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Genetics

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

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Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Tier Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Arkansas for Medical Sciences genehmigt. 15 Stundentakt von frischer Luft und den freien Zugang zu Standard-Nagerfutter und Wasser - Alle Tiere wurden mit 10 bei 20 ± 2 ° C unter Standard klimatisierten Tieranlage untergebracht. Bei der Ankunft wurden die Mäuse für 1 Woche in Quarantäne gehalten und zertifiziertes Nagerfutter zur Verfügung gestellt.

1.Radiation Belichtung und In - vivo - Arrest von Metaphasezellen

  1. Expose un-narkotisierten Mäusen 2 Gy Ganzkörperbestrahlung in einer Bestrahlungskammer. Während der Bestrahlung statt Mäuse in einem gut belüfteten Aufnahmekammer sicherstellen, dass sie sich nicht frei bewegen und eine einheitliche Dosis erhalten.
  2. Inject 100 ul von 0,05% Colchicin-Lösung (colchicine Pulver Calcium und Magnesium-freiem PBS gelöst in) intraperitoneal unter Verwendung einer 25 G Nadel befestigt mit 1 ml Einwegspritze. Vermeiden Sie direkte Injektion in jedem Organ.
  3. Lassen Sie das Tier in den Käfig für 2 h vor Knochenmarkzellernte. Beobachten Sie das Tier auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden.

2. Knochenmarkzellernte und Isolierung von Knochenmark mononukleären Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation

  1. Euthanize die Maus durch CO 2 Ersticken.
  2. Spray 70% Ethanol auf der dorsalen und ventralen Seite.
  3. Machen Sie eine 2 cm lange Inzision auf der Bauchhaut mit einer scharfen Schere. Fassen Sie die Haut auf beiden Seiten des Einschnitts mit stumpfen Pinzette und ziehen Sie vorsichtig die Bauchmuskeln zu öffnen.
  4. Schneiden Sie sowohl die Hinterbeine mit einer Schere und sofort legen Sie sie in vorgekühlte PBS mit 4% FBS.
  5. sorgfältig reinigen, alle an den hinteren Gliedmaßen mit einem scharfen Rasierklinge und Baumwolle Mullbinde ansetzenden Muskeln.
  6. Trennen Sie die Tibia vom Femur. Schneiden Sie die beiden Spitzen jedes Knochen mit einer Rasierklinge.
  7. Spülen des Inhalts des Knochenmarks mit 3 ml PBS (mit 4% FBS) unter Verwendung einer 23 G-Nadel an einer 3 ml Spritze und sammeln den Inhalt in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Übergeben Sie die Zellsuspension mindestens 10 Mal durch die Nadel eine Einzelzellsuspension zu machen.
  8. Overlay sorgfältig die Zellsuspension auf einem gleichen Volumen von Lymphozytentrennmedium (3 ml), ohne die Schnittstelle zwischen der Zellsuspension und Lymphozyten-Separationsmedium zu stören. Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei Raumtemperatur.
  9. Sammeln Sie die Leukozytenmanschette vorsichtig, ohne zu stören die anderen Schichten und die Übertragung in einem neuen 15 ml Zentrifugenröhrchen.

3. Herstellung von Metaphase Zelle Aufstriche

  1. 10 mL PBS auf das Rohr die buffy coat enthält.
  2. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Dann brechen ter Pellet mit leichtes Klopfen Zelle und 10 ml PBS hinzufügen.
  4. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Entfernen Sie den Überstand ohne das Zellpellet zu stören, brechen das Pellet auf, und 4 ml vorgewärmten hypotone 0,075 M Kaliumchloridlösung. In hypotone Lösung tropfenweise mit sanften konstantem Schütteln.
  6. Inkubiere Zellen für 20 min bei 37 ° C in einem Wasserbad.
  7. Nach dem hypotonischer Behandlung, ein gleiches Volumen (4 ml) Fixiermittel (Methanol: Eisessig, 3: 1 v / v) vorsichtig in den 15 ml-Röhrchen und mischen Sie den Schlauch durch Umkehren.
  8. Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen.
  9. Brechen Sie das Zellpellet mit von sanften Wirbel für ein paar Sekunden, gefolgt tippen und 3 ml Fixierungslösung tropfenweise mit konstantem Schütteln.
  10. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur und dann bei 400 xg für 5 min zentrifugieren.
  11. Entfernen Sie den Überstand, brechen die Zellpellet mit gent uple tippen und 3 ml frisches Fixiermittel.
  12. Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand. Brechen Sie das Zellpellet mit leichtes Klopfen auf, und fügen Sie frische 3 ml Fixiermittel.
  13. Wiederholen Sie Schritt 3.12 zweimal.
  14. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur und Entfernen von Überstand ohne das Zellpellet zu stören. Dann fügen Sie 400 bis 600 & mgr; l Fixiermittel und gründlich mischen mit Pipettieren.
  15. Drop-30 & mgr; l fixierten Zellen auf vorgereinigte und nassen Rutschen bei einem Winkel von 45 ° geneigt und lassen Sie die Folien an der Luft trocknen über Nacht vollständig.

4. Maus Chromosome Painting von MFISH

  1. Chromosome Denaturierung
    1. Legen Sie die Folie mit der Metaphase Zelle Aufstriche in 2 × SSC für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
    2. Entwässern Sie die Folie durch serielle Ethanol Waschen für jeweils 2 Min in 70%, 80% und 100%. bei 65 ° C für 60 min inkubieren.
    3. Vorheizen 40 ml Denaturierungslösung (70% Formamid / 2x SSC; pH 7,0) auf 70 ° C (± 2 ° C) in einem Glas Coplin jar für 30 min. Denaturieren Chromosomen durch die Folie in vorgewärmten Denaturierungslösung Inkubation mit 1 - 1,5 min.
    4. Quench rutschen sofort in eiskaltem 70% Ethanol für 2 min die Denaturierung als auch zu stoppen, zu verhindern, dass die denaturierten Chromosomen wieder Glühen. Dann Dehydratisieren mit 80% Ethanol für 2 min durch Waschen. Wiederholen des Ethanols Wäsche mit 100% Ethanol für 2 min. vollständig trocknen die Folie bei Raumtemperatur.
  2. Denaturierung und Hybridisierung der Sonde Mischung
    1. Kurz die Sondenmischung vom Hersteller geliefert, Zentrifuge, übertragen 10 & mgr; l Probenmischung in einen 500 & mgr; l Kappe Zentrifugenröhrchen schnappen, und für 7 min bei 80 ° C (± 2 ° C) in einem Wasserbad durch Inkubation denaturieren.
    2. Platzieren Sie die Zentrifugenröhrchen mit Probenmischung in einem Wasserbad bei 37 ° C für 10 min.
    3. Tragen Sie die denaturierte Sonde Mischung auf den Objektträger mit denaturierten chromosomes.
    4. Deckel vorsichtig den Bereich mit einem 18 mm x 18 mm Deckglas und beseitigen alle sichtbaren Luftblasen durch sehr sanft das Deckglas drücken gleiten. Dichten Sie alle vier Seiten des Deckglases mit Gummizement und Inkubation für 12 h bis 16 h im Dunkeln bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer für die Hybridisierung.
  3. Beitrag Hybridization Waschen und Nachweis
    1. Entfernen Sie vorsichtig den Gummizement und das Deckglas.
    2. Ort Schieber in vorgewärmten 0,4x SSC bei 74 ° C (± 2 ° C) für 5 min.
    3. Wasch slide in Waschlösung II (4x SSC / 0,1% Tween-20) für 2 min.
    4. Legen Sie 20 & mgr; l anti-fade Eindeckmedium mit DAPI counterstain (1,5 ug / ml) geben und mit einem Deckglas. Drücken Sie vorsichtig auf Deckglas mit Labor Gewebe, um Luftblasen und überschüssige Montagelösung zu entfernen. Seal die Ränder des Deckglases mit Nagellack.
    5. Blick gleitet ein Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern.

    5. Spektrale Karyotypisierung (SKY) von Maus-Chromosome

    1. Chromosome und Probe Denaturierung
      1. Äquilibrieren Folie in 2x SSC bei Raumtemperatur für 2 Minuten, ohne Schütteln.
      2. Dehydratisieren Folie in einer Ethanolreihe (70%, 80% und 100% Ethanol) für 2 min jeweils bei Raumtemperatur. Der Luft trocknen die Folie, um das Ethanol vollständig zu entfernen.
      3. Warme 40 ml Denaturierungslösung (70% Formamid / 2 × SSC, pH 7,0) in einem Glas Glasküvette 30 min.
      4. Inkubiere Objektträger in vorgewärmten Denaturierungslösung für 1 bis 1,5 min.
      5. Tauchen Sie sofort das Abgleiten in eiskaltem 70% Ethanol für 2 min die Denaturierung als auch zu stoppen, wie auf die denaturierten Chromosomen wieder Glühen verhindern.
      6. Entwässern die Folie, indem sie in 80% Ethanol für 2 min und dann in 100% Ethanol für 2 min bei Raumtemperatur setzt.
      7. Denaturieren die SKY-Sonde (Vial # 1 durch Hersteller mitgeliefert) in einem Wasserbad auf 80 ° C (± 2 ° C)7 min, und legen Sie dann sofort in ein anderes Wasserbad für 10 min auf 37 ° C eingestellt.
    2. Sondenhybridisierung
      1. Fügen Sie 10 ul der denaturierten SKY-Sonde auf die denaturierten Chromosomen.
      2. eine 18 mm x 18 mm Deckglas auf den SKY-Sonde vorsichtig platzieren, so dass keine Luftblasen unter dem Deckglas gefangen sind.
      3. Seal die Ränder des Deckglases mit Gummi-Zement.
      4. Legen Sie die Folie in einer angefeuchteten lichtundurchlässigen Kammer und Inkubation im Dunkeln bei 37 ° C für 24 h bis 36 h.
    3. Post-Hybridisierung Waschen und Fluoreszenzdetektion
      1. Entfernen Sie Gummizement sehr vorsichtig, ohne das Deckglas zu stören.
      2. Legen Sie die Folie in vorgewärmten schnelle Waschlösung (0,4x SSC) bei 72 ° C (± 2 ° C) für 5 min unter konstantem Schütteln. Tauchen Abgleiten in die Waschlösung III (4x SSC / 0,1% Tween 20) und Inkubation für 1 min unter Schütteln.
      3. Optional: Fügen Sie 80 ul Blockingreagenz(Flasche # 2 durch Hersteller mitgeliefert) auf dem Gebiet der Hybridisierung, legen Sie eine 24 mm x 60 mm Kunststoff-Deckglas, und für 30 min in einer feuchten Kammer bei 37 ° C im Dunkeln inkubiert.
      4. Sie vorsichtig die Kunststoffdeckglas entfernen und den Schlitten mit vorgewärmten (45 ° C) Waschlösung III 5 min waschen.
      5. Bewerben 80 ul von Cy5 Färbungsreagens (Fläschchen # 3 durch Hersteller geliefert), legen Sie eine 24 mm x 60 mm Kunststoff-Deckglas, und bei 37 ° C im Dunkeln für 40 min in einer feuchten Kammer.
      6. Tauchen Sie den Schlitten in ein Glas Coplin Gefäß mit vorgewärmten (45 ° C) Waschlösung III (4x SSC / 0,1% Tween 20) und Inkubation bei 45 ° C in einem Wasserbad für 2 Minuten unter Schütteln. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 mal.
      7. Bewerben 80 ul von Cy5.5 Färbungsreagens (Fläschchen # 4 durch Hersteller geliefert), legen Sie eine 24 mm x 60 mm Kunststoff-Deckglas, und bei 37 ° C im Dunkeln für 40 min in einer feuchten Kammer.
      8. Waschen Sie die Schieber 3 mal mit vorgewärmten (45 ºC) Waschlösung III.
      9. Halten Sie die Folie in einer gekippten Position gegen ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit abfließen kann. In 20 & mgr; l anti-fade DAPI-Reagenz (Fläschchen # 5 vom Hersteller geliefert) und legen Sie vorsichtig mit einem 24 mm x 60 mm Deckglas ohne Luftblasen einzuführen. Seal die Ränder des Deckglases mit Nagellack und beobachten mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop für die Erfassung von SKY Bilder ausgestattet.

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Representative Results

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Gesamtkörperbestrahlung induziert zahlreiche Chromosomenaberrationen in den Knochenmarkzellen von bestrahlten Mäusen. Das aktuelle Protokoll wird für die in - vivo - mitotischen Arrest von Knochenmarkzellen nach Strahlenexposition optimiert, Ernte von Knochenmarkszellen von den Hinterbeinen von bestrahlten Mäusen, die Isolierung von Knochenmark mononukleären Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation, die Vorbereitung der Metaphase Zelle ausbreitet, und die anschließende Nachweis von stabilen Chromosomenaberrationen durch MFISH und SKY-Techniken strahleninduzierten. Chromosome painting mit diesen Techniken verwendet werden können, zu erkennen und die Gefahr von verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen zu bewerten.

Abbildung 1 zeigt repräsentative Metaphase Zelle spreizt mit normalen und anomalen Chromosomenpaare Maus-1, -2 und -3. Figur 2 zeigt spektrale Karyotypisierung von normalen und abnormalen Maus Metaphasechromosomen.Diese Ergebnisse zeigen, dass ionisierende Strahlung induziert inter chromosomalen Aberrationen in den stabilen proliferierenden murinen Knochenmarkszellen, die in erster Linie von Stamm- und Vorläuferzellen besteht, die verantwortlich sind für die Selbsterneuerung und Differenzierung in verschiedene Zelltypen. Zytogenetische Veränderungen in Stamm- und Vorläuferzellen wurden mit verschiedenen klinischen Erkrankungen zu assoziieren gezeigt, einschließlich Krebs, und gelten als die stärksten Prädiktoren der Schwere der Erkrankung und das Gesamtüberleben zu sein. Deshalb ist es logisch, zu schließen, dass eine stabile inter chromosomalen Aberrationen strahlungsinduzierte ionisierender verursachen erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Krebs.

Abbildung 1
Abbildung 1: Wirkung der Strahlung auf den Knochenmarkzellen eines Bestrahlte Maus wie von MFISH erkannt. A und B zeigen eine Maus Metaphase Zell - Ausbreitung mit normalen Paaren chromosome-1 (rot), Chromosom-2 (grün) und Chromosom-3 (Aqua). Alle anderen Chromosomen sind mit DAPI (blau) gegengefärbt. C zeigt stabile Aberration denen Chromosom-1, ein Teil von Chromosom-1 wurde in einem nicht lackiert (DAPI) Chromosom integriert worden ist , während ein anderer Teil eine azentrische Fragment gebildet hat. D zeigt einen Teil eines Teils von Chromosom-2 wurde in nicht lackierten Chromosom integriert. E steht für stabile Verirrung Chromosom-3 beteiligt sind . F zeigt eine stabile Verirrung alle drei gemalt Chromosomen beteiligt sind . Bruchstellen und Farbübergänge durch Pfeile gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Wirkung der Strahlung auf die Knochen Marrow Zellen bestrahlter Maus wie von SKY erkannt. Das obere Feld zeigt eine normale spektrale Karyotypisierung (SKY) von C57BL / 6 weiblichen Maus. Das mittlere Feld zeigt eine stabile Verirrung denen Chromosom-4 und Chromosom-12. Das untere Feld zeigt Maus spektraler Karyotypisierung mit einer stabilen Chromosomenaberrationen beteiligt Chromosom-7 und Chromosom-10. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Mehrere wichtige Schritte bestimmen den Erfolg von MFISH und SKY. Der erste und wichtigste Schritt ist es, die Colchicin - Behandlung für in vivo mitotischen Arrest der Knochenmark mononukleäre Zellen zu optimieren. Die Colchicin Konzentration und die Behandlungszeit der mitotischen Index sowie Chromosomenkondensation-zwei wichtige Voraussetzungen für eine effektive chromosome painting einzeln oder gemeinsam bestimmen. Eine hohe Konzentration Colchicin oder längere Behandlungszeit führt zu hoch kondensierter Chromosomen, nicht kompatibel für die ordnungsgemäße Denaturierung und Hybridisierung. Darüber hinaus genaue Identifizierung von komplexen Umlagerungen in einer Metaphase Zelle mit kondensierten Chromosomen verteilt ist keine leichte Aufgabe, zu erreichen. Intraperitoneale Verabreichung von 100 & mgr; l 0,05% Colchicin für 2 h in einer Maus mit einem Körpergewicht zwischen 22 und 26 g erzeugt eine ausreichende Anzahl von Metaphase-Zelle mit mäßig kondensierter Chromosomen ausbreitet. Der zweite entscheidende Schritt ist die hypotone Behandlung.Das Volumen, die Behandlungszeit und die Temperatur der hypotonischen Lösung Einfluss Chromosoms Morphologie und Ausbreitung von Chromosomen auf dem Glasobjektträger. Eine hypotone Behandlung für einen kürzeren Zeitraum oder bei einer suboptimalen Temperatur kann das entsprechende Chromosom verbreiten, was in der Metaphase Zelle mit überlappenden Chromosomen Ausbreitung zu verhindern. Chromosome überlappende stört die stromabwärts in situ Hybridisierungsverfahren, die Spezifität der Fluoreszenzsignale und die korrekte Identifizierung von Umlagerungen.

Drittens ist die Post-hypotone Fixierung ist ein wichtiger Schritt Zelle Klumpenbildung zu vermeiden. Das Fixiermittel sollte mit konstantem leichtem Schütteln zu erhalten, die eine Einzelzellsuspension langsam an der Seite des Zentrifugenröhrchens zugegeben werden. Andernfalls wird der Metaphase Zelle Spreads in den Klumpen eingefangen werden und Chromosomen beeinträchtigt werden verbreitet. Jedoch Chromosom hängt auch vom Zelltyp verbreitet, die Temperatur und die relative Luftfeuchtigkeit am time der Zellsuspension auf Glasobjektträger ablegen. In einer früheren Studie von Spurbeck berichtet , dass für Lymphozyten, eine 60% relativer Luftfeuchtigkeit und 20 ° C Temperatur zu höheren Metaphase Bereich 18. Darüber hinaus ist die Dauer der Trocknung auch ein entscheidender Schritt für die optimale Chromosom ausbreitet. Metaphase Zelle verbreitet , dass trocken zu schnell enge Spreads mit vielen überlappenden Chromosomen erzeugen, während sehr langsame Trocknung in gebrochenem Metaphase 18 Chromosomen. Jedoch zeigte Deng , dass Chromosom primär abhängig von relativen Feuchtigkeit für eine Vielzahl von kultivierten Zellen 19 ausbreitet. Der vierte Schritt ist wichtig Chromosoms Denaturierung Zeit zu optimieren. Eine längere und kürzere Denaturierungszeit negativ Sonde Hybridisierung beeinflussen. Längere Denaturierung verursacht "geschwollen" Chromosomen, während kürzere Denaturierung Wechselwirkung der Sonde zu den Chromosomen verhindert. Ein anderer Weg Chromosom "Puffiness" ist mit dem Alter gleitet über Nacht bei Raumtemperatur zu verringern istVorder Denaturierungsschritt. Folien nicht für Chromosom Malerei sofort verwendet, kann auf unbestimmte Zeit in einem Exsikkator bei -20 ° C gelagert werden. Chromosome Denaturierung Zeit braucht, um mit dem Schieber Alter standardisiert werden, die Menge an Zytoplasma um die Metaphase-Spreads Zelle und der Feuchtigkeit, bei der Zellen auf den Objektträger fallengelassen wurden. Probe Denaturierung und Hybridisierung ist auch wichtig für eine erfolgreiche Chromosom Malerei. Der unmittelbare Einfluss von Sonden auf helles Licht sollte vermieden werden, so dass Fluoreszenzsignal nicht Signalintensität verliert.

Es ist gut etabliert, dass MFISH und SKY sind leistungsfähige Techniken für eine stabile Verirrungen interChromosomen zu erkennen. Alle Umlagerungen sowie Verlust oder Gewinn von lackierten Chromosomen kann leicht durch diese beiden Methoden identifiziert werden. Allerdings Nachweis von intra-Arm und inter Arm chromosomale Austausch sind durch diese Techniken nicht möglich. Identifizierung von intra-Arm und inter Arm chromosomalen Börsen haben nun möglich geworden becaVerwendung der Entwicklung bzw. Chromosomenarm spezifischen Mehrfarben FISH-Sonden und mBAND FISH-Sonden. Eine frühere Studie an ehemaligen Atomarbeiter hat gezeigt , dass mBAND Analyse ist ein mächtiges Werkzeug eindeutige Signaturen von Strahlenschäden 20 zu identifizieren. Außerdem Identifizierung von Schwesterchromatidaustausch, ein charakteristisches Merkmal von Strahlenschäden 21, ist durch diese Techniken nicht möglich. Darüber hinaus sind sowohl MFISH und SKY haben eine begrenzte Fähigkeit, das Zentromer-Region der Chromosomen zu malen, die in fehlerhaften Bonitur der dizentrischen Chromosoms als Translokations führen kann. Die Techniken sind auch nicht geeignet für die genaue Lokalisierung von Unterbrechungs Translokation zu identifizieren. Zusätzlich können Fluoreszenzsignale nicht dauerhaft beibehalten werden, verringert sich die Signalintensität mit der Zeit, und fluoreszierende chromosome painting ist für die Analyse durch ein automatisiertes System nicht geeignet. Jedoch kann Fluoreszenzsignalintensität für einen längeren Zeitraum aufbewahrt werden, durch Speichern glittenes in den Gefrierschrank.

Zwei verbesserte Methoden der Chromosomenfärbung wurden die Grenzen der MFISH und SKY zu überwinden entwickelt: jeweils nicht-fluoreszierenden chromosome painting 22 und spektrale Farbband (SCAN) 23. Die Vorteile von nicht-fluoreszierende Chromosomen Malerei der Peroxidase / Diaminobenzidin (DAB) über FISH Malerei unter Verwendung umfassen eine genaue Identifizierung des Zentromer-Region, die Identifizierung der chromosomalen Umlagerung von Hellfeld-Mikroskop, und das nicht-fluoreszierendes Signal kann dauerhaft erhalten und Bildanalyse automatisiert werden. Auf der anderen Seite ist das SCAN vorteilhaft gegenüber SKY weil SCAN Sonden aus bandspezifischen genomischen DNA-Sequenzen für ein bestimmtes Chromosom, hergestellt werden, und somit kann genau den Ursprung eines Chromosoms Band identifizieren. SCAN erleichtert auch die Identifizierung von intra-chromosomalen Austausch. die Vorteile der verbesserten Techniken der Erwägung, sollten diese für den Routineeinsatz i in Betracht gezogen werdenn klinischen zytogenetische Tests. Jedoch Herstellung von Sonden, die von dem bandspezifischen genomischen DNA-Sequenz für jedes Chromosom Paare ist technisch anspruchsvoll und schränkt seine Verwendung in der molekularen Zytogenetik.

Bestimmen, ob der Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen statistisch signifikant ist oder nicht, ist ein weiterer wichtiger Aspekt der molekularen Zytogenetik. Bewertungskriterien, wie die Anzahl der Metaphase Zelle Spreads gezählt, die Anzahl der Tiere pro Behandlungsgruppe verwendet, Chromosomenzahl pro Metaphase Zelle während der Analyse zu verbreiten, Nomenklatur , Verirrungen nach Chromosom Malerei beobachtet zu klassifizieren usw. eine entscheidende Rolle spielen , um die statistische Unsicherheit bei der Bestimmung zwischen den Behandlungsgruppen. Obwohl verschiedene Laboratorien proprietäre Scoring-Kriterien haben, Scoring von 100 bis 300 und 20 Metaphase Zelle verbreitet mit 40 gut getrennten Chromosomen in mindestens 3 bis 5 Mäuse im Allgemeinen zur Bestimmung statistischer Signifikanz in MFISH und SKY anal empfohlenlyse, jeweils 24, 25. Darüber hinaus verwendet die Wahl der Nomenklatur Verirrungen in gemalt Chromosomen zu klassifizieren ist ein wichtiger Parameter für statistisch Unsicherheit zu bewerten. Es gibt zwei gängige Nomenklatur - Systeme im Einsatz Abbildungsfehler durch ganze Chromosom Malerei Sonden nachgewiesen zu beschreiben: (1) S & S - Klassifikationsverfahren von Savage und Simpson 26, 27 und (2) PAINT Nomenklatur von Tucker et al. 28. Jedes System stützt sich auf unterschiedliche Voraussetzungen für die Einstufung von strukturellen Chromosomenaberrationen und hat seine eigenen Vor- und Nachteile. Der S & S-System ist für mechanistische Interpretation der Verirrung Ursprung in erster Linie geeignet, während PAINT eine Beschreibung der abnormen Malerei Muster zur Verfügung stellt. Studien von Knehr et al. auf strahleninduzierten Chromosomenaberrationen in FISH gemalt Chromosomen zeigen, dass die Methode Paint, wie die S & S-System, kann auch verwendet werden Abbildungsfehler Herkunft mit einigen modificati zu bestimmendie Bewertungskriterien für in und wäre sehr nützlich für die praktische Anwendung 29.

Beide MFISH und SKY Methoden haben ihre eigenen Grenzen. Zum Beispiel erlaubt eine schnelle MFISH scoring mit wenig Ausbildung, jedoch nicht die Chromosomen alle zum Messen Aberration Frequenz ist screenen und zeigt nur eine teilweise Aberration Frequenz, abhängig von der Anzahl der lackierten Chromosomen in der Studie verwendet. Jedoch kann ein Bruchteil der gesamten Austausch von ganzen chromosome painting beobachtet durch die Formel ursprünglich von Lucas et al postuliert geschätzt werden. 30 und weiter durch Braselmann et al modifiziert. 31. Diese mathematische Formel hält den Austausch zwischen gemalt Chromosomen und zwischen gemalt und counterstained Chromosomen. Beispielsweise f p stellen den fraktionierten Summe des Genoms von den lackierten Chromosomen 1 (f 1), 2 (f 2) und 3 (f 3), abgedeckt lassen where f 1 = 0,0696, f 2 = 0,0649, und f 3 = 0,0570, repräsentieren die Werte der genomischen Inhalt einzelner Chromosomen in weiblichen Mäusen. Daher f p = (f 1 + f 2 + f 3) = 0,192 und counterstained Fraktion wird (1 - f p) = 0,808. Die Häufigkeit des Austauschs lackiert und counterstained Chromosomen (F P) betreffend kann leicht durch das Kreuzprodukt der Binomialentwicklung (p + q) 2 = p 2 + 2PQ + q 2 ist , wobei p = f p und q = (1 berechnet werden , - f p). Somit F P = 2PQ = 2f p (1 - f p) = 0,310, was 31% der chromosomalen Austausch bedeutet beobachtbar sind nach dem Lackieren Maus - Chromosom-1, -2 und -3. Daher 1 / 0,31 = 3,23 brauchen Zellen erzielt werden, das entspricht gleich einer gebänderten Metaphase-Zellen oder ein gesamtes Genom. Außerdem können sowohl MFISH und SKY haben eine begrenzte Fähigkeit, SPECIFwelche Gene und Haltepunkte in der Verirrung Bildung matisch identifizieren beteiligt sind und auch kleine Vervielfältigungen, Inversionen und Deletionen zu erkennen.

Die Anwendung von MFISH und SKY-Analyse wird auf die Grundlagenforschung beschränkt. Beide werden regelmäßig in klinischen Studien verwendet wird. Diese Techniken haben sich auch pränatale und postnatale Diagnose, Risikobewertung und Identifikation von verschiedenen Arten von Krebs angewendet. Darüber hinaus können beide Techniken verwendet werden, Interphase-Chromosomen zu malen. Sokolova verwendet MFISH 32 - Chromosomen Interphase zum ersten Mal zu malen. Diese Techniken sind auch für die Zeit nach der Bestrahlung Dosisabschätzung und Risikobewertung beim Menschen nach einer versehentlichen oder absichtlichen Exposition verwendet , um ionisierende Strahlung 11, 33. Daher teilweise oder vollständige Genomanalyse durch MFISH oder SKY bzw. sind nützliche Werkzeuge inter-chromosomale Aberrationen stabil für verschiedene Untersuchungen nachzuweisen.

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Acknowledgments

Diese Studie wurde von Arkansas Raum Grants Consortium und National Space Biomedical Research Institute durch National Aeronautics and Space Administration unterstützt wurde, gewährt NNX15AK32A (RP) und RE03701 (MH-J) und P20 GM109005 (MH-J) und die US Veterans Administration ( MH-J). Wir danken Christopher Fettes, Programm-Koordinator für die Abteilung für Umwelt- und Arbeitsmedizin an der University of Arkansas for Medical Sciences, für redaktionelle Unterstützung bei der Vorbereitung des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse
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Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

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