Summary
Protokollen nedenfor beskriver metoden til: microplastics prøvetagning på havoverfladen, adskillelse af microplastic og kemisk identifikation af partikler. Denne protokol er i tråd med anbefalingerne for microplastics overvågning udgivet af havstrategirammedirektivet Tekniske Undergruppe på Marine kuld.
Protocol
1. Prøveudtagning af microplastics på havoverfladen
- Implementer manta nettet fra den side af fartøjet, der anvender en spiler bom eller »A-ramme« ved hjælp af linjer og karabiner.
- Implementer manta net ud af kølvandet zone (ca. 3 -. 4 m afstand fra båd) for at forhindre, at hente vand påvirkes af turbulens inde i kølvandet zone.
- Skriv ned de første GPS-koordinater og indledende tid i databladet.
- Begynd at bevæge sig i en lige retning med en hastighed på ca.. 2 - 3 knob i 30 minutter og begynde tidsmåling.
- Efter 30 min stoppe båden og nedskrive endelige GPS koordinater, idet længden af ruten (den mest korrekte måde er at beregne længden fra GPS-koordinater) og den gennemsnitlige båd hastighed i databladet forudsat og løft manta net ud af vandet.
- Skyl manta netto grundigt fra ydersiden af nettet med havvand ved hjælp af en dykpumpe eller vand fra båden water reservoir. Skyl i retningen fra manta munden til fangstposen for at koncentrere alle partikler klæbet til nettet i fangstposen.
Bemærk: Skyl aldrig prøven gennem åbningen af nettet for at undgå forurening. - Sikker fjernelse slutningen torsk og prøven sigtes i torsken ende gennem en 300 um maskestørrelse sigte eller mindre.
- Skyl fangstposens grundigt udefra og hæld resten af prøven gennem sigten. Gentag dette trin, indtil der ikke længere nogen partikler inde i fangstposen.
- Koncentrer alt materiale på sigten i en del af sigten.
- Med brug af en tragt, skylles sigten i en glaskrukke eller plastflaske anvendelse af 70% ethanol.
- Luk flasken, tørre det med køkkenrulle og mærke låget og uden for krukken med navnet prøven og dato med vandtæt markør (bør du også sætte en anden etiket skrevet med en blyant på velum papir i en krukke for at undgå det mulige tab afprøven navn på grund af den slettede etiket på glasset). Overfør mærket plastflaske ind i køleboks.
Note til generelle betingelser prøveudtagning: Vindhastigheden bør ikke være mere end 2 Beaufort, da bølgerne er for høje, og nettet er ikke stabilt på havoverfladen. Det er vigtigt at opretholde en stabil lineær kurs med en konstant hastighed i løbet af trawl. Halvdelen af manta netto åbning skal nedsænket under prøvetagningen. Prøvens varighed skal være 30 min (i tilfælde, hvor der er en stor mængde af naturlige materiale, f.eks plankton flor, kan varigheden af prøveudtagningen være kortere). Undgå brug af plast værktøjer og containere. Undgå syntetisk tøj (f.eks fleece), reb og kontakt manta net med skib for at forhindre forurening af prøven. Vær meget forsigtig med ikke at beskadige manta nettet eller båden skrog, mens implementering og erobre nettet.
2. Adskillelse af microplastics fra havet overfladeprøver
- Hvis prøven ikke indeholdernogen produkter større end 25 mm, og ser ud til at være rene, fortsætte direkte med trin 3.
- Hæld prøve gennem sigten (≤300 um maskestørrelse) og fjern alle naturlige eller kunstige kuld objekter af en størrelse> 5 mm (makro og mezzo kuld) fra prøven, ved hjælp af visuel identifikation og pincet. Vær omhyggelig med at skylle hver fjernet objekt omhyggeligt med destilleret vand for at fjerne enhver microplastic kuld levet op til det. Opbevar alle naturlige og kunstige kuld objekter i separate beholdere. Tør alle naturlige og kunstige kuld objekter i en ekssikkator (eller i det fri, men i en lukket skål) og vejes. Identificer alle kuld objekter> 25 mm (makro kuld) i henhold til Master Liste over kategorier af strøelse Items 16.
- Efter at have fjernet alle større genstande, koncentrere alle resterende brikker i en del af sien hjælp squirt flasker eller postevand. Prøven hældes en glasbeholder ved anvendelse af en minimal mængde 70% ethanol ved hjælp af en funnel.
Bemærk: I dette trin er afgørende at anvende 70% ethanol for at bevare prøven. Også i trinnet til visuel inspektion af prøven, ethanol bidrager til at misfarve organismerne og farverige plast derfor blevet lettere at finde. - Tag en lille mængde af prøven (delprøve) og hæld det i et glas petriskål. Analysere prøverne ved anvendelse af et stereomikroskop (20 - 80x zoom) og søger efter microplastic partikler.
- Hver microplastic partikel skal kategoriseres i en af de kategorier, der er anført i tabel 1 og sat i en petriskål eller andre hætteglas, markeret med et kategori navn. Petriskålen skal være lukket på alle tidspunkter.
Bemærk: Når der adskiller microplastics fra din prøve være konservativ og vælge mere snarere end mindre partikler til analyse. Den virkelige kemiske struktur af partikler vil stadig blive bestemt senere. Vær sikker på at analysere større objekter fra alle sider, som microplastics kan være fast, og derfor skjult under større genstande.Det kan også være nyttigt at flytte allerede analyserede genstande til den ene side af petriskålen. - Sætte petriskålen under mikroskopet med måleudstyr (okulær lineal kalibreret af mikrometer slide eller billedanalyse software) og måle størrelsen af hver partikel (måle længste diagonal), undtagen filamenter, og bemærk dets farve. Hver delprøve bør gennemgås af en anden person. Vær omhyggelig med at skylle glasbeholderen med prøven, således at alle partikler klæber til glasvæggene vaskes i petriskålen.
- Afveje microplastic partikler af hver kategori for sig ved brug af analytiske skala. Microplastic partikler skal tørres før vejning. Den lukkede petriskål kan sættes i en ekssikkator eller prøverne kan overlades til tørre i et lukket fad indtil partikler blev tør (vægten af lukket petriskål med partikler er konstant).
- Identificere mikro kuld. Ved analyse af en prøve i jagten på microplastics, kan du overveje atnogle partikler vil være let synlige (farve, form, størrelse), mens andre kan være vanskeligere at finde. Nedenfor er et par funktioner, der identificerer microplastic partikler i prøven: For eksempel, ingen celle struktur, ujævne, skarpe, skæve kanter, ensartet tykkelse, karakteristiske farver (blå, grøn, gul, etc.).
3. Kemisk identifikation af microplastics
- ATR-FTIR spektroskopi
- Forud for analysen rense detekteringssystemet med alkohol og en fnugfri klud.
- Optag en baggrund spektrum. Anbring prøven på prøveholderen og indsamle spektre. Identificere den opnåede ATR- FTIR spektre anvendelse af en automatiseret sammenligning af det opnåede spektrum med spektre i en database.
- Micro ATR-FTIR spektroskopi
- Forud for analysen rense detekteringssystemet med alkohol og en fnugfri klud.
- Anbring prøven på et glas filter. Bemærk: Andre filtre kan være osed men deres polymer natur kan interferere med karakterisering.
- Placer filteret med prøven på den automatiske scanning bordet og bruge joysticket til at finde prøven.
- Optag et optisk billede og markere et område (fx 20 af 20 pm), hvor prøven vil være karakteriseret.
- Optag en baggrund spektrum.
- Anbring prøven på prøveholderen og indsamle spektre på forudbestemt sted.
- Identificere den opnåede mikro ATR-FTIR-spektre under anvendelse af elektronisk sammenligning af det opnåede spektrum med spektre i en database.
Representative Results
Det første resultat af den beskrevne protokol er microplastic partikler kategoriseret i seks kategorier efter deres visuelle egenskaber (tabel 1). Den første kategori, og som regel den mest udbredte én, er fragmenter (Figur 1). De er stive, tykke, med skarpe krogede kanter og en uregelmæssig form. De kan være i en række forskellige farver. Den anden kategori er film (figur 2). De vises også i uregelmæssige former, men i sammenligning med fragmenter, de er tynde og fleksible og normalt gennemsigtig. Den tredje kategori er pellets (figur 3), sædvanligvis stammer fra plastindustrien. De er uregelmæssige, runde former, og normalt større i størrelse, omkring 5 mm i diameter. De er som regel fladt på den ene side og kan være af forskellige farver. Den fjerde kategori er granulater (figur 4). Sammenlignet med pellets, de har en regelmæssig rund form og sædvanligvis en mindre størrelse, omkring 1 mm i diameter. De vises i naturlige farver(Hvid, beige, brun). Den femte kategori er filamenter (figur 5). De er, ved siden af fragmenter, den mest rigelige type microplastic partikler. De kan være kort eller lang, med forskellige tykkelser og farver. Den sidste kategori er skum (figur 6). De oftest kommer fra store partikler af styrofoam. De er en blød, uregelmæssig form og hvid til gul.
Det vigtigste resultat af microplastics prøvetagning og analysen er antallet af microplastic partikler pr prøve. Disse data kan være yderligere normaliseres pr km 2. Formlen bruges til normalisering er:
microplastic partikler pr prøve / sampling-området,
hvor udtagningen område beregnes ved at gange prøveudtagning afstand af bredden af åbningen af manta net (tabel 2, 3; figur 7). Desuden kan partikler analyseres med imalder analyse software. Resultaterne omfatter maksimale længde og areal af hver partikel (tabel 4). Figur 8a viser partikler før billedanalyse og 8b er efter billedanalyse, hvor hver partikel måles og nummereret. Endelig anbefales en kemisk analyse af den samlede eller højest mulige antal partikler pr prøve. Brug af Fourier-transformation infrarød spektroskopi et spektrum af den valgte partikel er erhvervet, som vist på figur 9. Dette spektrum sammenlignes derefter med spektrene fra software bibliotek (figur 10). Det endelige resultat vil vise, om en given partikel er plastik eller ikke, og angiver den type plast fra den kemiske struktur.
| 1 | fragmenter |
| 2 | Film |
| 3 | pellets |
| 4 | Granulat |
| 5 | filamenter |
| 6 | Skum s |
Tabel 1: Kategorier af microplastic partikler.
Figur 1: Eksempel på partikler fra kategori: Fragmenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel på partikler fra kategorien: Film. Klik her for at se en større version af dette tal.
/55161fig3.jpg "/>
Figur 3: Eksempel på partikler fra kategorien: Piller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempel på partikler fra kategori: Granulat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Eksempel på partikler fra kategori: filamenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Eksempel på partikler fra kategorien: Skum. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Sampling afstand [km] | 2 |
| Manta bredde [km] | 0,0006 |
| Sampling område [km 2] | 0,0012 |
Tabel 2: Eksempel på data fra undersøgelsen, der anvendes til beregning af microplastic partikler pr km 2.
| Ingen | Nej / km 2 | |
| fragmenter | 301 | 250.833 |
| film | 45 | 37500 |
| pellets | 15 | 12500 |
| granulater | 8 | 6667 |
| skum | 33 | 27500 |
| filamenter | 223 | 185.833 |
Tabel 3: Eksempel på resultater fra undersøgelsen, hvor de kategoriserede data i 6 grupper tælles og normaliseret pr km 2 (Nej - antal partikler).
Figur 7: Eksempel på repræsentative resultater efter visuel kategorisering af pgenstande (Nej - antal partikler). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Indeks Region | Samarbejdsområde [mm²] | Maksimal længde [mm] |
| 1 | 8,010 | 5,506 |
| 2 | 10,517 | 5,628 |
| 3 | 12,185 | 5,429 |
| 4 | 3,367 | 3,367 |
| 5 | 2,475 | 2,155 |
| 6 | 1,809 | 2,943 |
| 7 | 6,604 | 5,238 |
| 8 | 5,779 | 4,037 |
| 9 | 4,472 | 3,791 |
| 10 | 16,907 | 5,355 |
| 11 | 7,246 | 3,733 |
| 12 | 7,867 | 4,622 |
| 13 | 6,411 | 5,056 |
| 14 | 3,281 | 3,070 |
| 15 | 12,937 | 5,554 |
| 16 | 6,709 | 3,716 |
Tabel 4: Eksempel på billedanalyse resultater, hvor området [mm2] og maksimal længde [mm] af hver partikel måles.
Figur 8: Eksempel på billedet erhvervet a) før og b) efter billedanalyse af partikler med billedanalyse-software.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Eksempel på et spektre målt på en udvalgt partikel med markante toppe og deres bølgelængder [cm -1]. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Eksempel på sammenligning af erhvervet spektre fra udvalgte partikel til bedste match fra ATR-FTIR spektrene bibliotek. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Microplastics prøvetagning på havoverfladen ved manta nettet er et meget anvendt til prøveudtagning af microplastics på havoverfladen, men til dato har der ikke været nogen samlet metodologi. En stor mængde vand kan filtreres gennem manta net, således muligheden for klemning et relevant antal microplastics er høj, og resultaterne opfattes at være pålidelige. Sammenlignelighed af resultater blandt forskellige prøver sikres ved normalisering. I vores tilfælde blev koncentrationer relateret til den samplede område ved at gange trawl afstand af den horisontale bredde af nettet åbning. En anden mulighed er at bruge en flowmåler, fastsat til nettet åbning. Anvendelsen af et flowmeter er muligt, fordi den manta nettet med sine laterale vinger er meget stabil på havoverfladen og derfor hopping på bølgerne er minimal. En flowmåler registrerer mængden af filtreret vand og dermed muliggør en normalisering af resultater pr volumen samplet vand 16.
17, 18, men i så fald er du nødt til at være sikker på, at nettet er ud af kølvandet zone. Afstanden, som trawlet er indstillet til prøveudtagning, skal bestemmes individuelt, eftersom den zone af turbulens forårsaget af fartøjet varierer fra størrelsen af fartøjet og ved den hastighed af båden 19, 20.
Adskillelse af microplastic partikler fra havoverfladen prøverne er oftest gjort netop ved visuel identifikation 21. Partikler større end 1 mm kan identificeres let med det blotte øje, mens partikler mindre end 1 mm kræver brug af et stereomikroskop. For at reducere muligheden for forvirrende ikke-plast partikler med plastic dem, ved hjælp af polarisering lys på stereomikroskoper anbefales. Muligheden for fejlagtig identifikation af plast partikler bliver højere med mindre partikler. Således partikler> 0,5 mm kan kun identificeres visuelt 21, ved anvendelse af stereomikroskop. For partikler mindre end 0,5 mmen ekstra, mere præcis metode er nødvendig f.eks micro ATR-FTIR spektroskopi 21.
Under processen med microplastics adskillelse fra prøven muligheden for kontaminering prøve med de luftbårne filamenter er meget høj. Af denne grund, styre petriskåle efterladt åben på arbejdsbordet er stærkt anbefales til identifikation af potentielle forurenende luftbårne partikler. Nemlig, at kvaliteten af de data, afhænger meget af: 1) præcisionen af den person, der arbejder med prøven, 2) kvalitet og forstørrelse af stereomikroskop, og 3) mængden af organisk stof i prøven 16. Efter visuel identifikation anbefales det kraftigt at analysere de sorterede partikler med en af de tilgængelige teknikker til kemisk identifikation af materialet 8.
Der findes flere metoder til polymer identifikation, blandt hvilke FTIR spektroskopi og Raman spektroskopi er de fleste freTly brugt 22. FTIR og Raman-spektroskopi er komplementære teknikker og deres nøjagtighed er ens. I vores protokol, er FTIR og mikro FTIR spektroskopi med "svækket total reflektans" (ATR) præsenteres. De er enkel at bruge og de gør det muligt hurtige og præcise resultater. Plastpolymerer besidder særdeles specifik infrarød (IR) spektre med distinkte båndmønstre, hvilket gør IR-spektroskopi en optimal teknik til identificering af microplastics 21. Energien af IR-stråling ophidser en specifik molekylær vibration, når interagere med en prøve, som gør det muligt at måle karakteristiske IR spektre 22. FTIR spektroskopi kan også give yderligere oplysninger om partikler, såsom intensiteten af oxidation 23 og niveau af nedbrydning 24. Mens ATR-FTIR er velegnet til kemisk identifikation af større partikler (> 0,5 mm), kan mikro ATR-FTIR spektroskopi giver oplysninger om den kemiske struktur af partikler & #60; 0,5 mm, da det kombinerer funktionen af et mikroskop og et infrarødt spektrometer.
Før du bruger FTIR og mikro FTIR spektroskopi, microplastic partikler skal forinden tørret, da vand kraftigt absorberer IR-stråling 22, og renset, hvis de er dækket med biofilm og / eller andre organiske og uorganiske tilhængere, som kan påvirke IR-spektre. Den mest ikke-invasiv måde at oprense prøverne er ved omrøring og skylning med ferskvand 25. Hvis dette ikke er nok, så anbefales brug af 30% hydrogenperoxid. Alle andre metoder kan have negative virkninger på de microplastic partikler (f.eks ultralyds rengøring kan yderligere bryde partikler, kan stærkt sure eller alkaliske opløsninger skade flere plastikpolymerer mv) og dermed deres anvendelse ikke anbefales. Mere lovende er anvendelsen af en sekventiel enzymatisk fordøjelse som en plast venlig oprensningstrin. Oprensning ved hjælp af forskellige tekniske enzymer (f.eks lipase, enmylase, proteinase, chitinase, cellulase, proteinase-K) er blevet anvendt med succes til at reducere en biologisk matrix af plankton og dermed vist sig at være en værdifuld teknik til at minimere matrix artefakter under FTIR spektroskopi målinger 22.
Adskillelse af microplastics ved visuel identifikation og kemisk identifikation af udvalgte partikler er begge ekstremt tidskrævende processer. Dette arbejde skal udføres af en nøjagtig og tålmodig person, der har erfaring med stereomikroskoper, ikke blot i at anerkende plast partikler, men også i erkendelse biologisk materiale. Selv en erfaren person kan ikke diskriminere alle potentielle microplastic partikler utvetydigt af chitin eller diatoméarter fragmenter 22. Derfor fejlraten af visuel sortering i området fra 20% 26 til 70% 21 og stiger med faldende partikelstørrelse.
Acknowledgments
Udviklingen af denne protokol blev grundlagt af IPA Adriatic grænseoverskridende samarbejdsprogram 2007-2013, inden for DeFishGear projektet (1 ° str / 00010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
References
- Law, K. L., et al. Plastic accumulation in the North Atlantic subtropical gyre. Science. 329 (5996), 1185-1188 (2010).
- Thompson, R. C. Microplastics in the marine environment: Sources, consequences and solutions. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 185-200 (2015).
- Lusher, A. Microplastics in the marine environment: distribution, interactions and effects. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 245-307 (2015).
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects, and Fate of Microplastic Marine Debris, September 9-11. , NOAA. NOAA Technical Memorandum NOS-OR&R30 (2008).
- Andrady, A. L. Microplastics in the marine environment. Marine pollution bulletin. 62 (8), 1596-1605 (2011).
- Browne, M. A. Sources and pathways of microplastics to habitats. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 229-244 (2015).
- Marine litter: an analytical overview. UNEP's REGIONAL SEAS PROGRAMME. , UNEP. (2005).
- van der Wal, M., et al. SFRA0025: Identification and Assessment of Riverine Input of (Marine) Litter, Final Report for the European Commission DG Environment under Framework Contract No ENV.D.2/FRA/2012/0025. , European Commission DG Environment. (2015).
- Setälä, O., Fleming-Lehtinen, V., Lehtiniemi, M. Ingestion and transfer of microplastics in the planktonic food web. Environmental pollution. 185, 77-83 (2014).
- Farrell, P., Nelson, K. Trophic level transfer of microplastic: Mytilus edulis. (L.) to Carcinus maenas (L). Environmental Pollution. 177, 1-3 (2013).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: a review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Bakir, A., Rowland, S. J., Thompson, R. C. Transport of persistent organic pollutants by microplastics in estuarine conditions. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 140, 14-21 (2014).
- Cole, M., Lindeque, P., Halsband, C., Galloway, T. S. Microplastics as contaminants in the marine environment: a review. Marine pollution bulletin. 62 (12), 2588-2597 (2011).
- Zarfl, C., et al. Microplastics in oceans. Marine Pollution Bulletin. 62, 1589-1591 (2011).
- Hanke, G., et al. MSFD GES technical subgroup on marine litter. Guidance on monitoring of marine litter in European Seas. , Joint Research Centre-Institute for Environmente and Sustainability. Publications Office of the European Union. Luxembourg. (2013).
- Löder, M. G. J., Gerdts, G. Methodology used for the detection and indentification of microplastics - A critical appraisal. Marine anthropogenic litter. , Springer International Publishing. 201-227 (2015).
- Kang, J. H., Kwon, O. Y., Lee, K. W., Song, Y. K., Shim, W. J. Marine neustonic microplastics around the southeastern coast of Korea. Marine pollution bulletin. 96 (1), 304-312 (2015).
- Lusher, A. L., Tirelli, V., O'Connor, I., Officer, R. Microplastics in Arctic polar waters: the first reported values of particles in surface and sub-surface samples. Scientific reports. 5, (2015).
- Shu, J. -J. Transient Marangoni waves due to impulsive motion of a submerged body. International Applied Mechanics. 40 (6), 709-714 (2004).
- Rabaud, M., Moisy, F. Ship wakes: Kelvin or Mach angle. Physical Review Letters. 110 (21), 214503 (2013).
- Hidalgo-Ruz, V., Gutow, L., Thompson, R. C., Thiel, M. Microplastics in the marine environment: a review of the methods used for identification and quantification. Environmental science & technology. 46 (6), 3060-3075 (2012).
- Löder, M. G. J., Kuczera, M., Mintenig, S., Lorenz, C., Gerdts, G. Focal plane array detector-based micro-Fourier-transform infrared imaging for the analysis of microplastics in environmental samples. Environmental Chemistry. 12 (5), 563-581 (2009).
- Ioakeimidis, C., et al. The degradation potential of PET bottles in the marine environment: An ATR-FTIR based approach. Scientific reports. 6, 23501 (2016).
- McDermid, K. J., McMullen, T. L. Quantitative analysis of small-plastic debris on beaches in the Hawaiian archipelago. Marine pollution bulletin. 48 (7), 790-794 (2004).
- Eriksen, M., et al. Microplastic pollution in the surface waters of the Laurentian Great Lakes. Marine pollution bulletin. 77 (1-2), 177-182 (2013).
