Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dierlijke studies werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het dier protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Arkansas voor Medische Wetenschappen. Alle dieren werden gehuisvest onder standaard voorzien van airconditioning, dier faciliteit bij 20 ± 2 ° C met 10 - 15 per uur cycli van frisse lucht en gratis toegang tot standaard knaagdier voedsel en water. Bij aankomst werden de muizen in quarantaine gehouden voor 1 week en op voorwaarde dat gecertificeerd knaagdieren chow.

1.Radiation Exposure en in vivo Arrestatie van metafasecellen

  1. Expose un-verdoofde muizen tot 2 Gy hele lichaam straling in een bestralingskamer. Tijdens de bestraling, plaats muizen in een goed geventileerde Holding kamer om ervoor te zorgen dat ze niet vrij kunnen bewegen en een uniforme dosering te ontvangen.
  2. Injecteer 100 ui 0,05% colchicine-oplossing (colchicine poeder opgelost in calcium en magnesium vrij PBS) intraperitoneaal met behulp van een 25 G naald bevestigd met 1 ml wegwerpspuit. Vermijd injectie direct in een orgaan.
  3. Laat het dier in de kooi 2 uur vóór beenmerg celoogst. Observeer het dier op tekenen van pijn of angst.

2. Bone Marrow Cell Oogst en isolatie van Bone Marrow mononucleaire cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugatie

  1. Euthanaseren de muis door CO 2 stikken.
  2. Spray 70% ethanol op de rug- en buikzijde.
  3. Maak een 2 cm incisie op de buikhuid met een scherpe schaar. Pak de huid aan beide zijden van de incisie met stompe pincet en trek open de buikspieren.
  4. Snijd beide achterpoten met een schaar en ze onmiddellijk plaatsen in pre-gekoelde PBS met 4% FBS.
  5. Reinig alle spieren aan de achterste ledematen met een scherp scheermesje en katoen gaasverband.
  6. Scheid de tibia van het dijbeen. Trim beide uiteinden van elk bot met een scheermesje.
  7. Spoel de inhoud van het beenmerg met 3 ml PBS (met 4% FBS) met een 23 G naald bevestigd aan een 3 ml spuit en laat de inhoud in een 15 ml centrifugebuis. Langs de celsuspensie tenminste 10 maal door de naald om een ​​enkele celsuspensie te maken.
  8. overlay voorzichtig de celsuspensie op een gelijk volume van lymfocyt scheidingsmedium (3 ml) zonder de interface tussen de celsuspensie en lymfocyt scheidingsmedium. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
  9. Verzamel de bufferlaag weg zonder de andere lagen en overdracht verstoort een nieuwe 15 ml centrifugebuis.

3. Voorbereiding van Metaphase Cell Spreads

  1. Voeg 10 ml PBS aan de buis met de bufferlaag.
  2. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Dan breken up thij celpellet met zachte tikken en voeg 10 ml PBS.
  4. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de celpellet, breken de pellet en voeg 4 ml voorverwarmde hypotone 0,075 M oplossing van kaliumchloride. Voeg hypotone oplossing druppelsgewijs met zachte constant schudden.
  6. Incubeer cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
  7. Na hypotone behandeling, een gelijk deel (4 ml) fixatief (methanol: ijsazijn, 3: 1 v / v) in 15 mL buis en meng voorzichtig door het buisje.
  8. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant.
  9. Breken de celpellet met tikken gevolgd door voorzichtig vortex gedurende enkele seconden en voeg 3 ml fixeeroplossing druppelsgewijs onder constant schudden.
  10. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten.
  11. Verwijder de bovenstaande vloeistof, breken de cel pellet met gentle tikken, en voeg 3 ml vers fixeermiddel.
  12. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en de bovenstaande vloeistof. Breek de celpellet met zachte tikken, en voeg vers 3 ml fixeermiddel.
  13. Herhaal stap 3.12 nog twee keer.
  14. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder supernatant zonder de celpellet. Voeg vervolgens 400 tot 600 ul fixatief en meng met pipetteren.
  15. Drop 30 pi vaste cellen op pre-gereinigd en nat slides gekanteld in een hoek van 45 ° en laat de dia's aan de lucht drogen volledig 's nachts.

4. Muis Chromosome schilderij van mFISH

  1. Chromosome Denaturation
    1. Plaats de dia met metafase cel spreads in 2x SSC gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Dehydrateer de schuif door seriële ethanol wassen gedurende 2 minuten elk in 70%, 80% en 100%. Incubeer gedurende 60 minuten bij 65 ° C.
    3. Verwarm 40 ml denaturatie-oplossing (70% formamide / 2x SSC; pH 7,0) tot 70 ° C (± 2 ° C) in een glazen Coplin jar gedurende 30 min. Denatureren chromosomen door incubatie van de dia in voorverwarmde denaturatie oplossing voor 1-1,5 min.
    4. Quench glijden onmiddellijk in ijskoude 70% ethanol gedurende 2 minuten om de denaturatie te stoppen en te voorkomen dat het gedenatureerde chromosomen van opnieuw annealing. uitdrogen dan door wassen met 80% ethanol gedurende 2 minuten. Herhaal de ethanol wassen met 100% ethanol gedurende 2 minuten. Volledig droog de glijbaan bij kamertemperatuur.
  2. Denaturatie en hybridisatie van Probe Mengsel
    1. Kort gecentrifugeerd probe mengsel van de fabrikant, overdracht 10 pi probe mengsel in een 500 pi snap cap centrifugebuis en denatureren door incubatie bij 80 ° C (± 2 ° C) in een waterbad gedurende 7 min.
    2. Plaats de centrifugebuis met probe mengsel in een waterbad bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
    3. Breng het gedenatureerde probe mengsel op de dia met gedenatureerde chromosomes.
    4. Zorgvuldig bestrijken het gebied met een 18 mm x 18 mm glazen afdekplaat slip en te elimineren zichtbare luchtbellen door zeer voorzichtig te drukken op de cover slip te glijden. Dicht alle vier zijden van het dekglaasje met rubber cement en incubeer gedurende 12 h tot 16 h in het donker bij 37 ° C in een vochtige kamer voor hybridisatie.
  3. Bericht Hybridisatie Wassen en detectie
    1. Verwijder voorzichtig de rubber cement en het deksel slip.
    2. Plaats slide in voorverwarmde 0,4x SSC bij 74 ° C (± 2 ° C) gedurende 5 minuten.
    3. Wassen dia in wasoplossing II (4x SSC / 0,1% Tween-20) gedurende 2 min.
    4. Plaats 20 gl anti-fade fixeermiddel met DAPI tegenkleuring (1,5 ug / ml) en bedek met een dekglaasje bedekt. Druk voorzichtig op de dekglaasje met lab weefsel luchtbellen en overtollige montage oplossing te verwijderen. Sluit de randen van dekglaasje met nagellak.
    5. Bekijk dia's met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met passende filters.

    5. Spectral Karyotypering (SKY) van de muis Chromosomen

    1. Chromosoom en Probe Denaturation
      1. Equilibreren dia in 2 x SSC bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, zonder schudden.
      2. Dehydrateren dia in een ethanolreeks (70%, 80% en 100% ethanol) gedurende 2 min elk bij kamertemperatuur. Air-droog de dia om de ethanol volledig te verwijderen.
      3. Warme 40 ml denaturatie-oplossing (70% formamide / 2xSSC; pH 7,0) in een glazen Coplin jar gedurende 30 min.
      4. Incubeer dia in voorverwarmde oplossing denaturatie gedurende 1 tot 1,5 minuten.
      5. Onmiddellijk dompel de dia in ijskoude 70% ethanol gedurende 2 minuten om de denaturatie te stoppen en te voorkomen dat het gedenatureerde chromosomen van opnieuw annealing.
      6. Dehydrateer de schuif door deze in 80% ethanol gedurende 2 minuten en vervolgens in 100% ethanol gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
      7. Denatureren de SKY sonde (flacon # 1 door fabrikant) in een waterbad ingesteld op 80 ° C (± 2 ° C)gedurende 7 min, en vervolgens onmiddellijk te plaatsen in een andere waterbad ingesteld op 37 ° C gedurende 10 minuten.
    2. Hybridisatie probe
      1. Voeg 10 ul gedenatureerde probe SKY op het gedenatureerde chromosomen.
      2. Plaats voorzichtig een 18 mm x 18 mm glas dekglaasje op de SKY sonde, zodat er geen luchtbellen gevangen onder het dekglaasje.
      3. Dicht de randen van het dekglaasje met rubber cement.
      4. Plaats het preparaat in een bevochtigde lichtdichte kamer en incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende 24 uur tot 36 uur.
    3. Post-hybridisatie Wassen en fluorescentiedetectie
      1. Verwijder rubber cement heel voorzichtig, zonder het dekglaasje verstoren.
      2. Plaats het preparaat in voorverwarmde snelle wasoplossing (0.4x SSC) bij 72 ° C (± 2 ° C) gedurende 5 minuten onder constant schudden. Dompel dia in wasoplossing III (4x SSC / 0,1% Tween 20) en incubeer gedurende 1 min onder schudden.
      3. Optioneel: Voeg 80 ul van het blokkeren van reagens(Buisje # 2 door fabrikant) op het gebied van hybridisatie plaats een 24 mm x 60 mm plastic dekglaasje en incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende 30 min in een vochtige kamer.
      4. Verwijder voorzichtig de plastic dekglaasje en was de dia met voorverwarmde (45 ºC) wasoplossing III gedurende 5 minuten.
      5. Toepassen 80 pi van Cy5 kleuring reagens (flesje # 3 van fabrikant), plaats een 24 mm x 60 mm plastic dekglaasje en incubeer bij 37 ° C in het donker gedurende 40 min in een vochtige kamer.
      6. Dompel de dia in een glazen Coplin pot met voorverwarmde (45 ° C) wasoplossing III (4x SSC / 0,1% Tween 20) en incubeer bij 45 ° C in een waterbad gedurende 2 min onder schudden. Herhaal deze wasstap 3 keer.
      7. Toepassen 80 pi van Cy5.5 de kleurstof (buisje # 4 door fabrikant), plaats een 24 mm x 60 mm plastic dekglaasje en incubeer bij 37 ° C in het donker gedurende 40 min in een vochtige kamer.
      8. Was de dia 3 maal met voorverwarmde (45 ºC) wasoplossing III.
      9. Houd de dia in een gekantelde positie tegen een papieren handdoek om overtollig vocht af te voeren. Voeg 20 ul anti-fade DAPI reagens (flesje # 5 van de fabrikant) en voorzichtig plaats een 24 mm x 60 mm glas dekglaasje, zonder de invoering van eventuele luchtbellen. Sluit de randen van dekglaasje met nagellak en te observeren met een epifluorescentiemicroscoop uitgerust voor het vastleggen van beelden SKY.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Total body bestraling induceert talrijke chromosomale afwijkingen in de beenmergcellen van bestraalde muizen. Het huidige protocol is geoptimaliseerd voor in vivo mitose van beenmergcellen na blootstelling aan straling, oogst van beenmergcellen van de achterpoten van bestraalde muizen, de isolatie van beenmerg mononucleaire cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie, bereiding van metafase cel smeersels, en daaropvolgende detectie van straling veroorzaakte stabiele chromosomale afwijkingen door mFISH en SKY-technieken. Chromosoom painting gebruik van deze technieken kunnen worden gebruikt voor het detecteren en het risico op verschillende pathofysiologische omstandigheden te beoordelen.

Figuur 1 toont representatieve metafase cel verspreidt bij normale en afwijkende muis chromosoomparen-1, -2 en -3. Figuur 2 toont spectrale karyotypering van normale en abnormale muis metafasechromosomen.Deze resultaten tonen aan dat ioniserende straling induceert inter-chromosomale stabiel verloop in het prolifererende murine beenmergcellen, die voornamelijk bestaat uit stamcellen en cellen die verantwoordelijk zijn voor zelfvernieuwing en differentiatie in diverse celtypen. Cytogenetische veranderingen in stamcellen en voorlopercellen bleken te associëren met verschillende klinische aandoeningen, zoals kanker, en worden beschouwd als de sterkste voorspellers van ziekte ernst en de totale overleving. Daarom is het logisch te concluderen dat ioniserende straling geïnduceerde stabiele inter-chromosomale afwijkingen verhoogd risico op kankerontwikkeling kan veroorzaken.

Figuur 1
Figuur 1: Het effect van de straling op de beenmergcellen van een bestraald Mouse als gedetecteerd door mFISH. A en B tonen een muis metafase cel spreiding met normale paren van chromosome-1 (rood), chromosoom-2 (groen) en chromosoom-3 (aqua). Alle andere chromosomen worden tegengekleurd met DAPI (blauw). C toont stabiele aberratie waarbij chromosoom-1 is een deel van chromosoom-1 geïntegreerd in een ongelakte (DAPI) chromosoom, terwijl een ander deel een acentrisch fragment gevormd. D toont een deel van een deel van chromosoom-2 is geïntegreerd in ongelakte chromosoom. E staat voor stabiele aberratie waarbij chromosoom-3. F toont een stabiele aberratie waarbij alle drie geschilderde chromosomen. Breekpunten en kleur knooppunten zijn aangegeven met pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Effect van straling op Bone Marrow Cellen van bestraalde Mouse als gedetecteerd door SKY. Het bovenste paneel toont een normale spectrale karyotypering (SKY) van C57BL / 6 vrouwtjes. Het middelste paneel toont een stabiel aberratie waarbij chromosoom-4 en chromosoom-12. Het onderste paneel toont muis spectrale karyotypering met een stabiele chromosomale afwijking waarbij chromosoom-7 en chromosoom-10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Verschillende kritische stappen bepalen het succes van mFISH en SKY. De eerste en meest kritische stap is het colchicine behandeling in vivo mitose van het beenmerg mononucleaire cellen te optimaliseren. De colchicine concentratie en de duur van de behandeling individueel of in onderling overleg bepalen de mitotische index evenals chromosoom condensatie-twee belangrijke voorwaarden voor een effectieve chromosoom schilderij. Een hoge concentratie colchicine of langere behandeltijd leidt tot zeer gecondenseerde chromosomen onverenigbaar voor goede denaturatie en hybridisatie. Bovendien, nauwkeurige identificatie van complexe herschikkingen in een metafase cel verspreid met gecondenseerde chromosomen is geen gemakkelijke taak te bereiken. Intraperitoneale toediening van 100 pl 0,05% colchicine gedurende 2 h in een muis met een lichaamsgewicht tussen 22 en 26 g produceert een voldoende aantal metafase cel smeersels matig gecondenseerde chromosomen. De tweede belangrijke stap is de hypotone behandeling.Het volume, behandelingstijd en temperatuur van de hypotone oplossing invloed chromosoom morfologie en spreiding van chromosomen op de glasplaatje. Een hypotone behandeling voor een kortere periode of op een sub-optimale temperatuur kan de juiste chromosoom verspreiding te voorkomen, wat resulteert in metafase cel verdeeld met overlappende chromosomen. Chromosoom overlapping interfereert met de downstream in situ hybridisatie proces, de specificiteit van fluorescerende signalen, en de juiste identificatie van de herschikkingen.

Ten derde, de post-hypotoon fixatie is een belangrijke stap naar cel klont vorming te voorkomen. Het fixeermiddel moet langzaam langs de zijkant van de centrifugebuis onder constant voorzichtig schudden om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen. Anders zal metafase cel spreads opgesloten in de bosjes te worden en het verspreiden van chromosoom wordt aangetast. Echter chromosoom uitspreiden ook afhankelijk van het celtype, temperatuur en relatieve vochtigheid bij de time van het schrappen van de celsuspensie op glas dia's. Een eerdere studie van Spurbeck gemeld dat lymfocyten, een 60% relatieve luchtvochtigheid en 20 ° C temperatuur leiden tot hogere metafase gebied 18. Bovendien, de duur van het drogen is een kritieke stap voor optimale chromosoom verspreiden. Metaphase cel verspreidt dat droog te snel te produceren kleine spreads met vele overlappende chromosomen, terwijl zeer langzaam drogen resulteert in gebroken metafase chromosoom 18. Echter, Deng toonde dat chromosoom verspreiding primair afhankelijk relatieve vochtigheid allerlei gekweekte cellen 19. De vierde belangrijke stap is chromosoom denaturatie te optimaliseren. Een langere en kortere denaturatietijd afbreuk probe hybridisatie. Langere denaturatie veroorzaakt "gezwollen" chromosomen, terwijl kortere denaturatie interactie probe aan de chromosomen belemmert. Een andere manier om chromosoom "wallen" verminderen is leeftijd slides nacht bij kamertemperatuurvoorgrond denaturatiestap. Slides niet voor chromosoom schilderen onmiddellijk kan onbeperkt worden opgeslagen in een exsiccator bij -20 ° C. Chromosoom denaturatietijd moet worden geijkt de schuif leeftijd, het cytoplasma rond de metafase cel spreads en de vochtigheid waarop cellen werden neergezet op de glijbanen. Probe denaturatie en hybridisatie is ook belangrijk voor een succesvolle chromosoom schilderen. Directe blootstelling van probes aan fel licht moet worden vermeden, zodat fluorescentiesignaal signaalintensiteit niet verliest.

Het is goed vast te staan ​​dat mFISH en SKY zijn krachtige technieken voor het opsporen van inter-chromosomale afwijkingen stabiel. Elke omleggingen alsmede verlies of winst van geschilderde chromosomen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door deze twee werkwijzen. Echter, detectie van intra-arm en inter-chromosomale arm uitwisselingen zijn niet mogelijk deze technieken. Identificatie van de intra-arm en inter-arm chromosomale uitwisselingen zijn nu mogelijk geworden becagebruik van de ontwikkeling van respectievelijk chromosoom arm specifieke multicolor FISH probes en mBAND FISH probes. Een eerdere studie op de voormalige nucleaire werknemers heeft aangetoond dat mBAND analyse is een krachtig hulpmiddel om unieke handtekeningen van stralingsschade 20 identificeren. Bovendien identificatie van zuster chromatide uitwisseling, karakteristiek voor stralingsschade 21, niet mogelijk is deze technieken. Bovendien, zowel mFISH en SKY beperkte vermogen om het centromere gebied van chromosomen, hetgeen kan leiden tot onjuiste scoring van de dicentrische chromosoom translocatie als verf. De technieken zijn ook niet geschikt om de precieze lokalisatie van translocatie breekpunt. Bovendien fluorescentiesignalen kunnen niet permanent bewaard, signaalintensiteit afneemt met de tijd, en fluorescentie chromosoom schilderen is niet geschikt voor analyse door een geautomatiseerd systeem. Echter, fluorescent signaalintensiteit behouden gedurende langere tijd door het opslaan geschovenes in de vriezer.

Twee verbeterde werkwijzen voor chromosoom schilderen ontwikkeld om de beperkingen van mFISH en SKY overwonnen respectievelijk niet-fluorescerende schilderen chromosoom 22 en spectrale kleur banding (SCAN) 23. De voordelen van niet-fluorescerende chromosoom schilderij met behulp van de peroxidase / diaminobenzidine (DAB) over FISH schilderij ook accurate identificatie van de centromere gebied, de identificatie van chromosomale omlegging door bright-field microscoop, en dat niet-fluorescerend signaal wordt permanent bewaard en beeldanalyse kan geautomatiseerd. Anderzijds, de SCAN is voordelig omdat dan SKY SCAN probes bereid uit bandspecifieke genomische DNA-sequenties voor een specifiek chromosoom en dus nauwkeurig kan de oorsprong van een chromosoom-band identificeren. SCAN vergemakkelijkt ook de identificatie van de intra-chromosomale beurzen. Gezien de voordelen van de verbeterde technieken, moeten deze worden beschouwd voor routinegebruik in klinische cytogenetische testen. Echter, het opstellen van probes uit de band-specifieke genomische DNA-sequentie voor elk chromosoom paren is technisch uitdagend en beperkt het gebruik ervan in de moleculaire cytogenetica.

Het bepalen of het verschil tussen de behandelingsgroepen statistisch significant of niet is een ander belangrijk aspect van moleculaire cytogenetica. Scoren criteria, zoals het aantal metafase cel verspreidt geteld, het aantal gebruikte dieren per behandelingsgroep, aantal chromosomen per metafase cel verspreid tijdens de analyse, nomenclatuur gebruikt om afwijkingen te classificeren waargenomen na chromosoom schilderen, etc. spelen een cruciale rol bij het bepalen van de statistische onzekerheid tussen de behandelingsgroepen. Hoewel verschillende laboratoria farmaceutische scorecriteria, scoren van 100 tot 300 en 20 metafase cel smeersels 40 goed gescheiden chromosomen in ten minste 3-5 muizen wordt aanbevolen voor het bepalen van de statistische significantie in mFISH en SKY analetion, respectievelijk 24, 25. Voorts is de keuze van de gebruikte nomenclatuur aberraties classificeren geschilderd chromosomen is een belangrijke parameter voor de beoordeling van statistische onzekerheid. Er zijn twee populaire nomenclatuur systemen gebruikt om afwijkingen gedetecteerd door heel chromosoom kleurende probes beschreven: (1) S & S classificatiemethode van Savage en Simpson 26, 27 en (2) PAINT nomenclatuur van Tucker et al. 28. Elk systeem berust op verschillende vereisten voor de indeling van structurele chromosoomafwijkingen en heeft zijn eigen voordelen en nadelen. De S & S-systeem is vooral geschikt voor mechanistische interpretatie van aberratie oorsprong, terwijl PAINT een beschrijving van abnormale painting patronen. Onderzoeken van Knehr et al. op stralingsgeïnduceerde chromosoomafwijkingen in FISH geschilderd chromosomen duiden dat de verf werkwijze, zoals de S & S-systeem kan ook worden gebruikt om aberratie oorsprong met enige gewijzigd engineering bepalende in de scorecriteria en zouden bruikbaar zijn voor praktische toepassing 29 zijn.

Zowel mFISH en SKY methoden hebben hun eigen beperkingen. Bijvoorbeeld mFISH maakt snelle noteren met weinig training, echter niet screenen alle chromosomen voor het meten van aberratie frequentie en onthult slechts gedeeltelijk aberratie frequentie, afhankelijk van het aantal chromosomen geschilderde gebruikt in de studie. Echter, een fractie van de totale uitwisseling waargenomen door heel chromosoom schilderen worden geschat door de formule oorspronkelijk gepostuleerd door Lucas et al. 30 en verder gemodificeerd door Braselmann et al. 31. Deze wiskundige formule beschouwt uitwisseling tussen geschilderd chromosomen en tussen geschilderd en tegengekleurd chromosomen. Bijvoorbeeld, zij f p de fractionele som van het genoom onder de geschilderde chromosomen 1 (f 1), 2 (2 f) en 3 (f 3), where f 1 = 0,0696, f 2 = 0,0649 en f 3 = 0,0570, de waarden vertegenwoordigen de genomische inhoud van individuele chromosomen in vrouwelijke muizen. Daarom f p = (f 1 + f 2 + f 3) = 0,192 en tegengekleurd fractie wordt (1 - f p) = 0,808. De frequentie van de uitwisselingen van geschilderd en tegengekleurd chromosomen (F P) kan eenvoudig worden berekend door het kruis product van de binomiale expansie (p + q) 2 = p 2 + 2pq + q 2, waarbij p = f p en q = (1 - f p). Aldus Fp = 2pq = 2f p (1 - fp) = 0,310, waardoor 31% van chromosomale uitwisselingen waarneembaar na schilderen muischromosoom-1, -2 en -3. Daarom moet 1 / 0,31 = 3,23 cellen worden gescoord op een gestreepte metafasecellen of een hele genoom-equivalent gelijk. Bovendien, zowel mFISH en Sky hebben een beperkte capaciteit om SPECIFmatisch bepalen welke genen en breekpunten betrokken zijn bij de vorming aberratie en ook kleine duplicaties, inversies en deleties te detecteren.

De toepassing van mFISH en SKY analyse is niet beperkt tot fundamenteel onderzoek. Beide worden regelmatig gebruikt in klinische studies. Deze technieken zijn ook toegepast op prenatale en postnatale diagnose, risico-evaluatie, en de identificatie van de verschillende vormen van kanker. Bovendien kunnen beide technieken worden gebruikt om interfase chromosomen schilderen. Sokolova gebruikt mFISH om interfase chromosomen te schilderen voor de eerste keer 32. Deze technieken worden ook gebruikt voor post-bestraling inschatting dosis en de risicobeoordeling bij de mens na het al dan niet opzettelijke blootstelling aan ioniserende straling 11, 33. Daarom, gedeeltelijke of gehele genoom analyse door mFISH of SKY, respectievelijk, zijn handige tools om inter-chromosomale afwijkingen te detecteren stabiele voor de verschillende studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door Arkansas Space Grant Consortium en het National Space Biomedical Research Instituut met behulp van National Aeronautics and Space Administration, verleent NNX15AK32A (RP) en RE03701 (MH-J), en P20 GM109005 (MH-J), en de Amerikaanse Veterans Administration ( MH-J). Wij danken Christopher Fettes, Program Coordinator voor het Ministerie van Milieu en Occupational Health aan de Universiteit van Arkansas voor Medische Wetenschappen, voor redactionele ondersteuning bij de voorbereiding van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691 (2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).
Detectie van Inter-chromosomale Stable aberraties door Multiple Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (mFISH) en Spectral Karyotypering (SKY) in bestraalde muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter