Summary
바다 표면에 microplastics 샘플링, 입자의 microplastic 화학적 식별의 분리 : 프로토콜은 아래의 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 해양 쓰레기에 MSFD 기술 하위 그룹에 의해 출판 microplastics 모니터링을위한 권고와 일치한다.
Protocol
바다 표면에 microplastics 1. 샘플링
- 라인과 캐러 비너를 사용하여 스피너 커 붐 또는»A-프레임«를 사용하여 용기의 측면에서 만타 그물을 배포합니다.
- 후류 영역 내부의 난류의 영향을 물을 수집하는 것을 방지하기 위해 - (보트에서 4m 거리. 약 3) 후류 영역에서 만타 그물을 배포합니다.
- 데이터 시트의 초기 GPS 좌표와 초기 시간을 기록합니다.
- 약의 속도로 하나의 직선 방향으로 이동하기 시작합니다. 2-3 매듭 30 분 동안의 시간 측정을 시작한다.
- 30 분 후 보트를 중지하고 최종 GPS 좌표를 기록, 경로의 길이는 제공된 데이터 시트에 평균 보트 속도에서 만타 그물을 들어 올려 (가장 정확한 방법은 GPS 좌표에서 길이를 계산하는 것입니다) 물.
- 보트 워싱턴에서 잠수 펌프 또는 물을 사용하여 해수와 인터넷의 외부로부터 철저하게 만타 그물을 씻어터 저수지. 대구 끝으로 그물에 부착 된 모든 입자를 집중하기 위해 대구 끝까지 타 입의 방향으로 씻어.
주 : 오염을 방지하기 위해 그물의 개구부를 통해 샘플을 씻어 마십시오. - 안전하게 대구 끝을 제거하고 대구의 샘플은 300 μm의 메쉬 크기 체 이하를 종료 체.
- 외부로부터 철저하게 대구 끝을 씻어 체를 통해 샘플의 나머지 부분을 붓는다. 더 이상 대구 끝에 내부에 입자가 없을 때까지이 단계를 반복합니다.
- 체의 한 부분에 체에 대한 모든 자료를 집중한다.
- 깔때기를 이용하여 70 % 에탄올을 사용하여 유리 병 또는 플라스틱 병에 체를 헹군다.
- , 병을 닫습니다 종이 수건으로 닦아 뚜껑을 라벨 및 방수 마커 샘플 이름과 날짜와 함께 단지 외부 (당신은 또한 가능한 손실을 방지하기 위해 항아리에 연구 개 종이에 연필로 쓴 두 번째 레이블을 넣어해야합니다 의항아리에 삭제 된 라벨로 인해 샘플 이름). 멋진 상자에 표시된 플라스틱 병을 전송합니다.
일반적인 샘플링 조건 참고 : 풍속 이상이 퍼트 안 파도가 너무 높고 그물 바다 표면에 안정하지 않기 때문에. 트로 올 동안 일정한 속도로 일정한 직선 코스를 유지하는 것이 중요하다. 만타 순 개방의 절반은 샘플링 동안 침수되어야한다. 샘플링 시간은 30 분이어야한다 (천연 소재의 많은 양이 경우, 예를 들어, 플랑크톤 꽃을 샘플링 기간은 짧아 질 수 있습니다.) 플라스틱 도구와 용기의 사용을 피하십시오. 합성 의류 (예 : 양털)을 피하고, 로프 및 선박 타 네트의 접촉은 시료의 오염을 방지합니다. 배포 및 그물을 캡처하는 동안 만타 순 또는 보트 선체 손상되지 않도록 매우주의해야합니다.
바다 표면 샘플에서 microplastics 2. 분리
- 샘플은 포함하지 않는 경우25mm보다 큰 모든 항목과, 깨끗 3 단계와 직접 계속 나타납니다.
- 시각적 식별 및 핀셋을 사용하여 체 (≤300 μm의 메쉬 크기)을 통해 샘플을 붓고 샘플에서 크기> 5mm (매크로 및 메조 쓰레기)의 모든 자연 또는 인공 쓰레기 개체를 제거합니다. 여기에 부착 된 모든 microplastic 쓰레기를 제거하기 위해 증류수로 조심스럽게 각 제거 객체를 씻어주의하십시오. 별도의 용기에 모든 자연과 인공 쓰레기 개체를 저장합니다. 데시 케이 터 (또는 야외에서,하지만 폐쇄 접시)의 모든 자연과 인공 쓰레기 개체를 건조하고 무게. 쓰레기 항목 16의 카테고리의 마스터 목록에 따라 모든 쓰레기 개체> 25mm (매크로 쓰레기)를 확인합니다.
- 모든 큰 객체를 제거한 후, 분출 병 또는 수돗물을 사용하여 자체의 한 부분에 남아있는 부분을 농축시켰다. FUNN의 도움으로 70 % 에탄올의 최소량을 사용하여 유리 샘플 용기에 붓고엘자.
주의 :이 단계에서는 70 % 에탄올의 사용은 시료를 유지하는 것이 중요하다. 또한 샘플의 육안 검사의 단계에서, 에탄올 따라서 쉽게 찾을 될 유기체와 화려한 플라스틱을 변색하는 데 도움이됩니다. - 샘플 (표본)을 소량 취하여 유리 페트리 접시에 부어. 실체 현미경의 사용과 샘플을 분석 (20 - 80 배 줌) 및 microplastic 입자를 검색합니다.
- 각 microplastic 입자는 표 1에 나열된 카테고리 중 하나로 분류하고 카테고리 이름이 표시 페트리 접시 나 기타 유리 바이알에 투입한다. 페트리 접시는 항상 폐쇄 할 필요가있다.
참고 : 샘플에서 분리 microplastics는 보수적 및 분석을위한 작은 입자보다 오히려 선택합니다. 입자의 실제 화학 구조는 여전히 나중에 결정될 것이다. microplastics가 붙어 때문에 큰 항목 아래에 숨겨져있을 수 있습니다 모든 측면에서 큰 개체를 분석해야합니다.또한, 페트리 접시의 한쪽 이미 분석 된 개체를 이동하는 것이 도움이 될 수있다. - 장비 (마이크로 미터 슬라이드 또는 이미지 분석 소프트웨어에 의해 보정 안구 통치자)를 측정 현미경 페트리 접시를 넣고 필라멘트를 제외한 각 입자의 크기 (가장 긴 대각선을 측정)를 측정하고 색상을 확인합니다. 각 표본은 다른 사람에 의해 검토되어야한다. 유리 벽에 부착 된 모든 입자는 페트리 접시에 세척되도록 샘플이 들어있는 유리 용기를 씻어주의하십시오.
- 개별적으로 분석 규모의 사용에 의해 각 카테고리의 microplastic 입자를 무게. Microplastic 입자는 계량하기 전에 건조해야합니다. 폐쇄 페트리 접시 데시 케이 터에 넣어하거나 샘플 입자 (입자 폐쇄 페트리 접시의 무게가 일정)까지 건조 된 폐 접시에 건조 남아있을 수있다.
- 마이크로 쓰레기를 식별합니다. microplastics의 검색에서 샘플을 분석 할 때 다음 사항을 고려하시기 바랍니다다른 사람들이 찾을 난이도가있을 수 있지만 일부 입자 (색상, 모양, 크기)을 쉽게 볼 수 있습니다. 다음은 샘플에서 microplastic 입자를 식별하는 몇 가지 기능은 다음과 같습니다 예를 들어, 아니 셀 구조, 고르지, 날카로운, 비뚤어진 가장자리, 균일 한 두께, 독특한 색상 (파란색, 녹색, 노란색, 등).
microplastics 3. 화학 물질의 식별
- ATR-FTIR 분광기
- 이전 분석에 알코올과 보풀이없는 천으로 검출 시스템을 청소합니다.
- 배경 스펙트럼을 기록합니다. 샘플 홀더에 샘플을 놓고 스펙트럼을 수집합니다. 데이터베이스의 스펙트럼으로 얻어진 스펙트럼의 자동 비교를 사용하여 얻어진 ATR- FTIR 스펙트럼을 확인합니다.
- 마이크로 ATR-FTIR 분광기
- 이전 분석에 알코올과 보풀이없는 천으로 검출 시스템을 청소합니다.
- 유리 필터에 샘플을 놓습니다. 참고 : 다른 필터는 우리가 될 수 있습니다에드 그러나 그들의 폴리머 특성은 특성을 방해 할 수 있습니다.
- 자동 스캔 테이블에 샘플 필터를 놓고 샘플을 찾기 위해 조이스틱을 사용합니다.
- 광학 이미지를 기록하고 영역을 표시합니다 (예 : 20 μm의 20에 의해) 샘플을 특징으로 할 위치.
- 배경 스펙트럼을 기록합니다.
- 샘플 홀더에 샘플을 놓고 미리 정의 된 위치에서 스펙트럼을 수집합니다.
- 데이터베이스의 스펙트럼으로 얻어진 스펙트럼의 자동 비교를 사용하여 얻어진 마이크로 ATR-FTIR 스펙트럼을 확인합니다.
Representative Results
기술 된 프로토콜의 첫 번째 결과들은 시각 정보 (표 1)에 따라 여섯 가지로 분류 microplastic 입자이다. 첫 번째 범주, 통상 가장 풍부한 것은, 단편 (도 1)이다. 그들은 날카로운 비뚤어진 가장자리와 불규칙한 모양, 두께, 강성이다. 서로 다른 다양한 색상 일 수있다. 두 번째 범주는 영화 (그림 2)입니다. 또한 부정형으로 나타나지만, 단편에 비하여 이들은 얇고 유연한 보통 투명하다. 세 번째 범주는 일반적으로 플라스틱 산업에서 발생, 펠렛 (그림 3)입니다. 그들은 불규칙한 둥근 모양이며, 직경 5mm의 주위에, 크기가 일반적으로 더 큰. 그들은 한쪽에 일반적으로 평평하고 다양한 색상이 될 수 있습니다. 네 번째 범주는 과립 (그림 4)입니다. 펠릿에 비해, 이들은 직경 1mm 주위에 규칙적인 원형 일반적으로 작은 크기를 갖는다. 그들은 자연 색상에 표시(흰색, 베이지 색, 갈색). 다섯 번째 범주는 필라멘트 (그림 5)입니다. 그들은, 조각, microplastic 입자의 가장 풍부한 유형 옆에 있습니다. 그들은 서로 다른 두께와 색상, 짧거나 긴 될 수 있습니다. 마지막 범주는 폼 (그림 6)이다. 그들은 대부분 스티로폼의 큰 입자에서 왔습니다. 그들은 부드럽고 불규칙한 모양과 색상 노란색에 흰색입니다.
microplastics 샘플링 및 샘플 분석의 주요 결과는 샘플 당 microplastic 입자의 수이다. 이러한 데이터는 km 2 당 더 정규화 할 수 있습니다. 정규화에 사용되는 공식은 다음과 같다
샘플 / 샘플링 면적당 microplastic 입자
(도 7 표 2, 3)의 샘플링 영역은 타 그물의 개구부의 폭으로 샘플링 간격을 곱하여 계산된다. 또한, 입자는 IM으로 분석 할 수있다연령 분석 소프트웨어. 결과는 각 입자 (표 4)의 최대 길이와 면적을 포함한다. 이미지 분석 전에 그림 8a 쇼 입자와 그림 8b는 각 입자 측정 및 번호가 영상 분석, 후입니다. 마지막으로, 샘플 당 입자의 전체 또는 가능한 가장 높은 번호의 화학 분석을 권장합니다. 푸리에 스펙트럼이 다음 소프트웨어 라이브러리 (도 10)의 스펙트럼과 비교도 9에 도시 된 바와 같이 선택된 입자의 스펙트럼이 취득되고 변환 적외 분광의 사용. 소정의 입자가 플라스틱인지 및 화학 구조의 플라스틱의 종류를 나타내는 경우, 최종 결과가 표시된다.
| 1 | 조각 |
| 이 | 영화 |
| 삼 | 펠렛 |
| 4 | 과립 |
| (5) | 필라멘트 |
| 6 | 거품 에스 |
표 1 : microplastic 입자의 종류.
그림 1 : 조각 : 카테고리 입자의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 영화 : 카테고리 입자의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 : 펠렛 : 카테고리 입자의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 카테고리 입자의 예 : 과립. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 카테고리 입자의 예 : 필라멘트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 거품 : 카테고리 입자의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 샘플링 거리 [km] | 이 |
| 만타 폭 [km] | 0.0006 |
| 샘플링 영역 [km 2] | 0.0012 |
표 2 : km 2 당 microplastic 입자의 계산에 사용 설문 조사 데이터, 예.
| 아니 | 없음 / km 2 | |
| 조각 | (301) | 250833 |
| 영화 | (45) | 37500 |
| 펠릿 | (15) | 12500 |
| 과립 | 8 | 6667 |
| 폼 | (33) | 27500 |
| 필라멘트 | (223) | 185833 |
표 3 : 6 그룹으로 분류 데이터를 계산하지 않고 km 2 당 정규화 조사 결과의 예 (없음 - 입자의 수).
그림 7 : 페이지를 시각적으로 분류 한 후 대표적인 결과의 예문서 (아니오 - 입자의 수). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 인덱스 지역 | 지역 [mm² 인] | 최대 길이 [mm] |
| 1 | 8.010 | 5.506 |
| 이 | 10.517 | 5.628 |
| 삼 | 12.185 | 5.429 |
| 4 | 3.367 | 3.367 |
| (5) | 2.475 | 2.155 |
| 6 | 1.809 | 2.943 |
| (7) | 6.604 | 5.238 |
| 8 | 5.779 | 4.037 |
| 9 | 4.472 | 3.791 |
| (10) | 16.907 | 5.355 |
| (11) | 7.246 | 3.733 |
| (12) | 7.867 | 4.622 |
| (13) | 6.411 | 5.056 |
| (14) | 3.281 | 3.070 |
| (15) | 12.937 | 5.554 |
| (16) | 6.709 | 3.716 |
표 4 : 영역 [mm 2] 각 입자의 최대 길이 [mm]가 측정되는 화상 해석 결과의 예.
도 8의 실시 예는 화상 전)을 취득하고 b) 이미지 분석 소프트웨어 입자 이미지 분석 후.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : 표시 봉우리와 [cm -1] 그 파장으로 선택된 입자에 측정 된 스펙트럼의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : ATR-FTIR 스펙트럼 라이브러리에서 최고의 경기를 선택한 입자에서 획득 한 스펙트럼의 비교 예. 이 F의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오igure.
Discussion
타 그물로 바다 표면에 Microplastics 샘플링은 바다 표면에 microplastics의 샘플링을 위해 널리 사용되는 방법이지만 날짜에 더 통일 된 방법이 없었다. 많은 양의 물은 망 만타 통해 여과 될 수있다 따라서 microplastics의 해당 번호를 포착 할 가능성이 높고, 그 결과는 신뢰성있는 것으로 인식된다. 다른 샘플 중 결과의 비교는 정규화에 의해 보장된다. 우리의 경우, 농도는 순 개구의 가로 폭 트롤 거리를 곱하여 샘플 영역에 관련되었다. 또 다른 옵션은 넷 개구부에 고정 된 유량계를 사용하는 것이다. 그 측면 날개 만타 그물 바다 표면에 매우 안정하고, 따라서 파동의 호핑 최소이므로 유량계의 사용이 가능하다. 유량계 여과 물의 부피를 기록함으로써 샘플링 된 물 (16)의 체적 당 결과의 정규화를 가능하게한다.
17, 18,하지만 당신은 그물이 후류 영역에서 있는지 확인해야하는 경우입니다. 용기에 의한 난류의 영역이 상기 용기의 크기와 상기 보트 (19), (20)의 속도의 변화 때문에 트롤이 샘플링에 대해 설정되는 간격은 개별적으로 결정되어야한다.
바다 표면 샘플에서 microplastic 입자의 분리는 대부분 시각적 식별 (21)에 의해 바로 이루어집니다. 1mm보다 작은 입자는 실체의 사용을 필요로하면서 큰 1mm 이상의 입자를 육안으로 쉽게 식별 할 수있다. 실체 현미경의 편광을 이용하여, 플라스틱 사람과 비 플라스틱 입자를 혼동의 가능성을 줄이기 위해 권장합니다. 플라스틱 입자의 오인의 가능성은 작은 입자와 높은 가져옵니다. 따라서 입자> 0.5 mm는 실체 현미경을 사용하여 시각적으로 확인 (21) 할 수있다. 0.5 mm보다 작은 입자추가로,보다 정확한 방법은 예를 들어 마이크로 ATR-FTIR 분광기 (21)가 필요합니다.
샘플로부터 microplastics 분리하는 과정에서 부유 필라멘트 샘플 오염의 가능성이 매우 높다. 이 때문에, 작업 테이블에 열려 배양 접시를 제어하는 강력한 잠재적 인 오염 공기 입자의 식별을 위해 사용하는 것이 좋습니다. 즉, 데이터의 품질 강하게 의존 1) 샘플 16 샘플 2) 품질과 입체의 배율 및 유기물 3) 양의 작업을하는 사람의 정밀도. 시각적 식별 후에 강하게 재료 (8)의 화학 식별 가능한 방법 중 하나에 정렬 된 입자를 분석하는 것을 권장한다.
여러 가지 방법 중 어느 FTIR 스펙트럼과 라만 분광법 가장 FREQUEN은 중합체 식별 존재TLY (22)을 사용했다. FTIR과 라만 분광법은 상호 보완적인 기술이며, 그 정확도는 비슷합니다. 우리의 프로토콜에서 "감쇠 총 반사율"(ATR)와 FTIR 및 마이크로 FTIR 스펙트럼이되게됩니다. 그들은 사용하기 간단하고 빠르고 정확한 결과를 가능하게한다. 플라스틱 폴리머 따라서 IR이 microplastics (21)의 식별을위한 최적의 기술을 분광법 만드는 독특한 밴드 패턴이 매우 특정 적외선 (IR) 스펙트럼을 갖는다. IR 스펙트럼 특성 (22)의 측정을 가능하게하는 샘플과 상호 작용할 때 IR 방사선의 에너지는 특정 분자의 진동을 여기시킨다. FTIR 스펙트럼은 또한 산화 분해 및 23의 24 단계의 강도 등의 입자에 대한 추가적인 정보를 제공 할 수있다. ATR-FTIR 큰 입자의 화학적 식별 (> 0.5 mm)에 적합한 반면, 마이크로 ATR-FTIR 분광기 # 입자의 화학 구조에 대한 정보를 제공 할 수있다60 0.5 mm, 그것이 현미경 적외선 분광기의 기능을 겸비한있다.
물이 강한 IR 방사선 (22), 정제를 흡수 이후 FTIR 마이크로 FTIR 분광기를 사용하기 전에 microplastic 입자 경우들이 IR 스펙트럼에 영향을 미칠 수있는 바이오 필름 및 / 또는 다른 유기 및 무기의 부착물로 피복되는, 이전에 건조한다. 샘플을 정화하는 가장 비 침습적 방법은 교반 및 담수 (25)와 린스입니다. 이 충분하지 않은 경우, 30 %의 과산화수소를 사용하는 것이 바람직합니다. 다른 모든 방법이 부정적인 microplastic 입자에 대한 영향 (예 : 더 입자를 깰 수 초음파 세척, 강한 산성 또는 알칼리성 용액 등 여러 가지 플라스틱 폴리머를 손상시킬 수 있습니다) 따라서 그 사용하지 않는 것이 좋습니다을 가질 수 있습니다. 유망한 플라스틱 친화 정제 단계와 같은 일련의 소화 효소의 사용이다. 정제 다른 기술 효소를 사용하여 (예 : 리파제하는mylase, 테가 키틴은 셀룰라아제는 테-K)는 성공적 플랑크톤 생물학적 매트릭스를 감소시키고 따라서 FTIR 분광학 측정 22 중 매트릭스 아티팩트를 최소화하기위한 유용한 기술로 입증 적용되었다.
시각적 식별 및 선택 입자의 화학 식별하여 microplastics의 분리는 모두 매우 시간이 많이 소요되는 프로세스입니다. 이 작품은 플라스틱 입자를 인식에서뿐만 아니라, 생물학적 문제를 인식에서뿐만 아니라 실체 현미경과 경험을 가지고 정확하고 환자 개인에 의해 수행되어야한다. 심지어 경험이 풍부한 사람은 키틴 또는 규조류 조각 (22)에서 명확하게 모든 잠재적 microplastic 입자를 구별 할 수 없습니다. 따라서, 시각적 인 정렬 에러 레이트 20 % 26 70 % 21 범위 및 입자 크기 감소와 함께 증가한다.
Acknowledgments
이 프로토콜의 개발은 DeFishGear 프로젝트 (1 ° STR / 00010)에서, IPA 아드리아 국경 간 협력 프로그램 2007-2013에 의해 설립되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In this protocol no specific equipment or reagents were used. |
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