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Genetics

Détection de Inter-chromosomiques Aberrations Stable par Fluorescence Multiple doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

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Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole animal a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales. Tous les animaux ont été logés dans l'animalerie climatisée standard à 20 ± 2 ° C avec 10 - 15 cycles horaires de l'air frais et l'accès libre à la nourriture standard pour rongeurs et de l'eau. À l'arrivée, les souris ont été mis en quarantaine pendant 1 semaine et à condition de rongeur certifié chow.

1.Radiation exposition et in vivo Arrestation de cellules métaphase

  1. souris Exposer non anesthésié à 2 Gy rayonnement du corps entier dans une chambre d'irradiation. Pendant l'irradiation, placer la souris dans une chambre de maintien bien ventilé pour assurer qu'ils ne se déplacent pas librement et reçoivent une dose uniforme.
  2. Injecter 100 ul de solution à 0,05% de colchicine (cpoudre olchicine dissous en calcium et en magnésium libre PBS) par voie intrapéritonéale en utilisant une aiguille 25 G attaché avec 1 ml seringue jetable. Éviter l'injection directement dans un organe quelconque.
  3. Laisser l'animal dans la cage pendant 2 h avant la récolte des cellules de moelle osseuse. Observez l'animal pour tout signe de douleur ou de détresse.

2. moelle osseuse de cellules Récolte et isolement de cellules de moelle osseuse mononucléaires par gradient de densité Centrifugation

  1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO2.
  2. Vaporiser éthanol à 70% sur la dorsale et la face ventrale.
  3. Faire une incision de 2 cm sur la peau abdominale avec des ciseaux pointus. Attrapez la peau de chaque côté de l'incision avec des pinces émoussées et tirez doucement ouvrir les muscles abdominaux.
  4. Coupez les deux pattes de derrière avec des ciseaux et les placer immédiatement dans le pré-réfrigéré PBS avec 4% de FBS.
  5. Nettoyer soigneusement tous les muscles attachés à la patte arrière avec une lame de rasoir et de la gaze de coton bandage pointu.
  6. Séparer le tibia du fémur. Coupez les deux extrémités de chaque os avec une lame de rasoir.
  7. Vider le contenu de la moelle osseuse avec 3 ml de PBS (avec 4% de FBS) à l'aide d'une aiguille 23 G attachée à une seringue de 3 ml et de recueillir le contenu dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Faire passer la suspension de cellules au moins 10 fois à travers l'aiguille pour faire une suspension de cellules isolées.
  8. superposer soigneusement la suspension cellulaire sur un volume égal de milieu de séparation de lymphocytes (3 mL), sans perturber l'interface entre la suspension cellulaire et du milieu de séparation des lymphocytes. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante.
  9. Recueillir soigneusement la couche leucocytaire sans déranger les autres couches et le transfert dans un nouveau tube de 15 ml centrifugeuse.

3. Préparation de métaphase Spreads cellulaires

  1. Ajouter 10 ml de PBS dans le tube contenant la couche leucocytaire.
  2. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
  3. Retirez délicatement le surnageant. Puis briser til culot cellulaire avec tapotant doucement et ajouter 10 ml de PBS.
  4. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
  5. Retirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire, briser le culot, et ajouter 4 ml de pré-chauffé hypotonique solution de chlorure de 0,075 M de potassium. Ajouter hypotonique goutte de solution à goutte avec une agitation constante douce.
  6. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C dans un bain d'eau.
  7. Après traitement hypotonique, ajouter un volume égal (4 ml) de fixateur (méthanol: acide acétique glacial, 3: 1 v / v) dans le tube de 15 ml et mélanger doucement en inversant le tube.
  8. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant.
  9. Brisez le culot cellulaire avec taraudage suivi par vortex doux pendant quelques secondes et ajouter 3 ml de goutte de solution fixatif à goutte avec une agitation constante.
  10. Incuber pendant 30 min à température ambiante, puis centrifuger à 400 g pendant 5 min.
  11. Retirer le surnageant, briser le culot cellulaire avec gentle taraudage, et ajoutez 3 mL fixateur frais.
  12. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, et retirer le surnageant. Brisez le culot cellulaire avec tapotant doucement et ajouter 3 mL frais fixateur.
  13. Répétez l'étape 3.12 deux fois de plus.
  14. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, et retirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Puis ajouter 400 à 600 pi fixateur et bien mélanger avec pipetage.
  15. Déposer 30 ul des cellules fixées sur des lames pré-nettoyés et humides inclinés à un angle de 45 ° et laisser les lames sécher à l'air complètement du jour au lendemain.

4. Souris Chromosome Peinture par mFISH

  1. chromosome dénaturation
    1. Placez la diapositive contenant les écarts de cellules métaphase dans 2x SSC pendant 2 min à température ambiante.
    2. Déshydrater le coulisseau par lavage en série d'éthanol pendant 2 minutes chacune dans 70%, 80% et 100%. Incuber pendant 60 min à 65 ° C.
    3. Préchauffer la solution de dénaturation à 40 mL (70% de formamide / 2x SSC; pH 7,0) à 70 ° C (± 2 ° C) dans un bocal de Coplin en verre pendant 30 min. Dénaturer chromosomes en incubant la diapositive dans une solution de dénaturation préchauffé pendant 1 à 1,5 min.
    4. Quench glisser immédiatement dans de la glace-froid à 70% d'éthanol pendant 2 min pour arrêter le processus de dénaturation ainsi que pour prévenir les chromosomes dénaturés de re-recuit. Déshydrater alors par lavage à l'éthanol à 80% pendant 2 min. Répétez le lavage à l'éthanol avec 100% d'éthanol pendant 2 min. Complètement sécher la lame à la température ambiante.
  2. Dénaturation et Hybridation de la sonde Mélange
    1. Centrifuger brièvement le mélange de sonde fournie par le fabricant, transférer 10 pi de mélange de la sonde dans un 500 pi enfichable tube de centrifugeuse à bouchon, et dénaturés par incubation à 80 ° C (± 2 ° C) dans un bain d'eau pendant 7 min.
    2. Placer le tube de centrifugeuse avec le mélange de sonde dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 min.
    3. Appliquer le mélange de sonde dénaturée sur la lame avec chromoso dénaturémes.
    4. couvrir soigneusement la zone avec un 18 mm x 18 mm couvercle en verre de glissement et d'éliminer les bulles d'air visibles en appuyant très doucement la lamelle à glisser. Sceller les quatre côtés de la lamelle avec du ciment en caoutchouc et incuber pendant 12 h à 16 h dans l'obscurité à 37 ° C dans une chambre humidifiée pour l'hybridation.
  3. Poster Hybridation laver et détection
    1. Retirez délicatement le ciment de caoutchouc et la lamelle.
    2. Placer la lame dans préchauffée 0,4x SSC à 74 ° C (± 2 ° C) pendant 5 min.
    3. Laver la lame dans une solution de lavage II (4x SSC / 0,1% de Tween 20) pendant 2 min.
    4. Placer 20 ul d'anti-fade milieu de montage avec DAPI de contraste (1,5 pg / ml) et couvrir avec une lamelle de verre. Appuyez doucement sur la lamelle avec le tissu de laboratoire pour éliminer les bulles d'air et de la solution de montage en excès. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles.
    5. Voir diapositives à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés.

    5. Spectral caryotype (SKY) de Chromosomes souris

    1. Chromosome et Probe Dénaturation
      1. Equilibrer diapositive dans 2x SSC à température ambiante pendant 2 minutes, sans agitation.
      2. Déshydrater coulissent dans une série d'éthanol (70%, 80% et 100% d'éthanol) pendant 2 minutes à chaque fois à la température ambiante. Air-sécher la lame pour éliminer l'éthanol complètement.
      3. Chauffer la solution 40 ml de dénaturation (70% de formamide / 2 x SSC; pH 7,0) dans un bocal de Coplin en verre pendant 30 min.
      4. Incuber slide en solution de dénaturation pré-chauffé pour 1 à 1,5 min.
      5. immerger immédiatement la lame dans la glace froide éthanol à 70% pendant 2 min pour arrêter le processus de dénaturation ainsi que pour prévenir les chromosomes dénaturés de re-recuit.
      6. Déshydrater la lame en le plaçant dans 80% d'éthanol pendant 2 minutes, puis dans l'éthanol à 100% pendant 2 min à température ambiante.
      7. Dénaturer la sonde SKY (flacon n ° 1 fourni par le fabricant) dans un bain d'eau réglé à 80 ° C (± 2 ° C)pendant 7 min, puis placer immédiatement dans un bain d'eau différente réglé à 37 ° C pendant 10 min.
    2. sonde hybridation
      1. Ajouter 10 pi de sonde de SKY dénaturée sur les chromosomes dénaturés.
      2. Placez délicatement un 18 mm x 18 mm lamelle de verre sur la sonde de SKY sorte que les bulles d'air sont piégés sous la lamelle.
      3. Sceller les bords de la lamelle couvre-objet avec du ciment de caoutchouc.
      4. Placer la lame dans une chambre étanche à la lumière humidifié et incuber dans l'obscurité à 37 ° C pendant 24 h à 36 h.
    3. Post-hybridation de lavage et de détection Fluorescence
      1. Retirer la colle de caoutchouc très soigneusement sans perturber la lamelle.
      2. Placer la lame dans préchauffée solution de lavage rapide (0.4x SSC) à 72 ° C (± 2 ° C) pendant 5 min avec une agitation constante. Immergez glisser dans la solution de lavage III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) et incuber pendant 1 min en agitant.
      3. Facultatif: Ajouter 80 pi de réactif de blocage(Flacon n ° 2 fourni par le fabricant) sur la zone d'hybridation, placer un 24 mm x 60 mm lamelle couvre-objet en plastique et incuber dans l'obscurité à 37 ° C pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée.
      4. Retirez délicatement la lamelle en plastique et laver la lame avec préchauffé (45 ° C) une solution de lavage III pendant 5 min.
      5. Appliquer 80 pi de réactif de coloration Cy5 (flacon n ° 3 fourni par le fabricant), placer un 24 mm x 60 mm lamelle couvre-objet en plastique et incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 40 minutes dans une chambre humidifiée.
      6. Plonger la lame dans un bocal de Coplin en verre contenant préchauffé (45 ° C) solution de lavage III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) et incuber à 45 ° C dans un bain d'eau pendant 2 min avec agitation. Répéter cette opération de lavage 3 fois.
      7. Appliquer 80 pi de réactif de coloration Cy5.5 (flacon n ° 4 fourni par le fabricant), placer un 24 mm x 60 mm lamelle couvre-objet en plastique et incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 40 minutes dans une chambre humidifiée.
      8. Laver la lame 3 fois avec préchauffé (45 ºC) solution de lavage III.
      9. Maintenez la lame dans une position inclinée contre une serviette en papier pour drainer l'excès de liquide. Ajouter 20 ul anti-fade réactif DAPI (flacon n ° 5 fourni par le fabricant) et placer soigneusement un 24 mm x 60 mm lamelle de verre sans introduire de bulles d'air. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles et d'observer avec un microscope à épifluorescence équipé pour capturer des images SKY.

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Representative Results

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irradiation totale du corps induit de nombreuses aberrations chromosomiques dans les cellules de moelle osseuse de souris irradiées. Le protocole actuel est optimisé pour in vivo arrêt de la mitose des cellules de la moelle osseuse après une exposition à un rayonnement, la récolte des cellules de moelle osseuse à partir des pattes postérieures de souris irradiées, l' isolement des cellules mononucléées de la moelle osseuse par gradient de densité de centrifugation, la préparation des pâtes à tartiner de cellules en métaphase, et à la suite détection de radio-induits stables aberrations chromosomiques par des techniques MFish et SKY. peinture Chromosome utilisant ces techniques peuvent être utilisées pour détecter et évaluer le risque de diverses conditions physiopathologiques.

La figure 1 montre les cellules métaphase représentant se propage avec des paires-1 normaux et aberrants chromosomiques de la souris, -2 et -3. La figure 2 représente le caryotype spectrale des chromosomes métaphasiques de souris normales et anormales.Ces résultats montrent que les rayonnements ionisants induit entre les aberrations chromosomiques stables dans les cellules murines de moelle osseuse proliférantes, qui est principalement composé de cellules souches et progénitrices qui sont responsables de l'auto-renouvellement et de différenciation en divers types de cellules. altérations cytogénétiques dans les cellules souches et progénitrices ont été montrés à associer à diverses maladies cliniques, y compris le cancer, et sont considérés comme les meilleurs prédicteurs de la gravité de la maladie et la survie globale. Par conséquent, il est logique d'en déduire que ionisant stables aberrations inter-chromosomiques induites par les rayonnements peut entraîner un risque accru de développement du cancer.

Figure 1
Figure 1: Effet des radiations sur les cellules de moelle osseuse d'une souris irradiées comme détecté par mFISH. A et B montrent une propagation de cellules de métaphase de la souris avec des paires normales de chromosome-1 (rouge), le chromosome 2 (vert) et du chromosome 3 (eau). Tous les autres chromosomes sont DAPI (bleu). C montre aberration stable impliquant le chromosome 1, une partie du chromosome 1 a été intégré dans un (DAPI) chromosome non-peint, tandis qu'une autre partie a formé un fragment acentrique. D représente une partie d'une partie du chromosome 2 a été intégré dans le chromosome non peint. E représente une aberration stable impliquant le chromosome 3. F montre une aberration stable impliquant tous les trois chromosomes peints. Points de rupture et les jonctions de couleur sont indiquées par des flèches. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: effet du rayonnement sur l' os MarrCellules ow de souris irradiées comme détecté par SKY. Le panneau supérieur montre un caryotype spectral normal (SKY) de souris C57BL / 6 femelles. Le panneau du milieu montre une aberration stable impliquant le chromosome 4 et du chromosome 12. Le panneau inférieur montre caryotype spectral de la souris avec une aberration chromosomique stable impliquant le chromosome 7 et du chromosome 10. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Plusieurs étapes essentielles déterminent le succès de mFISH et SKY. La première et la plus importante étape consiste à optimiser le traitement à la colchicine pour in vivo arrêt de la mitose des cellules mononucléaires de moelle osseuse. La concentration et le traitement colchicine temps individuellement ou de concert déterminer l'index mitotique, ainsi que la condensation des chromosomes, deux conditions préalables importantes pour la peinture chromosomique efficace. Une concentration élevée colchicine ou rallonger le temps de traitement conduit à des chromosomes hautement condensés, incompatibles pour la dénaturation et l'hybridation appropriée. De plus, l'identification précise des réarrangements complexes dans une cellule de métaphase se propager avec des chromosomes condensés est pas une tâche facile à réaliser. L'administration intra-péritonéale de 100 pi de 0,05% colchicine pendant 2 h dans une souris avec un poids corporel compris entre 22 et 26 g produit un nombre suffisant de cellules métaphase se propage avec des chromosomes modérément condensés. La deuxième étape critique est le traitement hypotonique.Le volume, la durée du traitement et de la température de la solution hypotonique influence la morphologie des chromosomes et la propagation des chromosomes sur la lame de verre. Un traitement hypotonique pendant un laps de temps plus court ou à une température sous-optimale peut empêcher le chromosome approprié d'étalement, ce qui entraîne les cellules avec des chromosomes en métaphase, réparties chevauchantes. Chromosome chevauchement interfère avec l'aval procédé in situ d'hybridation, la spécificité des signaux fluorescents, et une bonne identification des réarrangements dans.

En troisième lieu, la fixation post-hypotonique est une étape importante pour éviter la formation d'amas de cellules. Le fixateur doit être ajouté lentement sur le côté du tube de centrifugeuse avec une constante agitation douce pour obtenir une suspension cellulaire unique. Sinon, les écarts de cellules métaphasiques seront piégés dans les touffes et le chromosome propagation sera compromise. Cependant, un chromosome d'étalement dépend également du type de cellules, la température et l'humidité relative à l'instant temps de laisser tomber la suspension de cellules sur des lames de verre. Une étude précédente de Spurbeck rapporté que pour les lymphocytes, une humidité relative de 60% et un résultat de température en C 20 ° dans la zone plus élevée de 18 métaphase. En outre, la durée de séchage est une étape critique pour le chromosome optimal d'étalement. Cellulaire Metaphase se répand que sèche trop rapidement produire des spreads serrés avec de nombreux chromosomes qui se chevauchent, tandis que les résultats de séchage très lent en métaphase brisé les chromosomes 18. Cependant, Deng a montré que le chromosome d' étalement dépend principalement de l' humidité relative pour une variété de 19 cellules mises en culture. La quatrième étape importante est d'optimiser le chromosome du temps de dénaturation. Un temps de dénaturation plus longue et plus courte affecte négativement la sonde d'hybridation. dénaturation provoque plus les chromosomes "bouffi", tandis que la dénaturation plus courte empêche l'interaction de la sonde aux chromosomes. Une autre façon de réduire le chromosome "bouffissure" est de diapositives d'âge pendant la nuit à la température ambiante soitétape de dénaturation avant. Diapositives ne sont pas utilisées pour la peinture chromosomique immédiatement, peuvent être stockés indéfiniment dans un dessicateur à -20 ° C. temps Chromosome de dénaturation doit être normalisée avec l'âge de la diapositive, la quantité de cytoplasme autour des spreads de cellules métaphase, et l'humidité à laquelle les cellules ont été abandonnées sur les lames. la dénaturation de la sonde et l'hybridation est également importante pour la peinture chromosomique réussie. L'exposition directe de sondes à lumière doit être évitée, de sorte que le signal fluorescent ne perd pas l'intensité du signal.

Il est bien établi que mFISH et SKY sont des techniques puissantes de détection inter-aberrations chromosomiques stables. Les réarrangements ainsi que la perte ou le gain de chromosomes peints peuvent être facilement identifiés par ces deux méthodes. Cependant, la détection des intra-bras et inter-bras échanges chromosomiques ne sont pas possibles par ces techniques. Identification des intra-bras et inter-bras échanges chromosomiques ont désormais possible becautilisation du développement de, respectivement, chromosomiques sondes FISH multicolore spécifiques bras et sondes FISH mBAND. Une étude antérieure sur les anciens travailleurs du nucléaire a montré que l' analyse mBAND est un outil puissant pour identifier les signatures uniques de dégâts d'irradiation 20. En outre, l' identification des échanges de chromatides sœurs, une caractéristique des dégâts d'irradiation 21, est pas possible par ces techniques. En outre, à la fois mFISH et SKY ont la capacité de peindre la région centromérique des chromosomes, ce qui peut entraîner la notation erronée du chromosome dicentriques comme translocation limitée. Les techniques sont également pas adapté pour identifier la localisation exacte du point d'arrêt translocation. En outre, les signaux de fluorescence ne peuvent pas être conservés en permanence, l'intensité du signal diminue avec le temps, et la peinture chromosomique fluorescente ne convient pas pour une analyse par un système automatisé. Cependant, l'intensité du signal fluorescent peut être conservé pendant une longue période de temps en stockant coulissées dans le congélateur.

Deux méthodes améliorées de peinture chromosomique ont été développés pour surmonter les limitations de mFISH et SKY: respectivement, peinture chromosomique non fluorescent 22 et la couleur spectrale baguage (SCAN) 23. Les avantages de la peinture chromosomique non fluorescent en utilisant la peroxydase / diaminobenzidine (DAB) sur la peinture FISH comprennent l'identification précise de la région centromérique, identification de réarrangement chromosomique par champ lumineux microscope, et que le signal non fluorescent est conservé en permanence et l'analyse d'image peut automatiser. D'autre part, le SCAN est avantageux sur SKY parce que les sondes SCAN sont préparées à partir de séquences d'ADN génomique spécifique à la bande pour un chromosome spécifique et donc, peuvent identifier avec précision l'origine d'un chromosome de la bande. SCAN facilite également l'identification des échanges intra-chromosomiques. Considérant les avantages des techniques améliorées, celles-ci doivent être considérés pour une utilisation de routine itest cytogénétique n clinique. Cependant, la préparation de sondes de la séquence d'ADN génomique spécifique bande pour chaque chromosome paires est techniquement difficile et limite son utilisation dans cytogénétique moléculaire.

Pour déterminer si la différence entre les groupes de traitement est statistiquement significatif ou non est un autre aspect important de la cytogénétique moléculaire. Critères de notation, comme le nombre de cellules de métaphase spreads comptés, le nombre d'animaux utilisés par groupe de traitement, le nombre de chromosomes par cellule de métaphase propager lors de l' analyse, la nomenclature utilisée pour classer les aberrations observées après la peinture des chromosomes, etc. jouent un rôle crucial dans la détermination de l'incertitude statistique entre les groupes de traitement. Bien que différents laboratoires ont des critères de notation propriétaires, notation de 100 à 300 et 20 métaphase cellule se propage avec 40 chromosomes bien séparés dans au moins 3 à 5 souris est généralement recommandée pour déterminer la signification statistique dans mFISH et SKY analyse, respectivement 24, 25. Par ailleurs, le choix de la nomenclature utilisée pour classer les aberrations dans les chromosomes peints est un paramètre important pour évaluer statistiquement l'incertitude. Il existe deux systèmes de nomenclature populaires utilisés pour décrire les aberrations détectées par des sondes de peinture chromosomique entiers: (1) S & S méthode de classification par Savage et Simpson 26, 27 et (2) nomenclature PAINT par Tucker et al. 28. Chaque système repose sur différentes conditions préalables pour la classification des aberrations chromosomiques structurelles et a ses propres avantages et inconvénients. Le système S & S est principalement adapté à l'interprétation mécaniste d'origine aberration, tandis PAINT fournit une description des motifs de peinture anormaux. Des études menées par Knehr et al. sur les aberrations chromosomiques induites par les rayonnements dans les poissons peints chromosomes indiquent que la méthode de peinture, comme le système S & S, peut également être utilisé pour déterminer l'origine de l'aberration avec quelques MODIFICATIdans les critères de notation et serait plus utile pour une application pratique 29.

Les deux méthodes MFish et SKY ont leurs propres limites. Par exemple, mFISH permet une cotation rapide avec peu de formation, mais il ne permet pas de dépister tous les chromosomes pour mesurer la fréquence d'aberration et ne révèle que la fréquence d'aberration partielle, en fonction du nombre de chromosomes peints utilisés dans l'étude. Cependant, une fraction des échanges totaux observés par peinture chromosomique entier peut être estimée par la formule initialement postulé par Lucas et al. 30 et en outre modifiés par Braselmann et al. 31. Cette formule mathématique considère l'échange entre les chromosomes peints et entre les chromosomes peints et contre-. Par exemple, soit f p représentent la somme fractionnaire du génome couverte par les chromosomes peints 1 (f 1), 2 (f 2) et 3 (f 3), WHEre f 1 = 0,0696, f 2 = 0,0649, et f 3 = 0,0570, les valeurs représentent le contenu génomique de chromosomes individuels chez les souris femelles. Par conséquent, fp = (f 1 + f 2 + f 3) = 0,192 et de la fraction devient contre - coloration (1 - f p) = 0,808. La fréquence des échanges entre les chromosomes peints et contrecolorées (F P) peut facilement être calculée par le produit croisé de l'expansion binomiale (p + q) 2 = p 2 + 2pq + q 2,p = f p et q = (1 - p f). Ainsi, Fp = 2pq = 2f p (1 - f p) = 0,310, ce qui signifie que 31% des échanges chromosomiques sont observables après peinture souris chromosome 1, -2 et -3. Par conséquent, 1 / 0,31 = 3,23 cellules doivent être marqué pour égaler une cellules métaphasiques bagués ou toute un équivalent génome. En outre, à la fois mFISH et SKY ont capacité à SPECIF limitéeidentifier tiquement quels gènes et points d'arrêt sont impliqués dans la formation d'aberration et aussi pour détecter les petites duplications, inversions, et les suppressions.

L'application de mFISH et de l'analyse de SKY ne se limite pas à la recherche fondamentale. Les deux sont régulièrement utilisées dans les études cliniques. Ces techniques ont également été appliquées à diagnostic prénatal et postnatal, évaluation des risques, et l'identification des différents types de cancer. En outre, les deux techniques peuvent être utilisées pour peindre les chromosomes en interphase. Sokolova utilisé mFISH pour peindre les chromosomes en interphase pour la première fois 32. Ces techniques sont également utilisées pour l' estimation de la dose post-irradiation et l' évaluation des risques chez l' homme après une exposition accidentelle ou intentionnelle à un rayonnement 11, 33 ionisant. Par conséquent, partielle ou totale analyse du génome par mFISH ou SKY, respectivement, sont des outils utiles pour détecter inter-aberrations chromosomiques stables pour différentes études.

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Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par l'Arkansas Espace Grant Consortium et de l'Institut national de recherche spatiale biomédicale par la National Aeronautics and Space Administration, accorde NNX15AK32A (RP) et RE03701 (MH-J), et P20 GM109005 (MH-J), et le US Veterans Administration ( MH-J). Nous remercions Christopher Fettes, coordonnateur du programme pour le ministère de l'environnement et de la santé au travail à l'Université de l'Arkansas pour les sciences médicales, l'assistance éditoriale en préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Détection de Inter-chromosomiques Aberrations Stable par Fluorescence Multiple<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation (mFISH) et Spectral caryotype (SKY) chez des souris irradiées
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Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

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