Summary
Le protocole suivant décrit la méthode de: échantillonnage microplastiques sur la surface de la mer, la séparation de l'identification microplastique et chimique des particules. Ce protocole est en ligne avec les recommandations pour microplastiques surveillance publiés par le groupe technique MSFD sur les déchets marins.
Protocol
1. L'échantillonnage de microplastiques sur la surface de la mer
- Déployer le net manta du côté de la cuve au moyen d'un tangon de spinnaker ou »Un cadre« en utilisant des lignes et des mousquetons.
- Déployer le net manta hors de la zone de sillage (env. 3 - 4 m de distance du bateau) afin d'empêcher la collecte d'eau affectés par les turbulences dans la zone de sillage.
- Notez les coordonnées GPS initiales et le temps initial de la feuille de données.
- Commencer à se déplacer dans une direction rectiligne avec une vitesse d'env. 2 - 3 noeuds pendant 30 min et à commencer la mesure du temps.
- Après 30 min arrêter le bateau et notez les coordonnées finales GPS, la longueur de la route (la façon la plus correcte consiste à calculer la longueur de coordonnées GPS) et la vitesse du bateau en moyenne dans la feuille de données fournies et soulever le filet manta sur l'eau.
- Rincer le filet manta bien de l'extérieur du filet d'eau de mer en utilisant une pompe submersible ou l'eau des wa bateauRéservoir ter. Rincer dans la direction de la bouche manta à la fin de la morue afin de concentrer toutes les particules ont adhéré au filet dans la fin de la morue.
Note: Ne jamais rincer l'échantillon à travers l'ouverture du filet afin d'éviter la contamination. - retirer en toute sécurité la fin de la morue et tamiser l'échantillon dans la morue fin par un 300 um taille de tamis à mailles ou moins.
- Rincer la fin de la morue à fond de l'extérieur et versez le reste de l'échantillon à travers le tamis. Répétez cette étape jusqu'à ce qu'il n'y a plus de particules à l'intérieur de l'extrémité de la morue.
- Concentrer tous les matériaux sur le tamis dans une partie du tamis.
- Avec l'utilisation d'un entonnoir, rincer le tamis dans un bocal en verre ou une bouteille en plastique en utilisant 70% d'éthanol.
- Fermez la bouteille, l'essuyer avec des serviettes en papier et étiqueter le couvercle et à l'extérieur du pot avec le nom de l'échantillon et la date avec le marqueur imperméable à l'eau (vous devez également mettre une seconde étiquette écrite avec un crayon sur papier vélin dans un bocal pour éviter la perte possible dele nom en raison de l'étiquette effacée sur le pot de l'échantillon). Transfert bouteille en plastique marqué dans la boîte froide.
Note aux conditions générales d'échantillonnage: La vitesse du vent ne doit pas être plus de 2 Beaufort, puisque les vagues sont trop élevés et le filet est pas stable sur la surface de la mer. Il est important de maintenir une trajectoire linéaire constante à une vitesse constante pendant les chaluts. La moitié de l'ouverture nette manta doit être immergé pendant l'échantillonnage. Durée de l'échantillonnage devrait être de 30 min (dans les cas où il y a une grande quantité de matériau naturel, par exemple de plancton, la durée de l'échantillonnage peut être plus courte). Évitez d'utiliser des outils et des contenants en plastique. Évitez les vêtements synthétiques (par exemple de laine), des cordes et le contact du filet avec manta navire pour prévenir la contamination de l'échantillon. Soyez très prudent de ne pas endommager le filet manta ou la coque du bateau tout en déployant et en capturant le net.
2. Séparation des microplastiques à partir des échantillons de surface de la mer
- Si l'échantillon ne contient pas deles articles de plus de 25 mm et semble être propre, continuer directement à l'étape 3.
- Verser l'échantillon à travers la (taille ≤300 um mesh) et enlever tous les objets naturels ou artificiels litière d'une taille> 5 mm (macro et mezzo litière) de l'échantillon, en utilisant l'identification visuelle et des pinces. Veillez à rincer chaque objet enlevé soigneusement avec de l'eau distillée afin d'éliminer toute litière microplastique adhéré. Rangez tous les objets naturels et artificiels litière dans des récipients séparés. Séchez tous les objets naturels et artificiels litière dans un dessiccateur (ou à l'air libre, mais dans un plat fermé) et les peser. Identifier tous les objets de la litière> 25 mm (macro litière) en fonction de la liste principale des catégories de litière Articles 16.
- Après avoir enlevé tous les objets plus grands, concentrer tous les morceaux restants dans une partie du tamis à l'aide de bouteilles de gicler ou de l'eau du robinet. Verser l'échantillon dans un récipient en verre en utilisant une quantité minimale d'éthanol à 70% à l'aide d'un funnel.
Nota: Dans cette étape, l'utilisation de l'éthanol à 70% est essentiel pour conserver l'échantillon. Aussi à l'étape de l'inspection visuelle de l'échantillon, l'éthanol contribue à décolorer les organismes et les plastiques colorés devient donc plus facile à trouver. - Prenez une petite quantité de l'échantillon (sous-échantillon) et versez-le dans une boîte de Pétri en verre. Analyser l'échantillon avec l'utilisation d'un stéréomicroscope (20 - 80x zoom) et la recherche de particules microplastiques.
- Chaque particule microplastique devrait être classé dans l'une des catégories énumérées dans le tableau 1 et mis dans une boîte de Pétri ou d'autres flacons en verre, portant un nom de catégorie. La boîte de Pétri doit être fermé à tout moment.
Remarque: Lors de la séparation microplastiques de votre échantillon soit conservateur et sélectionnez plutôt plus que moins de particules pour l'analyse. La structure chimique réelle des particules sera toujours déterminée plus tard. Assurez-vous d'analyser des objets plus grands de tous les côtés comme microplastiques peuvent être bloqués et donc cachés sous les gros articles.Il peut également être utile pour déplacer des objets déjà analysés sur un côté de la boîte de Pétri. - Mettez la boîte de Pétri sous le microscope avec un équipement de mesure (règle oculaire calibré par le logiciel de micromètre ou d'analyse d'image) et mesurer la taille de chaque particule (mesure la plus longue diagonale), à l'exception des filaments, et notez sa couleur. Chaque sous-échantillon devrait être examiné par une autre personne. Faire attention à rincer le récipient en verre contenant l'échantillon de telle sorte que toutes les particules qui adhèrent aux parois en verre sont lavées dans la boîte de Petri.
- Peser les particules microplastiques de chaque catégorie séparément par l'utilisation de l'échelle analytique. particules microplastiques doivent être séchées avant la pesée. La boîte de Pétri fermée peut être mis dans un dessiccateur ou les échantillons peuvent être laissés à sécher dans un plat fermé jusqu'à particules sont devenues sèches (le poids de boîte de Pétri fermée avec des particules est constante).
- Identifier les micro litière. Lors de l'analyse d'un échantillon à la recherche de microplastiques, s'il vous plaît considérer quecertaines particules seront facilement visibles (couleur, forme, taille), tandis que d'autres peuvent être plus difficile à trouver. Voici quelques caractéristiques qui permettent d'identifier des particules microplastiques dans l'échantillon: Par exemple, pas de structure cellulaire,,, bords irréguliers tranchants tordus, épaisseur uniforme, des couleurs distinctives (bleu, vert, jaune, etc.).
3. Identification chimique de microplastiques
- La spectroscopie FTIR-ATR
- Avant l'analyse nettoyer le système de détection avec de l'alcool et un chiffon non pelucheux.
- Enregistrer un spectre de fond. Placer l'échantillon sur le porte-échantillon et collecter les spectres. Identifier les spectres FTIR Atr- obtenus à l'aide d'une comparaison automatisée du spectre obtenu avec des spectres d'une base de données.
- La spectroscopie FTIR-ATR micro
- Avant l'analyse nettoyer le système de détection avec de l'alcool et un chiffon non pelucheux.
- Placer l'échantillon sur un filtre en verre. Remarque: D'autres filtres peuvent nous êtreed mais leur nature polymère peuvent interférer avec la caractérisation.
- Placez le filtre avec l'échantillon sur la table de balayage automatique et utilisez le joystick pour localiser l'échantillon.
- Enregistrer une image optique et marquer une zone (par exemple 20 de 20 um) où l'échantillon sera caractérisé.
- Enregistrer un spectre de fond.
- Placer l'échantillon sur le porte-échantillon et collecter les spectres à l'emplacement prédéfini.
- Identifier les spectres FTIR-ATR micro obtenu à l'aide d'une comparaison automatisée du spectre obtenu avec des spectres d'une base de données.
Representative Results
Le premier résultat du protocole décrit sont des particules microplastiques classées en six catégories en fonction de leurs caractéristiques visuelles (tableau 1). La première catégorie, et habituellement le plus abondant, sont des fragments (figure 1). Ils sont rigides, d'épaisseur, avec des bords tranchants tordus et une forme irrégulière. Ils peuvent être dans une variété de couleurs différentes. La deuxième catégorie sont des films (figure 2). Ils apparaissent également dans des formes irrégulières, mais en comparaison avec des fragments, ils sont minces et flexibles et généralement transparent. La troisième catégorie sont des pastilles (figure 3), provenant généralement de l'industrie des plastiques. Ils sont irréguliers, des formes rondes, et normalement plus grand en taille, autour de 5 mm de diamètre. Ils sont généralement à plat sur un côté et peuvent être de différentes couleurs. La quatrième catégorie sont granulés (figure 4). En comparaison avec des pastilles, ils ont une forme ronde régulière et généralement d'une taille plus petite, d'environ 1 mm de diamètre. Ils apparaissent dans des couleurs naturelles(Blanc, beige, marron). La cinquième catégorie sont filaments (figure 5). Ils sont, à côté de fragments, le type de particules microplastiques le plus abondant. Ils peuvent être courtes ou longues, avec différentes épaisseurs et couleurs. La dernière catégorie sont les mousses (figure 6). Ils viennent le plus souvent de grosses particules de styromousse. Ils sont une forme irrégulière doux et blanc à jaune.
Le résultat principal de microplastiques échantillonnage et l'analyse de l'échantillon est le nombre de particules microplastiques par échantillon. Ces données peuvent encore être normalisées par km 2. La formule utilisée pour la normalisation est la suivante:
particules microplastiques par zone échantillon / prélèvement,
où la zone d'échantillonnage est calculé en multipliant la distance d'échantillonnage par la largeur de l'ouverture du filet mante (tableaux 2, 3; figure 7). En outre, les particules peuvent être analysées avec imun logiciel d'analyse d'âge. Les résultats comprennent la longueur maximale et la surface de chaque particule (tableau 4). Figure 8a montrent des particules avant l'analyse de l'image et la figure 8b est après l'analyse d'image, où chaque particule est mesurée et numérotée. Enfin, une analyse chimique du nombre total le plus élevé possible ou de particules par échantillon est recommandée. En utilisant la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier un spectre de la particule choisie est acquise, tel que représenté sur la figure 9. Ce spectre est ensuite comparé avec les spectres de la bibliothèque de logiciels (figure 10). Le résultat final montre si une particule donnée est une matière plastique ou non, et indique le type de matière plastique de la structure chimique.
| 1 | débris |
| 2 | Films |
| 3 | Pellets |
| 4 | Granules |
| 5 | filaments |
| 6 | Mousse s |
Tableau 1: Catégories de particules microplastiques.
Figure 1: Exemple de particules de catégorie: Fragments. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Exemple de particules de la catégorie: Films. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3: Exemple de particules de la catégorie: Pellets. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Exemple de particules de la catégorie: Granules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Exemple de particules de la catégorie: Filaments. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Exemple de particules de la catégorie: Mousses. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Échantillonnage Distance [km] | 2 |
| largeur Manta [km] | 0,0006 |
| Zone d'échantillonnage [km 2] | 0,0012 |
Tableau 2: Exemple de données de l' enquête, utilisées pour le calcul de particules microplastiques par km 2.
| Non | Non / km 2 | |
| débris | 301 | 250833 |
| films | 45 | 37500 |
| pellets | 15 | 12500 |
| granulés | 8 | 6667 |
| mousses | 33 | 27500 |
| filaments | 223 | 185833 |
Tableau 3: Exemple de résultats de l' enquête, où les données classées en 6 groupes sont comptés et normalisés par km 2 (Non - nombre de particules).
Figure 7: Exemple de résultats représentatifs après la catégorisation visuelle de particles (Non - nombre de particules). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Index Région | Zone [mm²] | Longueur maximale [mm] |
| 1 | 8.010 | 5.506 |
| 2 | 10,517 | 5.628 |
| 3 | 12.185 | 5.429 |
| 4 | 3,367 | 3,367 |
| 5 | 2.475 | 2.155 |
| 6 | 1.809 | 2.943 |
| 7 | 6.604 | 5.238 |
| 8 | 5.779 | 4.037 |
| 9 | 4.472 | 3.791 |
| dix | 16,907 | 5.355 |
| 11 | 7.246 | 3.733 |
| 12 | 7.867 | 4.622 |
| 13 | 6.411 | 5.056 |
| 14 | 3.281 | 3.070 |
| 15 | 12,937 | 5.554 |
| 16 | 6.709 | 3.716 |
Tableau 4: Exemple de résultats d'analyse d'images où la superficie [mm 2] et la longueur maximale [mm] de chaque particule sont mesurées.
Figure 8: Exemple de l' image acquise a) avant et b) après l' analyse d'images de particules avec un logiciel d'analyse d'image.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9: Exemple de spectres mesurés sur une particule sélectionnée avec des pics marqués et leurs longueurs d' onde [cm -1]. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 10: Exemple de comparaison des spectres acquis à partir de particules sélectionné pour meilleur match de la bibliothèque des spectres ATR-FTIR. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
Microplastiques échantillonnage sur la surface de la mer au filet manta est une méthode largement utilisée pour l'échantillonnage des microplastiques sur la surface de la mer, mais à ce jour il n'y a pas eu de méthodologie unifiée. Un grand volume d'eau peut être filtrée à travers le filet manta, donc la possibilité de piéger un nombre pertinent de microplastiques est élevé et les résultats sont perçus comme fiables. La comparabilité des résultats entre les différents échantillons est assurée par la normalisation. Dans notre cas, les concentrations étaient liées à la zone échantillonnée en multipliant la distance au chalut par la largeur horizontale de l'ouverture nette. Une autre option est d'utiliser un débitmètre, fixé à l'ouverture nette. L'utilisation d'un débitmètre est possible puisque le filet mante avec ses ailes latérales est très stable sur la surface de la mer, et donc sauter sur les vagues est minime. Un débitmètre enregistre le volume d'eau filtrée et permet la normalisation des résultats par le volume d'eau ainsi prélevé 16.
17, 18, mais dans ce cas , vous devez être sûr que le filet est hors de la zone de sillage. La distance sur laquelle le chalut est réglé pour l' échantillonnage, doit être déterminé individuellement, étant donné que la zone des turbulences causées par le récipient varie de la taille du navire et de la vitesse du bateau 19, 20.
La séparation des particules microplastiques des échantillons de surface de la mer est le plus souvent effectué simplement en identification visuelle 21. Particules supérieures à 1 mm peuvent être facilement identifiés à l'oeil nu, tandis que les particules plus petites que 1 mm nécessitent l'utilisation d'un stéréomicroscope. Pour réduire le risque de confondre les particules non-plastique avec ceux en plastique, en utilisant la lumière de polarisation sur stéréomicroscopes est recommandé. La possibilité d'une mauvaise identification des particules de plastique devient plus élevé avec des particules plus petites. Ainsi , les particules> 0,5 mm ne peut être identifié visuellement 21, par l'utilisation du stéréomicroscope. Pour des particules inférieures à 0,5 mm,une méthode supplémentaire, plus précise est nécessaire , par exemple micro spectroscopie ATR-FTIR 21.
Pendant le processus de séparation microplastiques de l'échantillon, la possibilité de contamination de l'échantillon avec les filaments dans l'air est très élevé. Pour cette raison, le contrôle des boîtes de Pétri gauche ouvert sur la table de travail est fortement recommandé pour l'identification des particules en suspension de contaminants potentiels. A savoir, la qualité des données dépend fortement de: 1) la précision de la personne travaillant avec l'échantillon, 2) la qualité et l' agrandissement de la loupe binoculaire, et 3) la quantité de matière organique dans l'échantillon 16. Après l' identification visuelle , il est fortement recommandé d'analyser les particules triées avec l' une des techniques disponibles pour l' identification chimique de la matière 8.
Il existe plusieurs méthodes pour l'identification de polymère, parmi lesquelles la spectroscopie FTIR et la spectroscopie Raman sont les plus frétly utilisé 22. spectroscopie FTIR et Raman sont des techniques complémentaires et leur exactitude est similaire. Dans notre protocole, le FTIR et la spectroscopie micro FTIR avec "réflectance totale atténuée" (ATR) sont présentés. Ils sont simples à utiliser et permettent des résultats rapides et précis. Les polymères plastiques possèdent infrarouge (IR) hautement spécifique avec des modèles de bande distincts, rendant ainsi la spectroscopie IR d' une technique optimale pour l'identification des microplastiques 21. L'énergie du rayonnement infrarouge excite une vibration moléculaire spécifique lors de l' interaction avec un échantillon, ce qui permet la mesure des spectres IR caractéristique 22. La spectroscopie FTIR peut également fournir des informations supplémentaires sur les particules, telles que l' intensité de l' oxydation 23 et le niveau de dégradation 24. Alors que l'ATR-FTIR est approprié pour l'identification chimique des particules plus grosses (> 0,5 mm), la spectroscopie FTIR-ATR micro-ordinateur peut fournir des informations sur la structure chimique des particules & #60: 0,5 mm, car elle combine la fonction d'un microscope et d'un spectromètre infrarouge.
Avant d' utiliser IRTF et par spectroscopie FTIR micro particules microplastiques doivent être préalablement séché, étant donné que l' eau absorbe fortement le rayonnement infrarouge 22, et purifié, dans le cas où ils sont couverts par les biofilms et / ou d' autres adhérents organiques et inorganiques, qui peuvent influencer les spectres IR. La façon la plus non-invasive pour purifier des échantillons est par agitation et un rinçage à l' eau douce 25. Si cela ne suffit pas, alors l'utilisation de 30% de peroxyde d'hydrogène est recommandé. Toutes les autres méthodes peuvent avoir des effets négatifs sur les particules microplastiques (par exemple, le nettoyage par ultrasons peut encore briser des particules, des solutions acides ou alcalines fortes peuvent endommager plusieurs polymères plastiques, etc.) et, par conséquent leur utilisation est déconseillée. Plus prometteuse est l'utilisation d'une digestion enzymatique séquentielle comme une étape de purification amicale plastique. Purification des enzymes différentes techniques (par exemple, la lipase, unemylase, protéinase, chitinase, cellulase, protéinase-K) a été appliquée avec succès à la réduction d' une matrice biologique du plancton et donc avérée être une technique précieuse pour réduire au minimum les artefacts de la matrice pendant FTIR spectroscopy mesures 22.
Séparation des microplastiques par identification visuelle et l'identification chimique des particules sélectionnées sont deux processus extrêmement fastidieux. Ce travail doit être fait par une personne précise et patient qui a une expérience avec stéréomicroscopes, non seulement en reconnaissant les particules de plastique, mais aussi dans la reconnaissance de la matière biologique. Même une personne expérimentée ne peut pas discriminer toutes les particules de microplastiques potentiels sans ambiguïté de chitine ou diatomées fragments 22. Par conséquent, le taux de tri visuel d'erreur se situe entre 20% 26 à 70% et 21 augmente avec la diminution de la taille des particules.
Acknowledgments
Le développement de ce protocole a été fondé par le Programme de coopération IPA Adriatique transfrontalière 2007-2013, dans le cadre du projet DeFishGear (1 ° str / 00010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
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