Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출 doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

모든 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 수행 하였다. 동물 프로토콜은 의료 과학에 대한 아칸소 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 신선한 공기와 표준 설치류 음식과 물을 무료로 이용할 수의 15 시간당 사이클 - 모든 동물은 10 20 ± 2 ℃에서 표준 에어컨 동물 시설에서 보관 하였다. 도착 후, 마우스 1 주일 동안 격리에서 개최하고 인증 설치류 식사를 제공했다.

1.Radiation 노출 및 중기 세포의 생체 체포에

  1. 노출 조사 챔버에서 2 Gy의 전신 방사선에 마우스를 해제는-마취. 조사 기간 동안, 통풍이 잘 유지 챔버의 장소 마우스는 자유롭게 이동하고 균일 한 용량을받지 못한 확인합니다.
  2. 0.05 % 콜히친 용액 100 μL를 주입 (c칼슘 및 마그네슘없는 PBS에 용해 olchicine 분말) 복강 내 1 ㎖의 일회용 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용. 어떤 기관에 직접 분사하지 마십시오.
  3. 골수 세포 수확하기 전에 2 시간 동안 케이지에 동물을 둡니다. 통증이나 고통의 흔적에 대한 동물을 관찰한다.

2. 골수 세포 수확 및 밀도 구배 원심 분리하여 골수 단핵 세포의 분리

  1. CO 2 질식하여 마우스를 안락사.
  2. 지느러미와 복부 측면에 70 % 에탄올 스프레이.
  3. 날카로운 가위로 복부 피부에 2cm의 절개를합니다. 무딘 핀셋 절개의 양쪽 피부를 잡고 조심스럽게 복부 근육을 잡아 당깁니다.
  4. 가위로 양쪽 뒷다리를 잘라 즉시 4 % FBS 사전 냉장 PBS에 배치합니다.
  5. 조심스럽게 날카로운 면도칼과면 거즈 붕대로 뒷다리에 연결된 모든 근육을 청소합니다.
  6. 대퇴골의 경골을 분리합니다. 면도칼 각 뼈의 양쪽 끝을 낸다.
  7. 3 mL의 주사기에 부착 된 23 G 바늘을 사용하여 (4 % FBS)와 3 mL의 PBS와 함께 골수의 컨텐츠를 플러싱하고, 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 컨텐츠를 수집한다. 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 바늘을 통해 세포 현탁액을 10 배 이상을 합격.
  8. 조심스럽게 세포 현탁액 및 림프구 분리 매질 간의 인터페이스를 방해하지 않고 림프구 분리 매질 (3 mL)을 동일 부피의 세포 현탁액을 오버레이. 실온에서 30 분 동안 400 × g으로 원심 분리기.
  9. 새로운 15 mL의 원심 분리 튜브 내의 다른 계층과 전송을 방해하지 않고 조심스럽게 버피 코트를 수집한다.

중기 세포 스프레드 3. 준비

  1. 버피 코트를 포함하는 튜브에 10 mL의 PBS를 추가합니다.
  2. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기.
  3. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 그런 t을 휴식그는 부드러운 도청과 펠렛 셀, ​​10 mL의 PBS를 추가합니다.
  4. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기.
  5. , 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거 펠렛을 중단하고 미리 예열 저장성 0.075 M 염화칼륨 용액 4 mL를 넣고. 부드러운 일정한 흔들림과 강하에 의한 저장성 용액 방울을 추가합니다.
  6. 수욕에서 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 인큐베이션.
  7. (: 빙초산 3 : 메탄올 1 v / v)의 저장성 처리 후, 고정액 동량 (4 ml)에 추가 15ml의 튜브와 상기 튜브를 반전시켜 부드럽게 혼합한다.
  8. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다.
  9. 몇 초 동안 부드러운 소용돌이 다음 탭핑과 세포 펠렛을 휴식과 일정한 흔들림와 드롭으로 정착 솔루션 드롭 3 mL를 넣고.
  10. 실온에서 30 분 동안 배양 한 다음 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기.
  11. , 상층 액을 제거 신사와 세포 펠렛을 휴식제작 : 도청, 3 mL의 신선한 정착액을 추가합니다.
  12. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다. 부드러운 도청과 세포 펠렛을 휴식, 신선한 3 ML의 정착액을 추가합니다.
  13. 단계를 반복 3.12 배 더.
  14. 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 세포 펠렛을 교란시키지 않고 상층 액을 제거한다. 그 후 600 μL의 정착에 400를 추가하고 피펫으로 잘 혼합한다.
  15. 45 ° 각도로 기울어 미리 청소하고 젖은 슬라이드에 30 μL에게 고정 된 세포를 삭제하고 완전히 밤새 공기 건조에 슬라이드를 할 수 있습니다.

mFISH 4. 마우스 염색체 페인팅

  1. 염색체 변성
    1. 실온에서 2 분 동안 2 × SSC에서 중기 세포의 퍼짐을 포함하는 슬라이드를 놓는다.
    2. 70 %에서 2 분 각각 80 %, 100 %를 직렬 에탄올 세척하여 슬라이드를 탈수. 65 ° C에서 60 분 동안 품어.
    3. 데우고 40 ㎖의 변성 용액 (70 % 포름 아미드 / 2 × SS기음; 30 분 동안 유리 코 플린 항아리에 70 ° C (± 2 ° C)로 pH를 7.0). 1.5 분 - 1 예열 변성 용액 슬라이드를 배양하여 염색체 변성.
    4. 2 분 변성 과정을 중단뿐만 아니라, 재 어닐링에서 염색체 변성을 방지하기위한 빙냉 70 % 에탄올 중에 슬라이드를 즉시 급냉. 그 다음 2 분 동안 80 % 에탄올로 세척하여 탈수. 2 분 동안 100 %의 에탄올과 에탄올 세척을 반복합니다. 완전히 실온에서 슬라이드를 건조.
  2. 변성 및 프로브 혼합물의 하이브리드
    1. 간단히 제조자에 의해 공급되는 프로브 혼합물을 원심 분리하여, 7 분 동안 수욕에서 80 ℃ (± 2 ℃)에서 배양 캡 원심 분리 튜브 스냅 500 μL로 프로브 액 10 μL를 전송하고, 변성.
    2. 10 분 동안 37 ℃에서 수욕 프로브 혼합물 원심 튜브를 놓는다.
    3. 변성 chromoso와 슬라이드에 변성 프로브 혼합물을 적용MES.
    4. 조심스럽게 18mm X 18mm 유리 커버 슬립으로 영역을 커버하고 매우 부드럽게 밀어 커버 슬립을 눌러 눈에 보이는 기포를 제거한다. 고무 시멘트와 커버 슬립의 네면을 밀봉 및 하이브리드에 대한 가습 챔버에서 37 ° C에서 어둠 속에서 16 시간에 12 시간 동안 배양.
  3. 포스트 하이브리드 세척 및 검출
    1. 조심스럽게 고무 시멘트와 커버 슬립을 제거합니다.
    2. 5 분 동안 74 ° C (± 2 ° C)에서 미리 예열 0.4 배의 SSC의 장소 슬라이드.
    3. 2 분 동안 세척 용액 II (4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20)에서 세척 슬라이드.
    4. DAPI의 Counterstain과 (1.5 μg의 / mL)로 안티 - 페이드 장착 매체의 20 μL를 놓고 유리 커버 슬립으로 다룹니다. 부드럽게 실험실 조직과 coverslip에 눌러 공기 거품과 초과 장착 솔루션을 제거합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다.
    5. 적절한 필터가 장착 된 형광 현미경을 사용하여 볼 슬라이드.

    5. 스펙트럼 핵형 마우스 염색체의 (SKY)

    1. 염색체와 프로브 변성
      1. 흔들림없이, 2 분 동안 실온에서 2 × SSC에서 슬라이드 평형.
      2. 실온에서 2 분마다 에탄올 시리즈 슬라이드 (70 %, 80 %, 100 % 에탄올)을 탈수. 완전히 에탄올을 제거 할 수있는 슬라이드를 공기 - 건조.
      3. 따뜻한 40 ML의 변성 용액 (70 % 포름 아미드 / 2 × SSC, 산도 7.0) 30 분 동안 유리 코 플린 항아리입니다.
      4. 1 ~ 1.5 분 동안 예열 변성 솔루션에 슬라이드를 품어.
      5. 2 분 변성 과정을 중단뿐만 아니라, 재 어닐링에서 염색체 변성을 방지하기 위해 즉시 빙냉 70 % 에탄올로 슬라이드 젖어.
      6. 실온에서 2 분 동안 100 % 에탄올로 2 분 후, 80 % 에탄올로 배치 의해 슬라이드 탈수.
      7. 80 ° C (± 2 ° C)로 설정 수욕에서 SKY 프로브 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 1) 변성7 분 후 즉시 10 분간 37 ° C로 설정 다른 수조에 놓는다.
    2. 프로브 하이브리드
      1. 변성 염색체에 변성 SKY 프로브의 10 μL를 추가합니다.
      2. 기포가 커버 슬립 아래에 갇혀되지 않도록 조심스럽게 SKY 프로브 상에 18mm X 18mm 유리 coverslip에 배치합니다.
      3. 고무 시멘트와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다.
      4. 가습 차광판 챔버에 슬라이드를 넣고 36 시간 ~ 24 시간 동안 37 ℃에서 어둠 속에서 배양한다.
    3. 포스트 하이브리드 세척 및 형광 검출
      1. 커버 슬립을 방해하지 않고 매우 신중 고무 시멘트를 제거합니다.
      2. 일정한 흔들림 5 분 동안 72 ° C (± 2 ° C)에서 미리 예열 빠른 세척 용액 (0.4 배의 SSC)에 슬라이드를 놓습니다. 세척 용액 III (4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20)에 슬라이드를 담그고 흔들어 섞으면 서 1 분 동안 품어.
      3. 옵션 : 차단 시약 80 μL를 추가하이브리드의 영역 상 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 2)와, 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 30 분 동안 37 ° C에서 어둠 속에 품어.
      4. 조심스럽게 플라스틱 커버 슬립을 제거하고 5 분간 예열 (45 ° C) 세척 용액 III와 슬라이드를 씻는다.
      5. 80 μL Cy5에 염색 시약 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 3)를 적용하는 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 40 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어.
      6. 함유하는 유리 코 플린 항아리에 슬라이드를 담근 예열 (45 ºC) 세정액 III (4X SSC / 0.1 % 트윈 20)와 진탕하면서 2 분 동안 수욕에서 45 ℃에서 배양한다. 이 세척 단계를 3 번 ​​반복합니다.
      7. 80 μL Cy5.5의 염색 시약 (제조사에서 제공 한 유리 병 # 4)를 적용하는 24mm X 60mm 플라스틱 커버 슬립을 배치하고, 가습 실에서 40 분 동안 어둠 속에서 37 ° C에서 품어.
      8. (미리 예열과 슬라이드 3 회 반복한다45 ºC) 세정액 III.
      9. 초과 액체를 배출하기 위해 종이 타월에 대하여 기울어 진 위치에 슬라이드를 잡습니다. 20 μL 안티 페이드 DAPI 시약 (제조업체에서 제공 유리 병 # 5)를 추가하고 조심스럽게 기포를 도입하지 않고 24mm X 60mm 유리 coverslip에 배치합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 SKY 이미지를 캡처 장착 된 표면 형광 현미경으로 관찰한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

전신 방사선 조사 된 마우스의 골수 세포에서 다수의 염색체 수차를 유도한다. 현재 프로토콜은 방사선 조사 후 골수 세포의 생체 유사 분열 정지를 위해 최적화되고, 밀도 구배 원심 분리, 중기 세포 퍼짐의 제조 및 후속 의해 조사 생쥐 골수 단핵 세포의 분리의 뒷다리 골수 세포의 수확 mFISH과 SKY 기술에 의해 방사선 유발 안정적인 염색체 이상 검출. 염색체 이들 기술은 검색 및 다양한 병태 생리 학적 증상의 위험을 평가하는 데 이용 될 수 그림.

도 1은 대표적인 중기 세포는 정상 및 비정상 마우스 염색체 쌍-1, -2, -3에 확산 나타낸다. 그림 2는 정상 및 비정상 마우스 중기 염색체의 스펙트럼 핵형을 보여줍니다.이러한 결과는 전리 방사선 것은 주로 다양한 세포 유형으로자가 재생과 분화에 대한 책임 줄기 및 전구 세포로 구성된 상기 확산 뮤린 골수 세포에서 염색체 간 안정적 수차를 유도하는 것으로 나타났다. 줄기 및 전구 세포에서 세포 유전 학적 변화는 암을 포함한 다양한 임상 질환과 연관 표시되었습니다, 질병 심각도 및 전반적인 생존을위한 가장 강력한 예측 인자로 간주됩니다. 따라서, 방사선 - 유도 된 안정한 염색체 간 수차를 이온화하여 암 발생의 위험이 발생할 수 있음을 추론 논리이다.

그림 1
그림 1 : mFISH에 의해 감지로 조사 된 마우스의 골수 세포에 방사선의 효과. AB는 CH 정상적인 쌍 마우스 중기 세포의 확산을 보여준다romosome-1 (적색), 염색체 2 (녹색), 및 염색체 -3- (아쿠아). 다른 모든 염색체는 DAPI (파란색)으로 대조된다. C는 다른 부분은 acentric 단편을 형성 반면 염색체 1, 염색체 1의 일부가 아닌 그린 (DAPI) 염색체에 통합되어 수반 안정 수차를 나타낸다. D는 염색체 2의 부분의 일부가 아닌 그린 염색체에 통합 된 나타낸다. E는 염색체-3를 포함하는 안정적인 수차를 나타냅니다. F는 세 가지 그린 염색체를 포함하는 안정적인 수차를 보여줍니다. 브레이크 포인트 컬러 접합은 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 뼈 마르에 방사선의 효과SKY에 의해 감지으로 조사 된 마우스의 흐름 세포. 상단 패널은 C57BL / 6 암컷 마우스의 정상적인 스펙트럼 핵형 (SKY)를 보여줍니다. 중간 패널은 염색체-4 및 염색체-12을 포함하는 안정적인 수차를 보여줍니다. 하단 패널은 염색체 7 염색체-10을 포함하는 안정적인 염색체 이상을 가진 마우스 스펙트럼 핵형을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

몇 가지 중요한 단계는 mFISH과 SKY의 성공을 결정합니다. 첫번째 가장 중요한 단계는 골수 단핵 세포의 생체 유사 분열 정지를위한 콜히친 처리를 최적화한다. 콜히친 농도와 처리 시간을 개별적으로 또는 콘서트에 효과적인 염색체 그림의 유사 분열 지수뿐만 아니라 염색체 응축 - 두 가지 중요한 전제 조건을 결정한다. 높은 콜히친 농도 이상 처리 시간은 적절한 변성과 하이브리드에 대한 호환되지 않는 매우 응축 된 염색체로 연결됩니다. 또한, 응축 된 염색체와 확산 중기 세포의 복잡한 재 배열의 정확한 식별은 달성하기 쉬운 일이 아니다. 22, 26g 사이의 체중을 가진 마우스에서 2 시간 동안 100 μL 0.05 % 콜히친의 복강 내 투여는 중기 세포의 충분한 수가 약간 좁은 염색체 확산 생성한다. 두번째 중요한 단계는 저장성 처리이다.볼륨, 처리 시간, 및 저장성 용액 영향 염색체 형태학의 온도와 유리 슬라이드 상 염색체 확산. 짧은 시간 또는 서브 - 최적의 온도에서 저장 액 처리 중첩 염색체 확산 중기 세포에서 생성 된, 적절한 염색체 확산을 방지 할 수있다. 염색체 중복은 현장 하이브리드 공정, 형광 신호의 특이도, 재 배열의 적절한 식별의 하류 방해합니다.

셋째, 후 저장성 고정 세포 덩어리 형성을 방지하는 중요한 단계입니다. 정착 제는 부드럽고 일정한 단일 세포 현탁액을 얻었다 진탕 원심 튜브의 측면 아래로 서서히 첨가한다. 그렇지 않으면, 중기 세포 스프레드는 대단히 짧은 시간에 갇혀 될 것입니다 및 염색체 손상됩니다 확산. 그러나, 또한 확산 염색체는 t의 세포 유형, 온도 및 습도에 따라유리 슬라이드 상에 세포 현탁액을 적하 IME. Spurbeck 의한 이전의 연구는보고 된 림프구를 들어, 상대 습도 60 % 이상 중기 영역 (18)에서 20 ° C의 온도 결과. 또한, 건조 기간은 최적의 염색체 확산을위한 중요한 공정이다. 중기 세포가 파괴 중기 매우 느린 건조 결과 18 번 염색체 동안 건조 너무 빨리, 많은 중복 염색체와 타이트한 스프레드를 생산하는 것을 펼쳐집니다. 그러나 덩 샤오핑은 주로 확산 염색체가 배양 된 세포 (19)의 다양한 상대 습도에 따라 달라집니다 것으로 나타났다. 네 번째 중요한 단계는 염색체 변성 시간을 최적화하는 것이다. 더 긴 짧은 변성 시간에 악영향 프로브 하이브리드에 영향을 미칩니다. 짧은 변성이 염색체에 프로브의 상호 작용을 방해 동안 긴 변성은 "푹신한"염색체가 발생합니다. 염색체 "붓기"를 감소시키는 또 다른 방법은 실온에서 하룻밤 연령 슬라이드하다전단 변성 단계. 염색체 유화에 사용되지 프레젠테이션 즉시 -20 ºC에서 데시 케이 터 내에서 무한히 저장 될 수있다. 염색체 변성 시간 슬라이드 연령, 중기 세포 퍼짐 주변 세포질의 양이 세포가 슬라이드 상에 적하 하였다되는 습도 표준화되어야한다. 프로브 변성과 하이브리드는 성공적인 염색체 페인팅 중요하다. 그 형광 신호가 신호 강도를 잃지 않도록 밝은 빛에 프로브의 직접 노출은 피해야한다.

mFISH과 SKY가 간 염색체 안정 수차를 검출하기위한 강력한 기술이라는 것을 잘 확립되어있다. 임의의 재구성뿐만 아니라 손실 그린 염색체 이득 용이 이러한 두 가지 방법에 의해 식별 될 수있다. 그러나, 내 팔과 간 암 염색체 교환의 검출은 이러한 기술에 의해 할 수 없습니다. 내 팔과 간 암 염색체 교환의 식별이 가능해 BECA되고있다각각 염색체 팔 고유의 여러 가지 빛깔의 물고기 프로브 및 mBAND 생선 프로브의 개발의 사용. 전 핵 노동자에 대한 이전 연구는 mBAND 분석 방사선 손상 (20)의 독특한 서명을 식별 할 수있는 강력한 도구입니다 것으로 나타났습니다. 또한, 자매 염색 분체 교환의 식별, 방사선 손상 (21)의 특징은,이 기술에 의해 수 없습니다. 또한, mFISH과 SKY 모두 전위로 dicentric 염색체의 잘못된 점수가 발생할 수 있습니다 염색체의 센트로 미어 영역을 페인트 할 수있는 능력을 제한하고있다. 기술은 또한 전위의 정확한 위치 파악 중단을 식별하기에 적합하지 않다. 또한 형광 신호가 영구히 유지 될 수없고, 신호 강도는 시간에 따라 감소하고, 형광 염색체 회화는 자동화 된 시스템에 의한 분석에 적합하지 않다. 그러나, 형광 신호 강도 미끄러 저장함으로써 장기간 보존 할 수있다냉장고에서 말이지.

염색체 페인팅 두 개선 된 방법 및 mFISH SKY의 한계를 극복하기 위해 개발되었다 : 각각 비 형광 염색체 그림 (22)과 분광 컬러 (SCAN) 23 밴딩. FISH 페인팅 통해 퍼 옥시 다제 / 디아 미노 벤지딘 (DAB)를 이용하여 비 형광 염색체 회화의 장점은 정확한 센트로 영역의 식별 명 시야 현미경으로 염색체 재 배열을 식별하고, 그 영구 보존 비 형광 신호 및 이미지 분석 할 수 포함 자동화 될 수있다. SCAN 프로브는 특정 염색체에 대한 밴드 별 게놈 DNA 서열로부터 제조되고, 따라서 정확한 염색체 밴드의 출처를 확인할 수 있기 때문에, 한편, SCAN은 하늘에 유리하다. SCAN은 내 염색체 교환의 식별을 용이하게한다. 개선 된 방법의 이점을 고려하면,이 루틴은 사용 전 고려되어야n은 임상 세포 유전 학적 검사. 그러나, 각 염색체 쌍의 주파수 대역 별 게놈 DNA 서열로부터 탐침의 제조가 기술적 도전 분자 유전학에서의 사용을 제한한다.

처리 군 간의 차이는 통계적으로 유의인지 여부를 판정하는 분자 유전학의 또 다른 중요한 측면이다. 이러한 중기 세포의 수와 같은 채점 기준은 처리 군, 분석 중에 확산 중기 세포 당 염색체 카운트 당 사용 된 동물의 수는, 명칭 염색체 유화 후에 관찰 수차 분류 통계적 불확실성을 결정하는데 중요한 역할을하는 데, 카운트 스프레드 치료 그룹 사이. 다양한 실험실 독점 채점 기준, 셀은 적어도 3-5 마우스에서 40 잘 구분 염색체와 확산 (100) 중기 300에 20의 점수를 가지고 있지만 일반적으로 mFISH과 SKY 항문에서 통계적 유의성을 결정하는 것이 좋습니다이 Analysis, 각각 24, 25. 또한, 그린 염색체 수차를 분류하는 데 사용되는 용어의 선택은 통계적 불확실성을 평가하기위한 중요한 파라미터이다. 전체 염색체 페인팅 프로브에 의해 검출 수차를 설명하기 위해 사용이 인기 명명법 시스템이있다 : (1) S & S 터커 등으로 야만인와 심슨 (26), 27 (2) PAINT 명명법에 의한 분류 방법. 28. 각 시스템은 구조적 염색체 이상 분류에 대해 서로 다른 전제 조건에 의존하고 자신의 장점과 단점이 있습니다. PAINT 비정상 페인팅 패턴에 대한 설명을 제공하는 반면 S & S 시스템 수차 기원 역학적 해석에 주로 적합하다. Knehr 등의 알에 의해 연구. FISH 그린 염색체 방사선 유발 염색체 이상에 PAINT 방법에서, S & S 시스템과 같은, 일부 modificati 수차와 원점을 결정하는 데 사용될 수 있다는 지시및 채점 기준에서의 실용적인 응용 프로그램 (29)에 가장 유용 할 것이다.

두 mFISH과 SKY 방법은 자신의 한계를 가지고있다. 예를 들어, mFISH하지만,이 수차의 주파수를 측정하기 위해 모든 염색체를 선별하지 않고, 적은 훈련으로 빠른 득점을 허용 및 연구에 사용 된 그린 염색체의 수에 따라 부분적 수차 주파수를 보여준다. 그러나, 전체 염색체 페인팅 관찰 총 교환의 일부분은 원래 루카스 동부 등에 의해 가정 식으로 추정 할 수있다. 30 추가 Braselmann 등의 알에 의해 수정. 31. 이 수학 공식 페인트 염색체 중 그린과 대조 염색체 사이의 교환을 고려한다. 예를 들어, F (P)가 그린 염색체에 의해 덮여 게놈의 부분 합을 나타낼 수 있도록 한 (F 1), 2 (F 2), 3 (F 3) 갔지1 = 0.0696, 2 F = 0.0649, 및 F F 3 = 0.0570 재, 값이 암컷 마우스에서 개별 염색체의 게놈 내용을 나타냅니다. (- F P는 1) = 0.808 따라서, f를 P = (F 1 + F 2 + F 3) = 0.192과 대조 부분이된다. 페인트와 대조 염색체 (F P)를 포함하는 교류의 주파수는 쉽게 이항 팽창 외적 (p의 +의 Q)에 의해 계산 될 수있다 (2) P = 2 + 2pq + Q 2, p = F p와 q = (1 - F 쪽). 따라서, F P = 2pq = 2 층 P (1 - F 피) = 0.310, 의미 염색체 교환의 31 %는 마우스 염색체-1, -2 페인팅 후 관찰하고, -3입니다. 따라서, 1 / 0.31 = 3.23 셀 한 줄무늬 중기 세포 또는 하나의 전체 게놈 당량 동일하게 획득 될 필요가있다. 또한, mFISH과 SKY 둘과 특이 능력을 제한ically 수차 형성에 관여하고, 또한 작은 중복, 역전 및 삭제를 검출하는 유전자와 중단 식별한다.

mFISH과 SKY 분석의 응용 프로그램은 기초 ​​연구에 한정되는 것은 아니다. 모두 정기적으로 임상 연구에서 이용되고있다. 이러한 기술들은 산전 산후 진단, 위험 평가 및 암의 다양한 유형의 식별에 적용되어왔다. 또한, 양쪽 기술은 계면 염색체 도장 할 수있다. 소코 로바는 처음으로 32 상간 염색체를 페인트 mFISH을 사용했다. 이러한 기술은 방사선 (11), (33)을 이온화에 실수로 또는 의도적으로 노출 된 후 인간의 사후 조사 선량 추정 및 위험 평가에 사용됩니다. 따라서, mFISH 또는 SKY에 의해 일부 또는 전체 게놈 분석은 각각 다양한 연구에 대한 간 염색체 안정 수차를 감지하는 유용한 도구입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

본 연구는 국립 항공 우주국 통해 아칸소 공간 그랜트 협회와 국립 우주 바이오 메디컬 연구소에 의해 지원되었다, 부여 NNX15AK32A (RP) 및 RE03701 (MH-J), 및 P20의 GM109005 (MH-J), 미국 재향 군인의 관리 ( MH-J). 우리는 원고의 준비 편집 지원 크리스토퍼 Fettes, 의료 과학 아칸소 대학의 환경 및 산업 보건학과에 대한 프로그램 코디네이터, 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691 (2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).
여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter