 라벨 "씻어."
- 조심스럽게 BMM이 저하 방해하지 않고 P1000 피펫을 사용하여 우물에서 매체를 대기음.
- 도 1 및 b에 BM의 1 ML을 추가최대 reak BMM은 P1000 피펫을 사용하여 삭제합니다. 샘플 이름을 가진 15 ML 원뿔 관에이 1 ml에 전송합니다.
- BM의 또 다른 1 ㎖로 잘 세척과 같은 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 반복 (한 15 ML 원뿔 튜브에 세척하는 24 웰 플레이트 6 우물까지) 5 개의 우물과 3.1.5와 3.1.6 단계를 반복합니다.
- BM 12 ml의에 튜브까지 채 웁니다. 피펫 위로 미리 적셔 5 ml를 피펫을 사용하여 아래로.
- 8 ° C에서 5 분 85 XG에 스핀.
- 뜨는을 취소하고 펠렛에 BM 1 ㎖를 추가합니다. 같은 P1000 피펫 팁으로, 필터없이 P10 팁을 차지, 아래로 20 회를 피펫합니다. P1000 및 P10 팁을 모두 폐기하십시오.
- 5 ml를 피펫으로 BM의 4 ML을 추가 한면에 수직에서 약 70 ° 기울어 진 튜브를 개최합니다. 새로운 P1000 팁을 미리 젖은 및 P1000 (1 ml의 볼륨)에 적극적으로 2 ~ 3 회를 섞는다.
- 기울어 진 위치에 유지하면서, 10 개수 w를 신중 최상층 수집로 표시 튜브에 P1000 피펫 및 전송 4 × 1 ml의 i 번째 "씻어."
- 기울어 진 튜브의 바닥에 정착 organoids을 준수; 파쇄 organoids 더 큰 덩어리가 바닥에 가라 앉을 것입니다. 원심 분리기 15 ml를 85 XG에 8 ℃에서 5 분 동안 튜브를 "세척".
- 뜨는을 취소하고 55 % BMM의 최종 농도로 organoid 펠릿 중간 및 BMM의 필요한 양을 추가합니다. 거품 (그림 3B)을 생성없이 피펫 팅에 의해 아래로 섞는다.
참고 : 좋은 밀도가 BMM의 10 μL에 25 ~ 30 organoids 시드에 의해 달성된다. - 팔로우는 2.17-2.19 단계를 반복합니다.
- 동결에 대한 계대
- 사용하기 전에 적어도 30 ~ 60 분 동안 얼음에 BM을 유지합니다. 사용하기 전에 적어도 1 시간 동안 RT에서 FCM을 유지합니다.
- RhoKi (단계 1.3.3)로 보충 FCM을 준비합니다.
- 냉장고에서 트립신을 가지고 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 실온에서 둡니다.
- 단계에 따라 3.1.5-3.1.10.
- 가능한 한 많이 뜨는을 제거 30 초 동안 4 트립신 ml의, 그리고 소용돌이를 추가합니다.
- 30 초 동안 격렬하게 1 분 소용돌이, 37 ℃의 온수 배스에 튜브를 넣고.
- 튜브에서 솔루션을 검사합니다. 그대로 organoids는 현미경으로 여전히 볼 수 있습니다 경우, 단계 3.2.7를 반복합니다.
- organoids이 중단되는 경우, 트립신과 피펫 10 회 중화 BM의 8 ml를 추가합니다.
- 8 ° C에서 450 XG에 3 분 스핀.
- 뜨는을 취소하고 55 % BMM 솔루션에 도달하기 위해 organoids에 중간 BMM의 필요한 양을 추가합니다. 거품을 만드는없이 피펫 팅에 의해 아래로 섞는다.
참고 : 트립신 후 : 1 비율로 동결 들어, organoids는 1 시드해야합니다. - 종자 ~ 10 μL의 작은 분리 액적들을 생성하는 예열 6 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 250 μL. 37 ° C에서 인큐베이터에서 거꾸로 판을 놓고 떠나BMM은 20 ~ 30 분 동안 응고합니다.
- 물론 각 6 웰 플레이트에 신선한 FCM + RhoKi의 2.5 ML을 추가하고 인큐베이터 (그림 3C)에 접시를 전송합니다.
- FIS의 분석에 대한 Organoids를 계대
주 : 24- 웰 플레이트의 4, 6 웰 사이 organoids의 수와 크기에 따라서 96 웰 플레이트의 웰 (27)을 시드 충분하다.- 단계 3.1-3.1.13에서 설명 된대로 organoids을 처리합니다.
- 50 % BMM 120 μL에 펠렛을 재현 탁.
- 현미경 3 ㎕를 BMM 드롭에 organoids의 수 (30-50)를 확인합니다.
- 플레이트를 96 웰 페이트의 각 웰의 중앙에 배치 된 3 μL 한 방울을 이용하여 organoids.
- BMM이 응고하는 15 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓고; 추가 단계는 단계 6.1.1에 설명되어 있습니다.
4. 냉동 콜론 CF Organoids
참고 : 오르간OID를가 1~2일 트립신 및 배양 후 아래로 동결 할 준비가, 그래서 organoids는 여전히 해동 후 생존율의 효율성을 증가시키는 작은 것입니다.
- BM의 1 ML을 추가하고 BMM은 P1000 피펫을 사용하여 방울 헤어. 15 ML 원뿔 튜브에 전송합니다.
- 같은 15 ML 튜브에 BM 및 전송의 또 다른 1 ㎖로 잘 씻으십시오.
- 반복 모든 우물 4.1 및 4.2 단계를 반복합니다.
참고 : 초과 BMM 방지하기 위해는, 6 웰 플레이트의 3 우물 한 15 ML 튜브에 풀됩니다. - 12 차가운 BM ㎖의 피펫 위아래로 5 ML의 피펫으로 organoids를 포함하는 15 ML 튜브를 입력합니다. 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요.
- 450 XG에 3 분, 8 ° C에 대한 스핀과 뜨는을 제거합니다.
- 제대로 organoids를 재현 탁 위아래 중간 피펫을 동결과 organoids의 펠렛을 디졸브.
참고 : 동결 매체의 500 μL가 BMM 각각 100 ㎕를 위해 사용된다. - 5 ml의 피펫을 사용하여, 0.5 ml의 전송동결 매체에 재현 탁 organoids는 극저온 튜브를 멸균합니다.
- 세포 냉동 컨테이너에 튜브를 전송하고 -80 ° C에 넣어.
- 24 시간 후, 액체 질소 저장을 위해 튜브를 전송합니다.
5. 냉동 Organoids에서 문화 구축
참고 : 얼음에 BMM을 해동 얼음에 보관하십시오. BM은 RT에 도달하고, 해동 한 cryovial의 절차를 시작하기 전에 37 ° C에 10 ml의 나누어지는을 따뜻하게 할 수 있습니다.
- 아직도 조금 냉동 재료가 될 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 교반 빠르게 병을 해동.
- P1000 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 해동 organoids을 전송합니다.
- 상기 튜브의 하단을 진탕하면서 직후 드롭하여 따뜻한 BM 드롭 1 ㎖를 추가한다. 배지 1 ml를 첨가하면 동결 배지 희석 몇 번까지 피펫 팅에 의해 아래로 조심스럽게 혼합한다.
- 천천히 (적가)는 원뿔 튜브 접점에 따뜻한 BM의 9를 가하여organoids를 ining. 몇 번 반전.
- 85 XG 8 ℃에서 3 분 동안 세포 현탁액을 스핀.
- 펠렛을 방해하지 않고 조심스럽게 상층 액을 버린다. RhoKi (단계 1.3.3)로 보충 FCM의 90 μL에서 organoid를 재현 탁. 그런 다음, BMM의 110 μl를 추가합니다.
- 작은 분리 방울을 만들고, 미리 예열 24 웰 플레이트의 각 웰에 35 μl를 추가합니다.
- 거꾸로 20 ~ 30 분 동안 접시를 떠나 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다.
- 각 웰에 RhoKi와 FCM의 500 μl를 추가하고 다시 인큐베이터 (그림 4A - 4C)에 접시를 전송합니다.
- organoids가 해동에서 제대로 회복되면, 그래서 BMM 각각 10 μL가 25 ~ 30 organoids이 포함되어 더 BMM에 희석. 이 절차 (도 4d - 4G)를 해동 후 2-3일 할 수 있고 organoid의 적절한 성장을 보장한다.
6. 포스 콜린 유발 붓기로말 (FIS)
주 : FSK 적정은 CFTR 잔류 기능의 측정을 허용한다. CFTR 변조 들어 organoids 주어진 보 (예, VX-809) 및 / 또는 강화제에 노출된다 (예를 들어 VX-770), 유전자형에 따라. VX-770 및 FSK 바로 측정을 시작하기 전에 추가하는 동안 일반적으로, VX-809은 측정 전에 18 ~ 24 시간을 추가됩니다. 일부 변조기 (보정기 / 강화제)를 분석 플레이트의 플라스틱 표면에 결합 할 수 있음을 유의하십시오.
- 정량법에 대한 도금
참고 : VX-809 주식은 20 밀리미터에 분주 및 -80 ° C에 저장됩니다. 해동하면, RT에두고 빛으로부터 보호합니다.- 3.3 절에 설명 된대로 organoids을 처리합니다.
- VX-809 보정기를 테스트하면 다음 농도 삼중의 용량 - 반응 곡선을 제조 : 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0, 30 μM있다. FCM의 희석을 준비합니다.
- 96 웰 플레이트에, 하나 100 μ를 추가, FCM의 각각의 VX-809 농도 100 μL와 FCM의 난 단지와 접시를 품어.
- 정량법 측정
참고 : FSK 10 밀리미터에있는 동안 VX-770 종목이 20 밀리미터로 분주된다 모두 -80 ° C에 저장됩니다. 해동하면 상온에서 떠나 빛으로부터 보호합니다.- 칼 세인 및 DMSO의 유리 병을 가지고 15 분 동안 실온에서 둡니다.
- 개봉하면 칼 세인이, 분말로 제공되는 유리 병에 DMSO 5.1 μl를 추가합니다. 그렇지 않으면, 칼 세인의 2.5 μl를 포함하는 이미 재현 탁 칼 세인 유리 병을 사용합니다.
- 1.5 ML 튜브에 BM의 580 μL에 칼 세인의 2.5 μl를 추가하고 레이블을 붙입니다.
- 각 웰 반복 피펫을 사용하여이 염료 용액 (BM + 칼 세인)의 10 μl를 추가합니다.
- 염료가 잘 혼합 될 수 있도록 멀티 채널 회 재현 탁.
- 30 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 품어.
- 칼 세인 인큐베이션 동안, FSK 제조 시작VX-770 및 솔루션은 필요한 경우.
- VX-770의 강화제를 사용하는 경우 다음과 같은 농도 중으로 용량 - 반응 곡선을 제조 : 0.0003, 0.003, 0.03, 0.3, 3.0, 30 μM있다. 적정 주파수 변조의 경우, 농도는 0, 0.008, 0.02, 0.05, 0.12, 0.32, 0.8, 2.0 및 5.0 μM. BM의 희석을 준비합니다.
주 : FSK, VX-770, 또는 둘째 날에 추가 된 다른 약물의 경우, 희석 이미 100 μl를 함유 / 약물 적정 용액을 각 웰에 첨가한다 FSK 100 ㎕, 이후 2 × 최종 농도로 제조되어야 FCM의. - 현미경 실에 FSK 및 VX-770 솔루션을하는 P200 피펫 및 팁을 전송합니다.
- FIS 분석을 이미징하는, 자동화 된 단계, 가열 챔버 및 CO 2 유동 구비 한 생균 촬상 공 초점 현미경을 사용한다.
주 : 다음 단계는 특정 현미경을 참조하십시오. 다른 설정은 다음과 같은 다른 현미경에 제조업체의 적용해야명령. - 판 홀더에 96 웰 플레이트를 넣습니다.
- 영상의 공 초점 설정을 입력합니다.
- 37 ° C로 실시간 이미징 도구를 미리 설정하고, 5 % CO 2 챔버는 측정 전에 30 분 이상 동안 사전 부화하자.
- 알렉사 불소-488 트랙을 선택하기 위해 "스마트 설정"옵션을 사용합니다.
- 축소 및 전체 잘 캡처 0.6 배에 5 배 렌즈와 스캔 영역을 설정합니다.
- 배경 위에 칼 세인 녹색 표시 organoids의 최적의 검출을 가능하게하는 레이저 파워 검출기 감도를 적응. 핀홀 130 μm의 증가 될 수 있고, 상기 화상 평균화는 2로 설정 될 수있다.
- 8의 비트 깊이와 512 X 512 프레임 크기를 설정합니다.
- 측정 시간, 주파수 및주기를 설정하는 시계열 옵션을 사용한다.
참고 : 정기적 인 측정을위한 추천 : 10 분 간격으로 1 시간 : 사이클 = 7 (사이클 1은 T = 0). 감소 된 부종, ORGA의 측정noids는 3 시간까지에 대한 이미지화 할 수 있습니다. - 수동으로 개별 잘 위치를 결정하기 위해 타일 옵션을 사용합니다.
- 측정과 같은 순서에 따라, 해당 우물에 FSK 및 / 또는 VX-770 솔루션의 100 μl를 추가합니다. 잘 군데 처음에 솔루션을 추가 시작하고 영상 순서를 계속합니다.
- 측정을 시작합니다.
- 실험이 종료 된 후, 파일을 저장한다.
- FIS 분석 데이터의 분석
- 오버 총 organoid 면적의 증가를 계산하는 식별 구조를 알렉사 488 트랙을 묘화하는 모든 구조를 인식하고, 채우고 이미지 분석 소프트웨어 분석 도구를 사용 FIS 분석의 데이터 분석을위한 "organoid 분석"매크로 만들기 다른 시점.
- 이미지 분석 프로그램 취득한 이미지 데이터 파일을 연다.
- organoid 분석을위한 매크로를 선택합니다. <리>도 1 시점에 하나의 신호 대 잡음비를 균형 모든 organoid 구조를 인식하고 충전되도록 임계 값을 설정한다.
- 모든 구조도 시점 (7)로 인식하는 경우 약간 시점 (7)의 배경 신호가 (특정 임계 실험 사이에 다소 변경 될 수 있습니다) 구조로 인식되지 않도록 임계 값을 수정보고 4-6 우물에서 확인하십시오.
- 1000 μm의 2에 인식하고 개체의 최소 영역 크기의 기준을 설정합니다.
- 를 눌러 시작 "분석". 분석에 사용되는 소프트웨어에 따라, 약 3 분 소요됩니다.
- 웰 당 웰 번호 (표는이 순서로 증가한다) 타임 포인트, 총 면적 : 소프트웨어가 끝나면, "테이블 작성"다음 데이터를 선택 간다.
- 스프레드 시트 프로그램에 수출하는 .xlm으로 파일을 저장합니다.
- 이 프로그램에서 아 당 지역의 상대적 증가를 계산100 %의 시점 (1)의 영역을 설정하여 L. 시점 조건 당 1-7에서 곡선 (AUC) 아래의 면적을 계산하게하고; 영역 (Y 값)의 하한을 100 %로 설정된다. FSK 약물 적정 (X 축)는 AUC (Y 축)에 대해 도시된다.
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Representative Results
도 1a는 BMM에 포함 된 지하실의 대표 신선한 격리를 보여줍니다. 지하실은 CF 제목의 대장 조직 검사에서 있습니다. 일반적으로, organoid 각 토굴 (- C 그림 1A)에서 생성됩니다. 때문에 CFTR의 기능 장애로, 대장 CF의 organoids의 대부분은 낭포 성 이라기보다는 소형 계획과 buddings (그림 2A - 2B)에 있습니다. 그러나 일부 CF는 낭포 성 모양 (그림 2C), 야생형 organoid 문화 등 (그림 2D)와 몇 organoids이 특히 높은 잔존 기능, 문화를 organoid.
배양을 확장하거나 FIS 분석을위한 시드 organoids를 계대 먼저,도 3a에 도시 된 바와 같이 organoids는 여러 buddings으로 큰 크기를 갖는 것이 중요하다. organoids 작고 N 않고 있다면계대에 대해 처리 할 때 umerous buddings는 organoid 문화에 부정적인 영향을받습니다. EGF,이 Wnt-3A 및 Rspo3 같은 필수 성장 인자의 품질과 활성에 따라 organoids 7 및 십이일 (도 3a) 사이의 원하는 크기에 도달한다. 기계적 파괴 후 buddings는 중단하고 다음 통로 (도 3b)의 새로운 organoids를 생성하는데 사용된다. 동결 대한 organoids 처리하면,도 3c에 도시 된 바와 같이 그들 작은 크기로 트립신 처리하는 것이 중요하다. 트립신 처리 한 후, organoids 그들을 조작의 스트레스로부터 회복하도록하기 위해 1 또는 2 일 동안 도금한다. 이 단계는, 함께 organoids의 작은 크기 (도 4a)를 해동 후 98 % 세포 회복을 보장한다.
organoids 해동 될 때, 고밀도 그들을 것이 중요하므로 일반적으로, 이들은 (A)에 해동작은 볼륨 (Figure4A). 상기 organoids 적절한 밀도를 제공 BMM 10 μL 당 20-30 organoids의 비율로 희석 - 배양 하루 또는 이틀 후 및 organoids 크기를 (4C도 4b와도 4a)와 비교 증가된다는 관찰 후 더 큰 크기로 성장한다. organoids가 너무 희석하는 경우, 그들은 성장이 저하 될 수 있습니다, 심지어 차별화하고 죽을 수 있습니다. organoids 너무 혼잡 한 경우 공간의 부족 또는 성장 인자의 부족은 또한 organoids의 성장을 늦추고 buddings의 수를 감소시킨다.
제한된 세포 파편과 가능한 문화 organoids의 도금은 충분한 CFTR 기능 (그림 5A - 5B) 존재 함을 제공하는 organoids의> 95 % FSK 자극에 부풀어있는 상태에서 발생한다. 같은 유전형과 약물에 의존하는 방식으로 팽창 Organoids이 F508del 대립 유전자 (그림 5A)와 organoids 화합물-이형 F508del 및 S1251N (그림 5B)에 대한 일부 잔여 기능과 관련된 CFTR 게이팅 변이 organoids의 대표 이미지로 보여줍니다.
팽윤을 정량하기 위해, 총 칼 세인 녹색 표면 영역은 각 시점에 따라 선택되고 T = 0의 비율로 표현된다 (100 %로 설정하고,도 6A). 작은 파편과 비 팽창 구조는 일반적으로 아래의 전체 면적의 5 %이다. 상대 면적 증가는 10 분의 시간 간격 단위로 표현되고, AUC (임의 단위)의 측정은 각 상태 (T = 0 분, 60, 100 %로 설정 한 기준 임계;도 6B)에 대해 생성된다. 우리는 팽윤 개시 일부 변화뿐만 아니라 높은 CFTR 함수 레벨에서 FSK 30-40 분 넘어 곡선 관계로 통합 AUC가 가장 강력한 것으로 밝혀.
VX809도 6C). CFTR 잔여 함수와 관련된 CFTR Organoids는 변조기 (프리 FSK 조건 200-220% 표면적)의 부재하에 5 μM FSK 자극 60 분 후 4500 AUC 단위까지 도달 할 수있다. Organoid 팽윤은 아마도 인해 organoid 구조 기저 이온 수송의 속도 제한 효과의 물리적 한계 ~ 4500 AUC 유닛의 천장 및 "연신"조건에서 이온 - 유체 수송 항상성의 확립에 도달한다. FSK는 또한 더 높은 잔류 기능 또는 효과를 정량화하기 위해 이러한 높은 CFTR 잔여 함수 레벨에서 분석의 동적 범위를 확장 할 수있는 적정 치료 화합물 (예를 들면, 저급 FSK 농도 자극시 S1251N의 organoids의 종창 VX770의 높은 활성으로 표시된 바와 같이도 6D).
그림 1 : 생검에서 CF 대장 organoids의 설립. (A) 절연 일 (통로 0, 0 일)에 BMM에 삽입 된 후 직장 조직 검사에서 절연 재료의 대표적인 이미지. 지정된 지하실의 확대는 오른쪽 패널에 표시됩니다. (B) 같은 지하실은 문화 칠일 (통로 0, 7 일) 후 추적 관찰 하였다. 패널 (A)에 제시된 동일한 굴의 확대 도시되어있다. 십일일 분할 된 후에 (C) 같은 organoid 문화의 대표 이미지 (통로 1 일 11 참조). 스케일 바는 100 μm의 =.
159fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 다른 CFTR 돌연변이를 가진 환자에서 파생 된 CF 대장 organoids의 대표 이미지. F508del / F508del (A), F508del / R117H-7T (B), 및 F508del / S1251N (C) 돌연변이와 과목에서 CF 대장 organoids의 대표 이미지. (D)는 야생형 CFTR 대상에서 대장 organoid 문화의 대표 이미지입니다. 스케일 바는 100 μm의 =. 이러한 이미지는 더 FSK 자극으로 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5159 / 55159fig3.jpg "/>
그림 3 : 유지 보수 및 분석 또는 냉동 처리 CF 대장 organoids. (A) (B) 계대 또는 (C)를 동결 중 하나에 대한 처리하기가 CF 결장 organoid 문화의 대표 이미지를 준비합니다. (B) 기계적 중단 한 후, 작은 조각은 다음 구절에서 새로운 organoids를 생성하는 형성된다. (C) 트립신 처리 후 매우 작은 둥근 organoids은 동결 과정 그 가능성을 용이하게 생성된다. 스케일 바는 100 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 냉동 organoids에서 CF 대장 organoid 문화를 구축. (<강한> A - C) 일 0 (A에 해동 CF 대장 organoid 문화의 대표 이미지). 같은 잘의 이미지는 하나의 (B) 및 후 2 (C) 일을 촬영했다. (D - G) 섹션 5.9에 설명 된 희석 단계의 대표 이미지. organoids는 해동 (해동 후 3 일)에서 제대로 회복되면 그들이 (D)를 성장 공간이 있도록, 그들은 희석된다. 동일한 웰의 이미지는 여섯 (E) 10 (F) 및 해동 후 십오 (C) 일 촬영 하였다. 스케일 바는 100 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : CF의 포스 콜린에 의한 부종organoids. (A 및 B) F508del / F508del (A) 또는 F508del / S1251N (B) - 770 VX 전 또는 부재 또는 존재 FSK (5 μm의) 자극 60 분 후 대장 organoids 대표 화상 (이 3 μm]) 또는 VX-770 VX-809 (3 μm의)와 함께한다. 스케일 바는 200 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 정량화 붓기 포스 콜린 유발. (A) F508del / S1251N의 이미지 분석 소프트웨어에 의해 organoids 전 (0 분) FSK (5 μM)와 VX770 (3 μM)와 자극의 60 분 후 organoid 영역 선택의 대표 이미지. 스케일 바는 200 μm의 =. (B) RepresFSK 부재 또는 존재 VX770 (3 μm의) 및 / 또는 VX809 (3 μm의) (5 μm의) 자극의 60 분 동안 F508del F508del / 또는 F508del / S1251N의 organoids의 상대적인 면적 증가 entative 이미지. (B) (T = 60 분, 기준 임계 값 = 100 %)에 나타낸 조건 하에서 측정 곡선 (C) 영역. FSK의 다른 농도에서 F508del / F508del 또는 F508del / S1251N의 organoids의 곡선 측정에서 (D) 지역. 데이터는 하나의 대표적인 실험에서 SD ± 평균값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 인간의 대장 organoids의 생성, 확장, 냉동과 해동을위한 완벽한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 인간의 organoid 문화를 몇 시간 전에 17를 설립하지만, 때로는 교육 실습없이 다른 연구소에서 기술을 확립하기 어려운 입증했다. 우리는 이러한 프로토콜은 교육을 대체 할 것으로 예상.
이 Wnt-3A 에어컨 매체 수립하고 organoid 문화 장기적인 유지에 성공하기 위해 가장 중요한 시약 중 하나입니다. 실제로, organoid 문화가 낮은 활동의 Wnt-3A-conditoned 매체에 "충돌"노출 수있는 경우. 이 Wnt-3A 에어컨 매체 내부에서 이루어지기 때문에, 활성 매체를 생성 할 때 고려되어야 여러 측면이있다. 활성의 Wnt-3A는 L 세포 및 소수성의 안정화를 위해 적절한 성장 신호를 제공하는 고품질의 소 태아 혈청 (FBS)을 매체 중에서 제조 할 수있다이 Wnt-3A 분자. 이 Wnt-3A 활동이 낮은 (즉, 낮은 TOP / FOP 비율, 아래 참조) 인 경우, 일반적으로 문제의 원인이되는 FBS이다.
상업 재조합의 Wnt는 제대로 작동합니다, 그래서 우리는 그것에게 TOP / FOP의 Wnt 기자 분석에 대한 긍정적 컨트롤을 사용하지 않는 것이 좋습니다. TOP / 레 닐라 및 FOP / 레 닐라의 비율은 에어컨 매체의 Wnt 활동의 표시,의 Wnt-3A 에어컨 매체의 너무 좋은 배치입니다에서 TOP / FOP 값과 비교, 25보다 TOP / FOP 비율 이상 제공 음성 대조군 : 중간의 Wnt-3A 생산 세포에 노출되지 않는다. 재조합 소량 및 R-spondin은 소량으로 대체하고 R-spondin은 에어컨 매체 (28), (29)을 할 수 있습니다.
현재의 프로토콜은 CFTR - 더 FIS 분석을위한 기능 테스트에 대해 설명합니다. 우리는 최근 CFTR 유전자형과 FIS 방법이 게시 된 CFTR의 genoty을 반영 사이의 관계를 증명하고있다임상 레지스트리 (www.CFTR2.org) 25에서 얻은 PE-표현형의 관계. 이 분석을 사용하여, 매우 드문 CFTR 돌연변이를 가진 두 사람은 그 organoids (VX-770) 25 ivacaftor에 응답했다 확인되었다. 이 약물의 처방 이후 임상 자료가없는 드문 돌연변이 환자 별 약품 일치하도록 FIS 분석 값을 강조 분명한 임상 반응 결과. FIS의 정량을위한 필수가 아닌 붓기 organoids의 제한된 부분 (일반적으로 아래 5 %) 만 표시 최적의 성장과 분석 조건이다. 비 가능한 비 팽윤성 구조의 더 큰 비율을 화상 해석 소프트웨어에 의해 인식 된 바와 팽윤 과소에 파편 리드 높은 수준.
체외 FIS 반응과 이전에 설립 된 CFTR에 의존하는 바이오 마커 (땀 염소 농도와 intest 사이의 상관 관계개인화 된 수준에서 원고 판 전류 측정은) 우리의 이전 연구 19, 25 쉽게 입증했다. 이 CF와 주제에 FIS를 사용하여 잔류 기능 측정은 개인화 된 방식으로 진단이나 예후 마커로 현재의 접근 방식을 보완 할 수 있다는 개념을 지원했다. 땀 클로라이드 농도 생체 내 및 생체 외 측정 직장 생검 장내 전류 측정 등 CFTR 함수의 다른 바이오 마커에 비해 FIS 분석의 처리량은 기술 변화를보다 효율적으로 제어 할 수 있습니다. 또한 완전 CFTR 의존성 판독 및 FSK의 적정 종류 정확하게 잔여 CFTR 기능을 이용하여 큰 동적 범위를 제공한다.
CF 질환의 조절 만 CFTR 기능 이상에 의해 영향을받는 반면 그러나 FIS 분석은, 약효의 변화에 개별적 유전자형의 영향을 반영한다. 드루에 대한g 응답의 분석은 잠재적 인 조직 반응을 반영한다. 생체 (7, 8) 또는 직접 생체 CFTR 측정 (32)에 대향으로 CFTR 측정에서 매우 정확한 있지만 인간 약동학 변동은 도입되지 않는다. 전술 한 바와 같이, (유전과 환경 모두) 비 CF 수정은 체외 관찰 또는 CFTR의 바이오 마커 및 임상 표현형 (2) 사이의 단절을 초래, 표현형에 영향을 미치는된다. 또한, 세포주 (33)를 사용하여 잠재적 인 반응 돌연변이의 식별은 organoids의 설립을위한 직장 생검을 얻을 필요가 환자에 미치는 영향과 관련이있다.
여러 CFTR 타겟팅 약물 개발 한 현재입니다. 임상 시험은 임상 효능 (b)의 정확한 예측을 허용하지 않습니다 것으로 예상된다혼자 CFTR 돌연변이 상태에 ased. FIS 분석이 기능적으로 CFTR 기능 및 약물 반응을 측정, 그것은 어떤 환자에게 가장 적합한 약물 결정하는 선택의 방법이 될 수 있습니다. 환자군의 ID가 등록 시험 및 신약 양상의 개발에 포함될 FIS위한 분석은 또한 유용 할 수있다. 전과 치료 중 플라즈마 대장 organoids의 자극은 더 잠재적으로, 혈액에서 CFTR 변조기를 순환 개인 투여 임상 시험 30에서 약물 투여 량의 선택, (31)을 용이의 기능 양을 정량하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, FIS는 CFTR 기능과 그 기능의 다른 - 그래서 지금까지 크게 unknown- 유전 수정과의 상호 작용의 더 나은 기본적인 이해에 유용 할 수있다.
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Acknowledgments
이 작품은 네덜란드의 CF 재단 (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103)는 빌헬미나 아동 병원 연구 기금과 CZ, 및 Zilverenkruis / Achmea의 HIT-CF 프로그램에 의해 지원되었다. 우리는 S. HEIDA 미셸, M. Geerdink, KM 드 겨울 드 그루, 그리고 G. Berkers (소아 호흡기학, 빌헬미나 어린이 병원, UMC 위트레흐트학과), 및 RHJ Houwen (소아 소화기, 빌헬미나의 부서에 감사드립니다 환자 접근과 CF 바이오 뱅크의 발전을 위해 조직 검사를 얻기를위한 어린이 병원, UMC 위트레흐트).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500 ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2 mM | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100x | 1x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H2O | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1% BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H2O | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
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