Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם קפדנית עם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. פרוטוקול בבעלי חיים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה. כל החיות שוכנו תחת מתקן חיה ממוזגת סטנדרטית 20 ± 2 ° C עם 10 - 15 מחזורים של שעות של אוויר צח גישה חופשית למזון מכרסם רגיל ומים. עם ההגעה, העכברים הוחזקו בבידוד במשך שבוע 1 ובתנאי צ'או מכרסם מוסמך.

חשיפת 1.Radiation ו במעצר Vivo של תאי Metaphase

  1. לחשוף בלתי מורדם עכברים 2 קרינת הגוף כולו Gy בתא הקרנה. במהלך הקרנה, עכברי מקום בתא חזק מאוורר היטב כדי לוודא שהם לא לנוע בחופשיות ולקבל מנה אחידה.
  2. להזריק 100 μL של פתרון קולכיצין 0.05% (גאבקת olchicine מומס סידן ומגנזיום חינם PBS) intraperitoneally באמצעות מחט 25 G מצורף עם 1 מ"ל מזרק חד פעמי. הימנע הזרקה ישירות לתוך כל איבר.
  3. השאר את החיה בכלוב עבור 2 שעות לפני קציר תאים במח העצם. שים החיה בחיפוש אחר סימנים של כאב או מצוקה.

קציר ובידוד 2. תא מח העצם של תאי mononuclear מח העצם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות

  1. להרדים את העכבר על ידי מחנק 2 CO.
  2. תרסיס אתנול 70% על הגב ועל הצד הגחוני.
  3. ביצוע חתך 2 ס"מ על עור הבטן במספריים חדים. אחוז העור משני צדי החתך עם פינצטה בוטה משוך בעדינות לפתוח את שרירי הבטן.
  4. חותכים שתי הרגליים האחוריות במספריים ומיד למקם אותם PBS מראש צונן עם 4% FBS.
  5. בזהירות לנקות את כל השרירים מחוברים הגפיים האחוריים עם תחבושת סכיני גילוח וכותנת גזה חדה.
  6. הפרד את השוקה מן הירך. חתוך את שני קצותיו של כל עצם עם סכיני גילוח.
  7. לרוקן את התוכן של מח העצם עם 3 מ"ל PBS (עם 4% FBS) באמצעות מחט 23 G מצורף מזרק 3 מ"ל ולאסוף התוכן צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לעבור את ההשעיה תא לפחות 10 פעמים באמצעות מחט כדי לעשות השעיה תא בודד.
  8. בזהירות כיסוי השעית התא על נפח שווה של מדיום הפרדה לימפוציטים (3 מיליליטר) מבלי להפריע את הממשק בין השעית התא ובינוני הפרדה לימפוציטים. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. אסוף את המעיל באפי בזהירות מבלי להפריע את השכבות האחרות והעברת צינור צנטריפוגות 15 מ"ל חדש.

3. הכנת ממרחים Cell Metaphase

  1. הוסף 10 מ"ל PBS על הצינור המכיל את המעיל באפי.
  2. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. מוציאים בזהירות את supernatant. ואז להתפרק tהוא התא גלולה עם הקשה עדינה ולהוסיף 10 מ"ל PBS.
  4. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולת התא, לשבור את הגלולה, ולהוסיף 4 מיליליטר של 0.075 M פתרון אשלגן כלורי hypotonic מחומם מראש. הוסף טיפת פתרון hypotonic אחר טיפה עם רעד קבוע עדין.
  6. דגירת תאים עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  7. לאחר טיפול hypotonic, להוסיף נפח שווה (4 מ"ל) של מקבע (מתנול: חומצה אצטית קרחונית, 3: 1 v / v) בצינור 15 מ"ל ומערבבים בעדינות על ידי צינור היפוך.
  8. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant.
  9. לשבור את התא גלולה עם הקשה ואחריו מערבולת עדינה במשך כמה שניות ולהוסיף 3 מ"ל של ירידה פתרון מקבע אחר טיפה עם רעד קבוע.
  10. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות.
  11. הסר את supernatant, לשבור את התא גלול עם גנטle קשה, ולהוסיף 3 מקבעים מיליליטר טרי.
  12. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant. לשבור את התא גלול עם הקשה עדינה, ולהוסיף מקבע 3 מיליליטר טרי.
  13. חזור על שלב 3.12 עוד פעמיים.
  14. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר supernatant מבלי להפריע גלולה התא. לאחר מכן להוסיף 400 עד 600 μL מקבע ומערבבים היטב עם pipetting.
  15. ירידה של 30 μL תאים קבועים על גבי שקופיות מראש לנקות ורטובות המוטות בזווית של 45 מעלות ולאפשר שקופיות לייבוש באוויר לחלוטין למשך לילה.

4. ציור כרומוזום עכבר ידי mFISH

  1. Denaturation כרומוזום
    1. מניחים את השקף המכיל ממרחים תא metaphase ב 2x SSC למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. מייבש את השקופית על ידי שטיפת אתנול סדרה עבור 2 דקות כל אחד ב 70%, 80% ו -100%. דגירה של 60 דקות ב 65 מעלות צלזיוס.
    3. מחממים 40 פתרון denaturation מ"ל (70% לפוראמיד / 2x SSC; pH 7.0) עד 70 ° C (± 2 ° C) בצנצנת Coplin זכוכית למשך 30 דקות. לפגל כרומוזומים על ידי דוגרים את השקופית בתמיסה denaturation מחומם מראש עבור 1 - דק 1.5.
    4. להרוות להחליק מיד באתנול 70% קר כקרח במשך 2 דקות כדי לעצור את תהליך denaturation וכן למנוע את הכרומוזומים מפוגל מ-חישול מחדש. ואז מייבשים על ידי שטיפה עם 80% אתנול למשך 2 דקות. חזור על לשטוף אתנול עם אתנול 100% למשך 2 דקות. לגמרי לייבש את השקופיות בטמפרטורת החדר.
  2. Denaturation ו הכלאה של תערובת Probe
    1. צנטריפוגות בקצרה את תערובת הבדיקה שסופקה על ידי היצרן, להעביר 10 μL של תערובת בדיקה לתוך צינור צנטריפוגות 500 μL צמד כובע, ו לפגל על ​​ידי דגירה על 80 מעלות צלזיוס (± 2 ° C) באמבט מים במשך 7 דקות.
    2. מניחים את הצינור צנטריפוגות עם תערובת בדיקה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    3. החלת את תערובת הבדיקה המפוגלת לשקופית עם chromoso המפוגלmes.
    4. בזהירות לכסות את האזור עם תלוש כיסוי זכוכית 18 מ"מ x 18 מ"מ ולחסל כל בועות אוויר גלויות על ידי בעדינות רבה הלחיצה להחליק את המכסה להחליק. חותם את כל ארבעת הצדדים של להחליק את המכסה במלט גומי דגירה במשך 12 שעות עד 16 שעות בחושך ב 37 מעלות צלזיוס בתא humidified הכלאה.
  3. כביסה וזיהוי הכלאת ההודעה
    1. מוציאים בזהירות את המלט גומי להחליק את המכסה.
    2. שקופית מקום ב SSC 0.4x מראש התחמם ב 74 ° C (± 2 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות.
    3. שקופית לשטוף בתמיסה לשטיפת השנייה (4x SSC / 0.1% Tween-20) למשך 2 דקות.
    4. מקום 20 μL של המדיום גובר אנטי לדעוך עם counterstain DAPI (1.5 מיקרוגרם / מ"ל) ומכסים coverslip זכוכית. לחצו בעדינות על coverslip עם רקמות במעבדה כדי להסיר בועות אוויר פתרון הרכבה עודף. חותם את הקצוות של coverslip עם לק.
    5. שקופיות צפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים מתאימים.

    5. ספקטרלית Karyotyping (SKY) של עכבר כרומוזומים

    1. כרומוזום ו Probe Denaturation
      1. לאזן שקופית 2x SSC בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, בלי לרעוד.
      2. מייבשי שקופיות בסדרת אתנול (70%, 80%, ו -100% אתנול) למשך 2 דקות כל בטמפרטורת חדר. אוויר יבש השקופית להסיר את אתנול לחלוטין.
      3. פתרון denaturation 40 מ"ל חם (70% לפוראמיד / 2x SSC; pH 7.0) בצנצנת Coplin זכוכית למשך 30 דקות.
      4. דגירה שקופיות בתמיסה denaturation מחומם מראש ל -1 עד 1.5 דקות.
      5. מיד לטבול את השקופית לתוך אתנול קר כקרח 70% למשך 2 דקות כדי לעצור את תהליך denaturation וכן למנוע את הכרומוזומים מפוגל מן מחדש חישול.
      6. מייבשים את השקופית על ידי הצבת אותו לתוך אתנול 80% עבור 2 דקות ולאחר מכן לתוך אתנול 100% עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
      7. לפגל בדיקה SKY (בקבוקון # 1 המסופק על ידי היצרן) באמבט מים מוגדר 80 ° C (± 2 ° C)במשך 7 דקות, ולאחר מכן מייד למקם לתוך אמבט מים שונה להגדיר עד 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. כלת Probe
      1. הוסף 10 μL של חללית SKY המפוגלת על הכרומוזומים המפוגל.
      2. בזהירות במקום coverslip זכוכית 18 מ"מ x 18 מ"מ על גבי חללית SKY כך שאין בועות אוויר לכודות מתחת coverslip.
      3. חותם את הקצוות של coverslip עם מלט גומי.
      4. מניחים את השקף בתא lightproof humidified דגירה בחושך על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עד 36 שעות.
    3. כביסת פוסט כלת גילוי הקרינה
      1. הסר מלט גומי מאוד בזהירות מבלי להפריע coverslip.
      2. מניחים את השקופית לתוך פתרון הכביסה המהירה מחומם מראש (SSC 0.4x) בשעה 72 ° C (± 2 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות עם רעד קבוע. לטבול להחליק לתוך כביסה פתרון III (4x SSC / 0.1% Tween 20) ו דגירה של 1 דק 'תוך רעד.
      3. אופציונלי: להוסיף 80 μL של מגיב חסימת(בקבוקון # 2 המסופק על ידי היצרן) על שטח של הכלאה, במקום coverslip פלסטיק 24 מ"מ x 60 מ"מ, ו דגירה בחושך על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתא humidified.
      4. הוצא בעדינות את coverslip פלסטיק לשטוף את השקופית עם מחומם מראש (45 ºC) פתרון הכביסה III למשך 5 דקות.
      5. החל 80 μL של Cy5 מגיב מכתים (בקבוקון # 3 שסופקו על ידי היצרן), במקום coverslip פלסטיק 24 מ"מ x 60 מ"מ, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 40 דקות בתא humidified.
      6. טובלים את השקופית לתוך צנצנת זכוכית Coplin המכיל מחומם מראש (45 ºC) כביסה פתרון III (4x SSC / 0.1% Tween 20) ו לדגור על 45 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 2 דקות עם רעד. חזור על שלב זה כביסה 3 פעמים.
      7. החל 80 μL של Cy5.5 מגיב מכתים (בקבוקון # 4 המסופק על ידי היצרן), במקום coverslip פלסטיק 24 מ"מ x 60 מ"מ, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 40 דקות בתא humidified.
      8. לשטוף את השקופית 3 פעמים עם טרום חימם (III פתרון כביסה 45 ºC).
      9. החזק את השקופית בעמדה מוטה נגד מגבת נייר לניקוז נוזלים עודפים. הוסף 20 μL מגיב DAPI אנטי לדעוך (בקבוקון # 5 שסופקו על ידי היצרן) ובזהירות במקום coverslip זכוכית 24 מ"מ x 60 מ"מ ללא החדרת בועות אוויר. חותם את הקצוות של coverslip עם לק ולבחון עם מיקרוסקופ epifluorescence מצויד עבור לכידת תמונות SKY.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הקרנת גוף סה"כ גורמת סטיות כרומוזומליות רבות של תאי מח עצם של עכברים מוקרנים. הפרוטוקול הנוכחי הוא מותאם במיוחד in vivo מעצר mitotic של תאי מח עצם לאחר חשיפה לקרינה, קציר של תאי מח עצם של הרגליים האחוריות של עכברים מוקרנים, בידוד של תאי mononuclear מח עצם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות, הכנת ממרחי תא metaphase, ובעקבות זיהוי של סטיות כרומוזומליות יציבות מושרה קרינה על ידי טכניקות mFISH ושמים. ציור כרומוזום באמצעות טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לזהות ולהעריך את הסיכון של תנאי pathophysiological שונים.

איור 1 מציג metaphase תא נציג מתפשט עם זוגות-1 כרומוזום עכבר רגילים וחריגים, -2, ו -3. איור 2 מציג karyotyping ספקטרלי של הכרומוזומים metaphase עכבר נורמלי נורמלי.תוצאות אלו מראות כי קרינה מייננת גורמת סטיות יציבה בין-כרומוזומלית התאים במח העצם בעכברים מתרבים, המורכב בעיקר של תאי גזע ובתאים אחראים התחדשות עצמית והבחנה לתוך תאים מסוגים שונים. שינויים ציטוגנטית בתאי גזע מולידם הוכחו לקשר עם מחלות קליניות שונות, כולל סרטן, נחשבים המנבאים החזקים עבור חומרת המחלה והישרדות כוללת. לכן, זה הגיוני להסיק כי מייננת סטיות בין כרומוזומליות יציבות מושרה קרינה עלולה לגרום לסיכון מוגבר להתפתחות הסרטן.

איור 1
איור 1: השפעת הקרינה על תאים במח העצם של עכבר מוקרן כפי שזוהה על ידי mFISH. A ו- B להראות התפשטות תאי metaphase עכבר עם זוגות נורמלים של chromosome-1 (אדום), כרומוזום-2 (ירוק), וכרומוזום-3 (אקווה). כל הכרומוזומים האחרים הם counterstained עם DAPI (כחול). C מראה סטייה יציבה מעורבת כרומוזום 1, חלק של כרומוזום-1 כבר משולב בתוך כרומוזום שאינם צבוע (DAPI), ואילו חלק אחר יצר שבר acentric. D מציגה חלק חלק של כרומוזום-2 כבר משולב ב כרומוזום שאינו צבוע. E מייצג סטייה יציבה מעורבים -3 כרומוזום. F מראה סטייה יציבה המעורבת כל שלושת כרומוזומים הצבועים. נקודות הפסקת צמתי צבע מסומנות על ידי חצים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: השפעת הקרינה על עצם מארתאים ow של מוקרן עכבר כפי שזוהו על ידי SKY. הפאנל העליון מראה karyotyping ספקטרלי נורמלי (SKY) של עכברה C57BL / 6. הלוח המרכזי מראה סטייה יציבה מעורבות כרומוזום 4 וכרומוזום-12. הפנל התחתון מציג karyotyping רפאי עכבר עם סטיית כרומוזומלית יציבה המעורבת כרומוזום 7 וכרומוזום-10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שלבים קריטיים כמה לקבוע את ההצלחה של mFISH ושמים. השלב הראשון והקריטי ביותר הוא כדי לייעל את הטיפול קולכיצין מעצר mitotic in vivo של תאים mononuclear מח עצם. שעת הריכוז וטיפול קולכיצין בנפרד או בתיאום לקבוע את מדד mitotic וכן כרומוזום עיבוי ושתיים תנאים המוקדמים חשובים לציור כרומוזום יעיל. זמן טיפול גבוה קולכיצין ריכוז או יותר מוביל הכרומוזומים מרוכז מאוד, עולה בקנה אחד עבור denaturation ואת ההכלאה נכונה. יתר על כן, זיהוי מדויק של rearrangements המורכבת בתא metaphase להתפשט עם כרומוזומים התמצו אינו משימה קלה להשגה. ממשל תוך הצפק של 100 קולכיצין 0.05% μL עבור 2 שעות ב עכבר עם משקל גוף בין 22 ל 26 גרם מייצר מספר מספיק של תאי metaphase מתפשט עם כרומוזומים מרוכזים בינוני. השלב הקריטי השני הוא טיפול hypotonic.ההיקף, זמן טיפול, והטמפרטורה של מורפולוגיה כרומוזום השפעת פתרון hypotonic והפצת הכרומוזומים לשקופית הזכוכית. טיפול hypotonic לתקופת זמן קצרה יותר או בטמפרטורה תת אופטימלית יכול למנוע את כרומוזום המתאים מתפשטת, וכתוצאה מכך תא metaphase להתפשט עם כרומוזומים חפפו. חופפים כרומוזום מפריע במורד בתהליך הכלאה באתרו, את הספציפיות של אותות ניאון, וזיהוי נכון של מחודשים.

שלישית, הקיבעון שלאחר hypotonic הוא צעד חשוב כדי למנוע היווצרות גוש תאים. מקבע יש להוסיף לאט במורד הצד של הצינור צנטריפוגות עם קבוע רעד עדין לקבל השעיה תא בודד. אחרת, ממרחי תא metaphase יהיו להיות לכודים בתוך גושי כרומוזום הפצה תהיה בסכנה. עם זאת, כרומוזום הפצה תלויה גם בסוג התא, טמפרטורה, לחות יחסית על tIME להפיל את ההשעיה תא גבי שקופיות זכוכית. מחקר קודם על ידי Spurbeck דיווח כי עבור לימפוציטים, בלחות יחסית של 60% וגם תוצאת טמפרטורת C ° 20 ב metaphase גבוה באזור 18. בנוסף, משך הייבוש גם שלב קריטי להפצת כרומוזום אופטימלי. תא Metaphase מתפשט כי יבש מדי מהר לייצר מרווחים מצומצמים עם כרומוזומים חופפים רבים, בעוד שתוצאות ייבוש איטי מאוד metaphase שבור הכרומוזומים 18. עם זאת, דנג הראה כי כרומוזום הפצת תלוי בעיקר בלחות היחסית עבור מגוון רחב של תאים בתרבית 19. הצעד החשוב הרביעי הוא לייעל את זמן denaturation כרומוזום. זמן denaturation מתארך ומתקצר להשפיע לרעה הכלאה בדיקה. denaturation כבר לא גורם כרומוזומים "נפוח", בעוד denaturation קצר מעכבת האינטראקציה של החללית הכרומוזומים. דרך נוספת לצמצום כרומוזום "נפיחות" הוא לשקופיות גיל הלילה בטמפרטורת החדר להיותצעד denaturation קדמי. שקופיות לא השתמשו לציור כרומוזום מיד, ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן ייבוש ב ºC -20. זמן כרומוזום denaturation צריך להיות אחיד עם גיל השקופיות, כמות הציטופלסמה סביב ממרחי תא metaphase, והלחות שבו תאים בוטלו על השקופיות. denaturation ואת ההכלאה Probe חשוב גם לציור כרומוזום מוצלח. חשיפה ישירה של בדיקות לאור בהיר יש להימנע, כך אות הניאון כי לא מאבד עוצמת אות.

הוא ומבוסס כי mFISH והשמים הם טכניקות עצמה לאיתור סטיות יציבות בין כרומוזומליות. כל rearrangements וכן הפסד או רווח של הכרומוזומים צבועים יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי שתי השיטות. עם זאת, זיהוי של חילופי כרומוזומליות תוך זרוע ובין-יד אינו אפשרי על ידי טכניקות אלה. זיהוי של חילופי כרומוזומליות תוך זרוע ובין-זרוע עכשיו הפך beca האפשרישימוש בפיתוח, בהתאמה, בדיקות FISH הססגונית כרומוזום ספציפי בזרוע בדיקות FISH mBAND. מחקר קודם על עובדים גרעיניים לשעבר הוכיח כי ניתוח mBAND הוא כלי רב עצמה כדי לזהות חתימות ייחודיות של ניזקי קרינה 20. יתר על כן, זיהוי של חילופי כרומטידה אחות, המאפיין של נזקי קרינה 21, לא ניתן על ידי טכניקות אלה. בנוסף, הוא mFISH ושמים מוגבלות יכולת לצייר באזור centromeric של כרומוזומים, אשר עלול לגרום בקיע המוטעה של כרומוזום dicentric כמו טרנסלוקציה. הטכניקות הן גם לא מתאימות לזיהוי לוקליזציה נקודת העצירה המדויקת של טרנסלוקציה. בנוסף, אותות ניאון לא יכול להישמר לצמיתות, עוצמת האות יורדת עם הזמן, וציור כרומוזום פלורסנט אינו מתאים לניתוח על ידי מערכת אוטומטית. עם זאת, עוצמת אות ניאון יכול להישמר לתקופה ארוכה של זמן על ידי אחסון החליקes במקפיא.

שתי שיטות משופרות של ציור כרומוזום פותחו כדי להתגבר על המגבלות של mFISH ושם: בהתאמה, ללא ניאון ציור כרומוזום 22 וצבע ספקטרלי רצועות (SCAN) 23. היתרונות של ציור כרומוזום ללא ניאון באמצעות peroxidase / diaminobenzidine (DAB) מעל הציור FISH כוללים זיהוי מדויק של האזור centromeric, זיהוי של התארגנות כרומוזומליות ידי מיקרוסקופ שדה בהיר, וכי אות לא פלורסנט נשמר לצמיתות וניתוח תמונה יכול להיות אוטומטי. מצד השני, את הסריקה יש יתרון על פני SKY כי בדיקות SCAN ערוכות מתוך רצפי הדנ"א הגנומי ספציפי להקה עבור כרומוזום מסוים וכך, יכולות לזהות את המקור מדויק של להקה כרומוזום. SCAN גם מקל על זיהוי של חילופי תוך כרומוזומליות. בהתחשב היתרונות של שיטות משופרות, צריך להיחשב אלה עבור i שימוש שגרתיניסויים קליניים ציטוגנטית n. עם זאת, הכנת בדיקות מרצף הדנ"א הגנומי ספציפי הלהקה עבור כל זוגות כרומוזומים הוא מאתגר מבחינה טכנית ומגביל את השימוש בו ציטוגנטיקה מולקולרית.

קביעה אם ההבדל בין קבוצות הטיפול הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית או לא הוא היבט חשוב נוסף של ציטוגנטיקה מולקולרית. קריטריוני ניקוד, כגון מספר תאי metaphase מתפשט נספרים, מספר בעלי החיים המשמשים לכל קבוצת טיפול, ספירת כרומוזום לכל תא metaphase להתפשט במהלך ניתוח, מינוח לפיה ממוין סטיות ציינו לאחר ציור כרומוזום, וכו 'לשחק תפקיד קריטי בקביעת אי הוודאות הסטטיסטית בין שתי קבוצות הטיפול. למרות מעבדות שונות יש קריטריוני ניקוד קניינית, ניקוד של 100 עד 300 ו 20 metaphase תא מתפשט עם 40 כרומוזומים היטב מופרדים ב לפחות 3 עד 5 עכברים מומלצים בדרך כלל לקביעת מובהקות סטטיסטיות ב mFISH אנאלי SKYיסיס, בהתאמה 24, 25. יתר על כן, הבחירה של מינוח לפיה ממוינות סטיות בכרומוזומים צבועים הוא פרמטר חשוב להערכת אי ודאות סטטיסטית. ישנן שתי מערכות מינוח פופולריות בשימוש לתאר סטיות זוהו על ידי בדיקות ציור כרומוזום שלמות: (1) שיטת סיווג S & S ידי סאבאג סימפסון 26, 27 ו (2) מינוח PAINT ידי טאקר et al. 28. כל מערכת מסתמכת על תנאים מוקדמים שונים לסיווג סטיות כרומוזומליות מבניות יש יתרונות וחסרונות משלה. מערכת S & S היא מתאימה בעיקר לפרשנות מכניסטית ממוצא סטייה, בעוד PAINT מספק תיאור של דפוסי ציור נורמלים. מחקרים שערכו אל Knehr et. על סטיות כרומוזומליות מושרות קרינה בכרומוזומים צבוע FISH עולה כי שיטת הצבע, כמו מערכת S & S, יכולה לשמש גם כדי לקבוע מקור סטייה עם כמה modificatiעל בקריטריוני הניקוד יהיה שימושי ביותר עבור יישום מעשי 29.

שתי שיטות יש mFISH ושם מגבלות משלהם. לדוגמא, mFISH מתיר ניקוד מהיר עם קצת אימון, לעומת זאת, זה לא להקרין את כל הכרומוזומים למדידת תדירות סטייה וחושף תדירות סטייה חלקית בלבד, תלוי במספר הכרומוזומים הצבועים השתמשו במחקר. עם זאת, חלק קטן של חילופי כולל שנצפה על ידי ציור כרומוזום שלם יכול להיות מוערך על ידי הנוסחא הניחה במקור על ידי לוקאס et al. 30 ו שופר עוד יותר בעזרת ואח Braselmann. 31. נוסחא מתמטית זה רואה חליפין בין כרומוזומים צבועים ובין הכרומוזומים הצבועים counterstained. לדוגמא, אפשר p f מייצג את סכום השבר של הגנום מכוסה על ידי הכרומוזומים הצבועים 1 1), 2 2), ו -3 3), wheמחדש f 1 = 0.0696, f 2 = 0.0649 ו- F 3 = 0.0570, הערכים מייצגים את התוכן הגנומי של כרומוזומים בודדים עכברות. לכן, f p = (f 1 + f 2 + 3 'ו) = 0.192 שברים counterstained הופך (1 - f p) = 0.808. תדירות חילופי מעורבים הכרומוזומים צבועים counterstained (F P) ניתן לחשב בקלות על ידי מכפלה וקטורית של התרחבות הבינומית (q + p) 2 = p 2 + 2pq + q 2, כאשר p = f p ו- q = (1 - f p). לפיכך, F P = 2pq = 2f p (1 - f p) = 0.310, כלומר 31% של חילופי כרומוזומליות ניתנים לצפייה אחרי שיצבע כרומוזום 1 העכבר, -2, ו -3. לכן, 1 / 0.31 = 3.23 תאים צריכים להיות בקיע שווה התאגדו אחד תאי metaphase או שווה ערך הגנום כולו אחד. יתר על כן, הן mFISH ושמים יש יכולת מוגבלת specifically לזהות אילו גני נקודות עצירה מעורבים היווצרות הסטייה וגם כדי לזהות כפילויות קטנות, תנוחות הפוכות, ומחיקות.

היישום של mFISH וניתוח SKY אינו מוגבל מחקר בסיסי. שניהם נמצאים בשימוש קבוע במחקרים קליניים. הטכניקות האלה גם הוחלו לפני ואחרי האבחנה לאחר הלידה, הערכת סיכונים, וזיהוי של סוגים שונים של סרטן. יתר על כן, הן טכניקות שניתן להשתמש בהם כדי לצייר הכרומוזומים הביניים. סוקולובה בשימוש mFISH לצייר הכרומוזומים שלבי בפעם הראשונה 32. טכניקות אלו משמשות גם לאמידה במינון שלאחר הקרנה והערכת סיכונים בבני אדם לאחר חשיפה מקרית או מכוונת לקרינה מייננת 11, 33. לכן, ניתוח הגנום חלקית או כולו על ידי mFISH או SKY, בהתאמה, הם כולים שימושיים כדי לאתר סטיות יציבות בין כרומוזומליות עבור מחקרים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי ארקנסו שטח גרנט Consortium ונשיונל שטח Biomedical Research Institute דרך לאומי ומסוכנות החלל, מעניק NNX15AK32A (RP) ואת RE03701 (MH-J), ו P20 GM109005 (MH-J), ואת ותיקי המינהל ארה"ב ( MH-J). אנו מודים כריסטופר Fettes, רכזת תוכנית עבור משרד סביבתיים בעיסוק הבריאות באוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה, לסיוע העריכה ב הכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691 (2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).
איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter