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Genetics

La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

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Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas. Todos los animales fueron alojados bajo animalario climatizado estándar a 20 ± 2 ° C con 10 - 15 ciclos por hora de aire fresco y libre acceso al alimento estándar para roedores y agua. A su llegada, los ratones se mantuvieron en cuarentena durante 1 semana y siempre con comida para roedores certificado.

La exposición 1.Radiation e in vivo detención de las células en metafase

  1. exponer los ratones anestesiados un-a 2 Gy de radiación en todo el cuerpo en una cámara de irradiación. Durante la irradiación, los ratones lugar en una cámara de retención con buena ventilación para asegurarse de que no se mueven libremente y recibir una dosis uniforme.
  2. Se inyectan 100 l de solución de colchicina 0,05% (cpolvo olchicine disuelto en calcio y magnesio libre de PBS) por vía intraperitoneal usando una aguja de 25 G adjunto con jeringa de 1 ml desechable. Evitar la inyección directamente en cualquier órgano.
  3. Dejar al animal en la jaula durante 2 h antes de la cosecha de células de médula ósea. Observar el animal para detectar cualquier signo de dolor o angustia.

2. Médula Ósea de la célula de la cosecha y Aislamiento de células mononucleares de médula ósea por centrifugación en gradiente de densidad

  1. La eutanasia a los ratones por asfixia con CO2.
  2. Pulverizar 70% de etanol en el dorsal y el lado ventral.
  3. Hacer una incisión de 2 cm en la piel abdominal con unas tijeras afiladas. Agarre la piel en cada lado de la incisión con pinzas romas y tire suavemente abrir los músculos abdominales.
  4. Cortar dos de las patas traseras con las tijeras y de inmediato colocarlos en PBS enfriado previamente con 4% de FBS.
  5. Limpiar cuidadosamente todos los músculos que se unen a la extremidad posterior con una hoja de afeitar y gasa de algodón vendaje agudo.
  6. Se separa la tibia del fémur. Recorte ambas puntas de cada hueso con una hoja de afeitar.
  7. Enjuague el contenido de la médula ósea con 3 ml de PBS (con 4% de FBS) utilizando una aguja de 23 G unida a una jeringa de 3 ml y recoger el contenido en un tubo de centrífuga de 15 mL. Pasar la suspensión de células al menos 10 veces a través de la aguja para hacer una suspensión de células individuales.
  8. superponer cuidadosamente la suspensión de células en un volumen igual de medio de separación de linfocitos (3 ml) sin perturbar la interfaz entre la suspensión de células y medio de separación de linfocitos. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a temperatura ambiente.
  9. Recoger cuidadosamente la capa leucocitaria sin molestar a las otras capas y la transferencia en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml.

3. Preparación de las propagaciones de metafases celulares

  1. Añadir 10 ml de PBS al tubo que contiene la capa leucocitaria.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
  3. Retirar con cuidado el sobrenadante. Luego romper tél célula de pellets, sacudiendo ligeramente y añadir 10 ml de PBS.
  4. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular, romper la pastilla, y añadir 4 ml de solución de cloruro de potasio 0,075 M hipotónica pre-calentado. Añadir gota a gota solución hipotónica con agitación constante suave.
  6. Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C en una baño de agua.
  7. Después del tratamiento hipotónico añadir un volumen equivalente (4 ml) de fijador (metanol: ácido acético glacial, 3: 1 v / v) en el tubo de 15 ml y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo.
  8. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
  9. Romper el sedimento celular de la función tocar seguido de vórtice suave durante unos segundos y añadir 3 ml de solución de fijación gota a gota con agitación constante.
  10. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente y centrifugar a 400 xg durante 5 min.
  11. Eliminar el sobrenadante, romper el sedimento celular con gentLe tapping, y añadir 3 ml de fijador.
  12. Centrifugar a 400 g durante 5 min a temperatura ambiente, y se elimina el sobrenadante. Romper el sedimento celular con golpecitos suaves, frescos y añadir 3 ml de fijador.
  13. Repita el paso 3.12 dos veces más.
  14. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente, y eliminar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. A continuación, añadir 400 a 600 l fijador y mezclar bien con la pipeta.
  15. Caída de 30 l células fijadas sobre portaobjetos previamente limpiados y húmedas inclinadas en un ángulo de 45 ° y permitir que los portaobjetos se sequen al aire por completo durante la noche.

4. ratón cromosoma pintura de mFISH

  1. La desnaturalización de cromosomas
    1. Colocar la placa que contiene los diferenciales de células en metafase en 2x SSC durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    2. Deshidratar la corredera por lavado de etanol de serie de 2 min cada uno en 70%, 80% y 100%. Incubar durante 60 minutos a 65 ° C.
    3. solución de desnaturalización 40 ml de precalentamiento (70% formamida / 2x SSDO; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) en un tarro Coplin vidrio para 30 min. Desnaturalizar cromosomas incubando el portaobjetos en solución de desnaturalización pre-calentado por 1 - 1,5 min.
    4. Se detiene inmediatamente deslice en helado de etanol al 70% durante 2 min para detener el proceso de desnaturalización, así como para evitar que los cromosomas desnaturalizados de re-recocido. Entonces deshidratar por lavado con 80% de etanol durante 2 min. Repetir el lavado con etanol con etanol al 100% durante 2 min. Completamente seco el portaobjetos a temperatura ambiente.
  2. Desnaturalización e hibridación de la sonda de mezcla
    1. Centrifugar brevemente la mezcla de sonda suministrado por el fabricante, la transferencia de 10 l de mezcla de sonda en un 500 l complemento tubo de centrífuga de casquillo, y desnaturalizar por incubación a 80 ° C (± 2 ° C) en un baño de agua durante 7 minutos.
    2. Coloque el tubo de centrífuga con la mezcla de sonda en un baño de agua a 37 ° C durante 10 minutos.
    3. Aplicar la mezcla de sonda desnaturalizada en el portaobjetos con chromoso desnaturalizadaMES.
    4. cubrir cuidadosamente el área con una x 18 mm cubreobjetos de vidrio de 18 mm y eliminar las burbujas de aire visibles presionando suavemente la hoja de la cubierta se deslice. Sellar los cuatro lados de la hoja de la cubierta con cemento de goma y se incuba durante 12 h a 16 h en la oscuridad a 37 ° C en una cámara húmeda para la hibridación.
  3. Lavado post hibridación y detección
    1. Retirar con cuidado el cemento de caucho y la hoja de la cubierta.
    2. Colocar el portaobjetos en SSC 0,4x previamente calentada a 74 ° C (± 2 ° C) durante 5 min.
    3. diapositiva de lavado en solución de lavado II (4x SSC / 0,1% de Tween-20) durante 2 min.
    4. Colocar 20 l de anti-fade medio de montaje con DAPI de contraste (1,5 mg / ml) y cubrir con un cubreobjetos de vidrio. Presione suavemente el cubreobjetos con el tejido de laboratorio para eliminar las burbujas de aire y solución de montaje exceso. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas.
    5. Ver diapositivas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros adecuados.

    5. El cariotipo espectral (SKY) de cromosomas de ratón

    1. La desnaturalización de la sonda y el cromosoma
      1. Equilibrar diapositiva en 2x SSC a temperatura ambiente durante 2 minutos, sin agitar.
      2. Deshidratar diapositivas en una serie de etanol (70%, 80% y 100% de etanol) durante 2 min cada uno a temperatura ambiente. El aire seco de la corredera para eliminar el etanol por completo.
      3. solución caliente 40 ml de desnaturalización (70% de formamida / SSC 2x; pH 7,0) en un tarro Coplin vidrio para 30 min.
      4. Incubar portaobjetos en solución de desnaturalización pre-calentado por 1 a 1,5 min.
      5. Inmediatamente sumerja la diapositiva en helado de etanol 70% durante 2 min para detener el proceso de desnaturalización, así como para evitar que los cromosomas desnaturalizados de re-recocido.
      6. Deshidratar la diapositiva colocándolo en 80% de etanol durante 2 min y luego en 100% de etanol durante 2 min a temperatura ambiente.
      7. Desnaturalizar la sonda SKY (vial # 1, suministrado por el fabricante) en un baño de agua a 80 ° C (± 2 ºC)durante 7 minutos y, a continuación, colocar inmediatamente en un baño de agua diferentes establecido en 37 ° C durante 10 minutos.
    2. sonda de hibridación
      1. Añadir 10 l de sonda desnaturalizada SKY en los cromosomas desnaturalizados.
      2. Con cuidado, coloque un joven de 18 mm x 18 mm cubreobjetos de vidrio en la sonda cielo para que no queden burbujas de aire atrapadas bajo el cubreobjetos.
      3. Sellar los bordes del cubreobjetos con cemento de goma.
      4. Colocar el portaobjetos en una cámara a prueba de luz húmeda y se incuba en la oscuridad a 37 ° C durante 24 h a 36 h.
    3. Post-hibridación de lavado y detección por fluorescencia
      1. Retire el cemento de goma con mucho cuidado sin perturbar el cubreobjetos.
      2. Colocar el portaobjetos en la solución de lavado rápido precalentado (SSC 0,4x) a 72 ° C (± 2 ° C) durante 5 minutos con agitación constante. Sumergir diapositiva en solución de lavado III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) y se incuba durante 1 min con agitación.
      3. Opcional: Añadir 80 l de reactivo de bloqueo(Vial # 2 suministrada por el fabricante) a la zona de la hibridación, coloque una 24 mm x 60 mm cubreobjetos de plástico, y se incuba en la oscuridad a 37 ° C durante 30 min en una cámara humidificada.
      4. Retire con cuidado el cubreobjetos de plástico y lavar el portaobjetos con (45 ºC) solución de lavado precalentado durante 5 minutos III.
      5. Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5 (vial nº 3 suministrado por el fabricante), coloque una de 24 mm x 60 mm cubreobjetos de plástico, y se incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 40 minutos en una cámara húmeda.
      6. Sumergir el portaobjetos en una jarra Coplin de vidrio que contiene precalentado (45 ° C) solución de lavado III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) y se incuba a 45 ° C en un baño de agua durante 2 minutos con agitación. Repita este paso de lavado 3 veces.
      7. Aplique 80 l de reactivo de tinción Cy5.5 (vial # 4 suministrado por el fabricante), coloque una de 24 mm x 60 mm cubreobjetos de plástico, y se incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 40 minutos en una cámara húmeda.
      8. Lavar el portaobjetos 3 veces con pre-calentado (45 ºC) solución de lavado III.
      9. Mantenga la corredera en una posición inclinada contra una toalla de papel para drenar el exceso de líquido. Añadir 20 l de reactivo anti-fade DAPI (vial # 5 suministrado por el fabricante) y coloque un 24 mm x 60 mm cubreobjetos de vidrio sin introducir burbujas de aire. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y observar con un microscopio de epifluorescencia equipado para la captura de imágenes del cielo.

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Representative Results

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la irradiación de todo el cuerpo causa una serie de aberraciones cromosómicas en las células de médula ósea de ratones irradiados. El protocolo actual está optimizado para detención de la mitosis in vivo de células de médula ósea después de exposición a la radiación, de la cosecha de células de médula ósea de las patas traseras de los ratones irradiados, el aislamiento de células mononucleares de médula ósea por centrifugación en gradiente de densidad, la preparación de los diferenciales de células en metafase, y la subsiguiente detección de aberraciones cromosómicas estables inducidos por la radiación mediante técnicas mFISH y el cielo. Cromosoma pintura utilizando estas técnicas se pueden utilizar para detectar y evaluar el riesgo de diversas condiciones fisiopatológicas.

La figura 1 muestra de células en metafase representante extiende con pares-1 normales y aberrantes de cromosomas de ratón, -2, y -3. La figura 2 muestra cariotipo espectral de cromosomas normales y anormales en metafase ratón.Estos resultados muestran que la radiación ionizante induce la inter-aberraciones cromosómicas estables en las células de médula ósea murina que proliferan, que se compone principalmente de las células madre y progenitoras que son responsables de auto-renovación y diferenciación en diversos tipos de células. alteraciones citogenéticas en células madre y progenitoras se han demostrado asociarse con diversas enfermedades clínicas, incluyendo el cáncer, y se considera que son los predictores más fuertes de gravedad de la enfermedad y la supervivencia global. Por lo tanto, es lógico inferir que ionizante aberraciones cromosómicas estables entre inducidas por la radiación puede causar un mayor riesgo de desarrollo de cáncer.

Figura 1
Figura 1: Efecto de la radiación en células de médula ósea de un ratón irradiado como se detecta por mFISH. A y B muestran una propagación de células en metafase ratón con pares normales de chromosome-1 (rojo), cromosoma 2 (verde), y el cromosoma-3 (aqua). Todos los demás cromosomas se contratiñeron con DAPI (azul). C muestra la aberración estable que compromete el cromosoma-1, una parte del cromosoma 1 se ha integrado en un cromosoma no pintada (DAPI), mientras que otra parte se ha formado un fragmento de acéntrico. D muestra una parte de una parte del cromosoma-2 se ha integrado en el cromosoma no pintado. E representa la aberración estable que compromete el cromosoma-3. F muestra una aberración estable que participaron los tres cromosomas pintados. puntos de quiebre y los cruces de color se indican con flechas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: efecto de la radiación sobre el hueso MarrLas células flujo de ratón irradiados como se detecta por SKY. El panel superior muestra un cariotipo espectral normal (SKY) de C57BL / 6 hembra de ratón. El panel central muestra una aberración estable que compromete el cromosoma-4 y el cromosoma-12. El panel inferior muestra ratón cariotipo espectral con una aberración cromosómica estable que compromete el cromosoma-7 y el cromosoma-10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Varios pasos críticos determinan el éxito de mFISH y SKY. El primero y más importante paso es optimizar el tratamiento con colchicina para la detención mitótica en vivo de las células mononucleares de médula ósea. El tiempo de concentración de la colchicina y el tratamiento de forma individual o en conjunto determinan el índice mitótico, así como el cromosoma condensación de dos requisitos importantes para la pintura cromosoma eficaz. Un tiempo de tratamiento alta concentración de colchicina o más largo conduce a cromosomas altamente condensadas, incompatibles para la desnaturalización y la hibridación adecuada. Por otra parte, la identificación precisa de las reorganizaciones del complejo en una célula de propagación de metafase con cromosomas condensados ​​no es una tarea fácil de lograr. administración intra-peritoneal de 100 l 0,05% colchicina durante 2 h en un ratón con un peso corporal entre 22 y 26 g produce un número suficiente de células en metafase para untar con cromosomas condensados ​​moderadamente. El segundo paso crítico es el tratamiento hipotónico.El volumen, tiempo de tratamiento, y la temperatura de la morfología cromosómica influencia solución hipotónica y difusión de cromosomas en el portaobjetos de vidrio. Un tratamiento hipotónico para un período de tiempo más corto o a una temperatura subóptima puede prevenir el cromosoma adecuada difusión, lo que resulta en la celda propagación de metafase con cromosomas solapadas. Superposición de cromosomas interfiere con el de aguas abajo en el proceso de hibridación in situ, la especificidad de las señales fluorescentes, y la identificación adecuada de los reordenamientos.

En tercer lugar, la fijación de post-hipotónica es un paso importante para evitar la formación de agregado celular. El fijador se debe agregar lentamente por el lado del tubo de centrífuga con constante agitación suave para obtener una suspensión de células individuales. De lo contrario, los diferenciales de células en metafase se quedan atrapados en las matas y el cromosoma difusión se verá comprometida. Sin embargo, el cromosoma difusión también depende del tipo de células, la temperatura y la humedad relativa a la tiempo de dejar caer la suspensión de células en portaobjetos de vidrio. Un estudio anterior de Spurbeck informó que para los linfocitos, una humedad relativa del 60% y un resultado de temperatura C 20 ° en una mayor área de la metafase 18. Además, la duración de secado es también un paso crítico para el cromosoma óptima difusión. De células en metafase se propaga seco que producen demasiado rápido diferenciales estrechos con muchos cromosomas superpuestas, mientras que los resultados de secado muy lento en metafase roto cromosoma 18. Sin embargo, Deng mostró que el cromosoma propagación principalmente depende de la humedad relativa para una variedad de células cultivadas 19. El cuarto paso es importante para optimizar el tiempo de desnaturalización cromosoma. Un tiempo de desnaturalización más largo y más corto afecte negativamente a la hibridación de la sonda. Ya no provoca la desnaturalización cromosomas "hinchados", mientras que la desnaturalización más corto impide la interacción de la sonda a los cromosomas. Otra forma de reducir el cromosoma "hinchazón" es a portaobjetos de edad durante la noche a temperatura ambiente seetapa de desnaturalización plano. Las diapositivas no se utilizan para el pintado cromosómico de inmediato, se pueden almacenar indefinidamente en un desecador a -20 ºC. tiempo Cromosoma desnaturalización necesita ser estandarizada con la edad de deslizamiento, la cantidad de citoplasma alrededor de los diferenciales de células en metafase, y la humedad a la que se retiraron las células sobre los portaobjetos. Sonda de desnaturalización e hibridación también es importante para el éxito de la pintura cromosoma. La exposición directa de sondas a la luz brillante se debe evitar, de manera que la señal fluorescente no pierde intensidad de la señal.

Está bien establecido que mFISH y SKY son poderosas técnicas para detectar aberraciones cromosómicas entre estables. Cualquier reordenamientos así como la pérdida o ganancia de cromosomas pintadas pueden ser fácilmente identificados por estos dos métodos. Sin embargo, la detección de los intercambios intra-cromosómicas de los brazos y entre los brazos no sean posibles mediante estas técnicas. Identificación de los intercambios intra-cromosómicas de los brazos y entre brazos ahora han llegado a ser posible becauso del desarrollo de los cromosomas, respectivamente, sondas FISH multicolor específicos de un brazo y sondas FISH mBAND. Un estudio previo sobre los ex trabajadores del sector nuclear ha demostrado que el análisis mBAND es una poderosa herramienta para identificar las firmas únicas de daño por radiación 20. Por otra parte, la identificación de intercambio de cromátidas hermanas, un rasgo característico de daño de la radiación 21, no es posible por estas técnicas. Además, tanto mFISH y SKY han capacidad de pintar la región centromérica de los cromosomas, lo que puede resultar en la puntuación errónea del cromosoma dicéntrico como translocación limitado. también las técnicas no son adecuadas para la identificación de la localización exacta del punto de ruptura de translocación. Además, las señales fluorescentes no se pueden conservar de forma permanente, intensidad de la señal disminuye con el tiempo, y la pintura cromosoma fluorescente no es adecuado para el análisis mediante un sistema automatizado. Sin embargo, la intensidad de la señal fluorescente se puede conservar durante un período de tiempo más largo mediante el almacenamiento de deslizadoES en el congelador.

Se han desarrollado dos métodos mejorados de pintado cromosómico para superar las limitaciones de mFISH y SKY: respectivamente, el pintado cromosómico no fluorescente 22 y color espectral bandas (SCAN) 23. Las ventajas de la pintura cromosoma no fluorescente utilizando el peroxidasa / diaminobencidina (DAB) sobre la pintura FISH incluyen la identificación exacta de la región centromérica, la identificación de reordenamiento cromosómico mediante microscopio de campo claro, y esa señal no fluorescente se conserva de forma permanente y análisis de imágenes puede ser automatizado. Por otro lado, el SCAN es ventajoso sobre el cielo, porque las sondas de análisis se preparan a partir de secuencias de ADN genómico de banda específica para un cromosoma específico y, por tanto, pueden identificar con precisión el origen de un cromosoma de banda. SCAN también facilita la identificación de los intercambios intra-cromosómicas. Teniendo en cuenta los beneficios de las técnicas mejoradas, éstos deben ser considerados para su uso rutinario in la prueba citogenética clínica. Sin embargo, la preparación de sondas de la secuencia de ADN genómico de banda específico para cada pares de cromosomas es técnicamente difícil y limita su uso en la citogenética molecular.

La determinación de si la diferencia entre los grupos de tratamiento es estadísticamente significativo o no es otro aspecto importante de la citogenética molecular. Criterios de puntuación, como el número de células en metafase para untar contadas, número de animales utilizados en cada grupo de tratamiento, el número de cromosomas por célula propagación de metafase durante el análisis, la nomenclatura utilizada para clasificar las aberraciones observado después de la pintura de cromosomas, etc. desempeñar un papel crítico en la determinación de la incertidumbre estadística entre los grupos de tratamiento. A pesar de que varios laboratorios tienen criterios de puntuación propietarias, la puntuación de 100 a 300 y 20 células en metafase para untar con 40 cromosomas bien separados en al menos 3 a 5 ratones se recomienda generalmente para determinar la significación estadística en mFISH y anal SKYanalysis, respectivamente, 24, 25. Por otra parte, la elección de la nomenclatura utilizada para clasificar las aberraciones en los cromosomas pintados es un parámetro importante para evaluar estadísticamente la incertidumbre. Hay dos sistemas de nomenclatura populares en uso para describir las aberraciones detectadas por las sondas enteros cromosoma pintura: (1) S & S método de clasificación por Savage y Simpson 26, 27 y (2) la nomenclatura PAINT por Tucker et al. 28. Cada sistema se basa en diferentes requisitos previos para la clasificación de aberraciones cromosómicas estructurales y tiene sus propias ventajas y desventajas. El sistema S & S es principalmente adecuado para la interpretación mecanicista de origen aberración, mientras que la pintura ofrece una descripción de los patrones anormales de pintura. Los estudios realizados por Knehr et al. en aberraciones cromosómicas inducidas por la radiación en los cromosomas de FISH pintado indican que el método PAINT, como el sistema S & S, también se puede utilizar para determinar el origen de aberración con algunos MODIFICACION en los criterios de puntuación y sería más útil para la aplicación práctica 29.

Ambos métodos mFISH y el cielo tienen sus propias limitaciones. Por ejemplo, permite mFISH de puntuación rápida con poco entrenamiento, sin embargo, que no analiza todos los cromosomas para medir la frecuencia de aberraciones y revela únicamente la frecuencia de aberraciones parcial, dependiendo del número de cromosomas pintados utilizados en el estudio. Sin embargo, una fracción de los intercambios totales observados por la pintura todo el cromosoma se puede estimar mediante la fórmula postulado originalmente por Lucas et al. 30 y modificado adicionalmente por Braselmann et al. 31. Esta fórmula matemática considera el intercambio entre los cromosomas pintados y entre los cromosomas pintados y contrastados. Por ejemplo, sea f p representan la suma fraccional del genoma cubierto por los cromosomas pintados 1 (1 f), 2 (f 2) y 3 (f 3), where f 1 = 0,0696, f 2 = 0,0649, y f 3 = 0,0570, los valores representan el contenido genómico de los cromosomas individuales en ratones hembra. Por lo tanto, f p = (f1 + f2 + f3) = 0,192 y la fracción se convierte a contratinción (1 - f p) = 0,808. La frecuencia de los intercambios afectan a los cromosomas pintados y contrastados (F P) se puede calcular fácilmente por el producto vectorial de la expansión binomial (p + q) 2 = p 2 + 2pq + q 2, en donde p = f p y q = (1 - f p). Por lo tanto, F P = 2pq = 2f p (1 - f p) = 0,310, lo que significa 31% de los intercambios cromosómicas son observables después de pintar el cromosoma-1 de ratón, -2, y -3. Por lo tanto, 1 / 0,31 = 3,23 células necesitan ser anotado para igualar una células en metafase en bandas o un equivalente de todo el genoma. Por otra parte, tanto mFISH y SKY han limitado la capacidad de SPECIFcamente identificar qué genes y puntos de ruptura están involucrados en la formación de aberración y también para detectar pequeñas duplicaciones, inversiones, y deleciones.

La aplicación de mFISH y análisis SKY no se limita a la investigación básica. Tanto regularmente están siendo utilizados en los estudios clínicos. Estas técnicas también se han aplicado a diagnóstico prenatal y postnatal, la evaluación de riesgos, y la identificación de diversos tipos de cáncer. Por otra parte, tanto las técnicas se pueden utilizar para pintar cromosomas en interfase. Sokolova utiliza mFISH pintar cromosomas en interfase por primera vez 32. Estas técnicas también se utilizan para la estimación de la dosis después de la irradiación y la evaluación del riesgo en seres humanos después de la exposición accidental o intencionada a la radiación 11, 33 ionizante. Por lo tanto, el análisis del genoma parcial o total por mFISH o SKY, respectivamente, son herramientas útiles para detectar aberraciones cromosómicas entre estables para varios estudios.

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Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por Arkansas Consorcio de Becas Espaciales y el Instituto Nacional de Investigación Biomédica Espacial a través de Aeronáutica y del Espacio Nacional, otorga NNX15AK32A (RP) y RE03701 (MH-J), y P20 GM109005 (MH-J), y la Administración de Veteranos de los Estados Unidos ( MH-J). Agradecemos a Christopher Fettes, Coordinador del Programa para el Departamento de Medio Ambiente y Salud Ocupacional de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas, por su asistencia editorial en la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados
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Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

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