Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama doi: 10.3791/55162 Published: January 11, 2017

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan çalışmaları Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde gerçekleştirilmiştir. hayvan protokolü Arkansas Tıbbi Bilimler Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. temiz hava ve standart kemirgen yiyecek ve suya serbest erişim 15 saatlik döngüler - Bütün hayvanlar 10 ile 20 ± 2 ° C'de standart klimalı hayvan tesis altında tutuldular. Girişte, fareler 1 hafta karantinada tutulan ve sertifikalı kemirgen yemi verilmiştir.

1.Radiation Pozlama ve Metafaz Hücreler Vivo Arrest olarak

  1. Açığa bir ışınlama odasında 2 Gy tüm vücut radyasyona fareler un-anestezi. ışınlama sırasında, iyi havalandırılan bir tutma odasında yer fareler serbestçe hareket ve düzgün bir doz almıyorsunuz emin olmak için.
  2. % 0.05 kolşisin solüsyonu 100 mcL enjekte edilir (ckalsiyum ve magnezyum serbest PBS içinde çözülmüş olchicine toz) karın içinden 1 ml tek kullanımlık şırınga ile eklenmiş 25 G iğne kullanılarak. herhangi bir organ doğrudan enjeksiyon kaçının.
  3. kemik iliği hücre hasat önce 2 saat için hücre hayvan bırakın. ağrı veya sıkıntı herhangi bir işaret için hayvan gözlemleyin.

2. kemik iliği hücre hasat ve yoğunluk dereceli santrifüj ile kemik iliği Mononükleer Hücreleri İzolasyon

  1. CO 2 boğulma fare Euthanize.
  2. dorsal ve ventral tarafta% 70 etanol püskürtün.
  3. keskin bir makas ile karın derisi üzerinde 2 cm kesi olun. künt cımbız ile kesi her iki tarafında cilt tutun ve yavaşça karın kasları çekerek açın.
  4. makasla her iki arka bacaklarını kesti ve hemen% 4 FBS ile önceden soğutulmuş PBS koyun.
  5. Dikkatle keskin bir jilet ve pamuk gazlı bez bandaj ile arka bacak bağlı tüm kasları temizleyin.
  6. femur tibia ayırın. Bir traş bıçağı ile her kemiğin her iki ipuçları Trim.
  7. 3 ml'lik bir şınngaya bağlanmış bir 23 G iğne kullanılarak (% 4 FBS), 3 ml PBS ile kemik iliği muhtevasını temizlemek ve 15 ml santrifüj tüpüne içerik toplamak. tek bir hücre süspansiyonu yapmak için iğne ile hücre süspansiyonu en az 10 kez geçmek.
  8. Dikkatle hücre süspansiyonu ve lenfosit ayırma ortamı arasındaki arayüzü bozmadan lenfosit ayırma ortamı (3 mL) ve eşit hacimde hücre süspansiyonu kaplar. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  9. yeni bir 15 ml santrifüj tüpüne diğer katmanları ve transfer bozmadan dikkatlice buffy coat toplayın.

Metafaz Hücre Spread 3. hazırlanması

  1. ince beyaz tabakayı içeren bir tüpe 10 ml PBS ilave edin.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  3. Dikkatle süpernatant kaldırmak. Sonra t break upo nazik dokunarak ile pelet hücre ve 10 ml PBS ekleyin.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  5. Hücre pelletini bozmadan süpernatantı pelet kırmak ve önceden ısıtılmış hipotonik 0.075 M potasyum klorür çözeltisi 4 ml. Nazik sabit sallayarak damla hipotonik solüsyon damla ekleyin.
  6. Bir su banyosu içinde 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe hücreleri.
  7. (: Buzlu asetik asit, 3: metanol 1 h / h) hipotonik tedaviden sonra, sabitleyici eşit hacimde (4 mL) ekleyin 15 ml bir tüp içinde ve tersini tüp yavaşça karıştırın.
  8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve supernatant atın.
  9. bir kaç saniye için hafifçe girdap ardından kılavuz çekme ile hücre pelletini parçalamak ve sabit şekilde çalkalanarak damla sabitleyici çözeltisi damla 3 ml.
  10. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj.
  11. Süpernatantı gent ile hücre pelet kırmakle dokunarak ve 3 ml taze fiksatif ekleyin.
  12. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve supernatant çıkarın. nazik dokunarak hücre pelet kadar Break ve taze 3 ml fiksatif ekleyin.
  13. Adımı yineleyin 3.12 kez daha fazla.
  14. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve hücre topağı bozmadan supernatant çıkarın. Ardından 600 uL fiksatif ile 400 ekleyebilir ve pipetleme ile iyice karıştırın.
  15. 45 ° açıyla eğimli ön temizlenir ve ıslak slaytlar üzerine 30 ul sabit hücrelerin damla ve tamamen bir gecede havada kurumaya slaytlar izin verir.

mFISH tarafından 4. Fare Kromozom Boyama

  1. kromozom denatürasyonu
    1. Oda sıcaklığında 2 dakika için 2X SSC metafaz hücre yayılır içeren slayt yerleştirin.
    2. % 70 2 dakika her biri,% 80 ve% 100, seri etanol yıkanarak slayt kurutmak. 65 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Ön ısıtma 40 ml denatürasyon çözeltisi (% 70 formamid / 2 x SS° C; 30 dakika boyunca, bir cam kavanoz içinde Coplin 70 ° C (± 2 ° C), pH 7.0). 1.5 dakika - 1 için önceden ısıtılmış denatürasyon çözeltisi slayt inkübe edilerek kromozom denatüre.
    4. 2 dakikalık denatürasyon işlemini durdurmak için hem de yeniden tavlama ile ilgili denatüre kromozom önlemek için buz soğukluğunda% 70 etanol içinde hemen slayt söndürün. Daha sonra 2 dakika süreyle% 80 etanol ile yıkanarak dihidrat. 2 dakika boyunca% 100 etanol ile etanol yıkama tekrarlayın. Tamamen oda sıcaklığında slayt kurulayın.
  2. Denatürasyon ve Probe Karışımı Hibridizasyon
    1. Kısaca, üretici tarafından sağlanan prob karışımı santrifüj, 7 dakika boyunca bir su banyosu içinde 80 ° C (± 2 ° C) inkübe edilerek kap santrifüj tüpü ek 500 mcL prob karışımı 10 ul transfer ve denatüre.
    2. 10 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosu içinde prob karışımı ile santrifüj tüpü yerleştirin.
    3. denatüre chromoso ile slayt üzerine denatüre prob karışımı uygulayınmes.
    4. Dikkatle 18 mm x 18 mm cam kapak slip ile alanı kapsayacak ve çok yavaşça kaymasına kapak kayma basarak herhangi bir görünür hava kabarcıklarını ortadan kaldırır. Kauçuk çimento ile kapak kayma dört tarafı kapatın ve hibridizasyon için nemli bir oda içinde 37 ° C'de karanlıkta, 16 saat, 12 saat süre ile inkübe edilir.
  3. Mesaj Hibridizasyon Yıkama ve Algılama
    1. Dikkatle kauçuk çimento ve kapak kayma çıkarın.
    2. 5 dakika boyunca 74 ° C (± 2 ° C) önceden ısıtılmış 0.4x SSC yeri slayt.
    3. 2 dakika boyunca yıkama çözeltisi II (4x SSC /% 0.1 Tween-20) yıkayın kayar.
    4. DAPI karşıt (1.5 ug / mL) ile anti-solmaya montaj orta 20 mcL ve bir cam kapak ile kaplayın. hafifçe laboratuvar dokusu ile lamel basın hava kabarcıkları ve aşırı montaj çözüm kaldırmak için. oje ile lamel kenarları mühür.
    5. uygun filtreler ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak Görünüm slaytlar.

    5. Spektral Karyotipleme Fare Kromozomlar (SKY)

    1. Kromozom ve Probe denatürasyonu
      1. çalkalamadan, 2 dakika süre ile, oda sıcaklığında 2 x SSC, slayt dengelenmesi.
      2. Oda sıcaklığında 2 dakika her biri için, bir etanol seri slayt (% 70,% 80 ve% 100 etanol) kurutmak. Tamamen etanolü çıkarmak için slayt hava-kurutun.
      3. Sıcak 40 ml denatürasyon çözeltisi (% 70 formamid / 2 x SSC, pH 7.0), 30 dakika için bir cam Coplin kavanoz.
      4. 1 ila 1.5 dakika süreyle önceden ısıtılmış denatürasyon çözeltisi slayt inkübe edin.
      5. 2 dk denatürasyon işlemini durdurmak için hem de yeniden tavlama gelen denatüre kromozom önlemek için hemen buz gibi soğuk% 70 etanol içine slayt batırmayın.
      6. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca% 100 etanol içinde, daha sonra 2 dakika süreyle% 80 etanol içine yerleştirerek ve slayt kurutmak.
      7. 80 ° C (± 2 ° C) ayarlanmış bir su banyosu içinde sky prob (üretici tarafından sağlanan flakon # 1) denatüre7 dakika boyunca, ve sonra hemen, 10 dakika boyunca 37 ° C'ye kadar, farklı bir su banyosuna yerleştirin.
    2. Probe Melezleme
      1. denatüre kromozomlar üzerine denatüre SKY probu 10 mcL ekleyin.
      2. hava kabarcıkları lamel altında sıkışıp böylece dikkatle SKY prob üzerine 18 mm x 18 mm cam lamel yerleştirin.
      3. lastik çimento ile lamel kenarları mühür.
      4. nemli bir ışık geçirmeyen bölme slayt yerleştirin ve 36 saat, 24 saat boyunca 37 ° C'de karanlıkta inkübe edilir.
    3. Sonrası hibridizasyon yıkama ve floresans saptama
      1. lamel bozmadan çok dikkatli kauçuk çimento çıkarın.
      2. sabit şekilde çalkalanarak 5 dakika boyunca 72 ° C (± 2 ° C) önceden ısıtılmış, hızlı yıkama çözeltisi (0.4x SSC) içinde slayt yerleştirin. Yıkama çözeltisi III (4x SSC /% 0.1 Tween 20) içine slayt daldırın ve çalkalanarak 1 dakika inkübe edilir.
      3. İsteğe bağlı: engelleme reaktif 80 uL ekleyinmelezleşme alanı üzerine (üretici tarafından sağlanan flakon # 2), 24 mm x 60 mm plastik lamel ve nemlendirilmiş odacıkta 30 dakika boyunca 37 ° C'de karanlıkta inkübe edilir.
      4. Yavaşça plastik lamel kaldırmak ve 5 dakika boyunca önceden ısıtılmış (45 ºC) yıkama solüsyonu III slayt yıkayın.
      5. 80 uL Cy5 boyama reaktif (üretici tarafından sağlanan flakon # 3) uygulanır, 24 mm x 60 mm plastik lamel ve nemlendirilmiş bir odada 40 dakika süreyle karanlıkta 37 ° C'de inkübe edin.
      6. içeren bir cam Coplin kavanoza slayt Dip önceden ısıtılmış (45 ° C) yıkama çözeltisi III (4x SSC /% 0.1 Tween 20) ile çalkalanarak 2 dakika için bir su banyosu içinde 45 ° C'de inkübe edin. Bu yıkama adımı 3 kez tekrarlayın.
      7. 80 uL Cy5.5 boyanması reaktifi (üretici tarafından sağlanan flakon # 4) uygulanır, 24 mm x 60 mm plastik lamel ve nemlendirilmiş bir odada 40 dakika süreyle karanlıkta 37 ° C'de inkübe edin.
      8. (Önceden ısıtılmış ile slayt 3 kere yıkayın45 ºC) yıkama solüsyonu III.
      9. Fazla sıvıyı boşaltmak için bir kağıt havlu karşı eğik pozisyonda slayt tutun. 20 uL, anti-solmaya DAPI ayıracı (üretici tarafından sağlanan flakon # 5) ekleyin ve dikkatlice hava kabarcıklarını tanıtan olmadan 24 mm x 60 mm cam lamel yerleştirin. oje ile lamel kenarları mühür ve SKY görüntüleri yakalamak için donatılmış bir Epifloresans mikroskop ile gözlemlemek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Total vücut ışınlaması ışınlanmış farelerde kemik iliği hücrelerinde çok sayıda kromozom sapmaları neden olur. Mevcut protokolü radyasyona maruz kaldıktan sonra, kemik iliği hücreleri, in vivo mitotic durmanın için optimize edilmiştir, yoğunluk gradyanlı santrifüj metafaz hücre mamullerin hazırlanmasında, ve daha sonra ışınlanmış farelerde, kemik iliği tek çekirdekli hücreleri tecrit arka ayakları arasında kemik iliği hücrelerinin hasat mFISH ve SKY teknikleri ile radyasyona bağlı istikrarlı kromozomal anormalliklerin tespiti. Kromozom bu teknikler algılamak ve çeşitli patofizyolojik durumların riskini değerlendirmek için kullanılabilir kullanarak boyama.

Şekil 1 temsilci metafaz hücresi normal ve anormal fare kromozom çiftleri-1, -2, -3 ve yayılır gösterir. Şekil 2 normal ve anormal fare metafaz kromozom spektral karyotiplemesi gösterir.Bu sonuçlar, temel olarak iyonize radyasyon çeşitli hücre tiplerine kendini yenileme ve farklılaşması için sorumlu olan kök ve projenitör hücreleri oluşur çoğalan fare kemik iliği hücreleri, arası kromozomal stabil sapmaları indüklediğini göstermektedir. kök ve progenitör hücrelerde sitogenetik değişiklikler kanser olmak üzere çeşitli klinik hastalıkları ile ilişkilendirmek gösterilmiştir, ve hastalığın şiddetine ve genel sağkalım için en güçlü belirleyiciler olduğu kabul edilir. Nedenle, radyasyona bağlı stabil arası kromozomal anormallikler iyonlaştırıcı kanser gelişme riski neden olabileceğini anlaması mantıklı.

Şekil 1
Şekil 1: mFISH ile Saptanan gibi bir Işınlanmış Mouse Kemik İliği Hücrelerinin Radyasyonun etkisi. A ve B ch normal çiftleri ile bir fare metafaz hücresi yayılmasını gösterirromosome-1 (kırmızı), kromozom-2 (yeşil) ve kromozom-3 ​​(aqua). Diğer tüm kromozomlar DAPI (mavi) ile zıt olan. diğer bir kısmı, bir asentrik fragmanı oluşmuşken kromozom 1, kromozom-1'in bir parçası olmayan bir boya (DAPI) kromozomda entegre edilmiş kapsayan stabil sapmaları göstermektedir. D kromozom 2'nin bir parçasının bir parçası olmayan bir boya kromozomda entegre edilmiş olduğunu gösterir. E kromozom-3 içeren kararlı sapmayı temsil etmektedir. F üç boyalı kromozomu içeren istikrarlı bir sapmayı göstermektedir. Mola noktaları ve renk kavşak oklarla gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Kemik Marr Radyasyonun EtkisiSKY ile Saptanan olarak Işınlanmış Mouse akış hücreleri. üst panel C57BL / 6 dişi fare normal bir spektral karyotiplemesi (SKY) gösterir. orta panel kromozomu-4 ve kromozom-12 içeren istikrarlı bir sapmayı göstermektedir. alt panel kromozom-7 ve kromozom-10 içeren istikrarlı bir kromozom sapma ile fare spektral karyotiplemesi gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Birkaç kritik adımlar mFISH ve SKY başarısını belirler. İlk ve en önemli adım kemik iliği mononükleer hücrelerin in vivo mitotik tutuklama kolşisin tedavisi optimize etmektir. kolşisin konsantrasyonu ve tedavi süresi ayrı ayrı ya da konser etkili kromozom boyama mitotik indeksi yanı sıra kromozom yoğunlaşma iki önemli önkoşul belirler. Yüksek Kolşisin konsantrasyonu veya daha uzun tedavi süresi uygun denatürasyon ve hibridizasyon için uyumsuz son derece yoğun kromozom yol açar. Ayrıca, yoğunlaştırılmış kromozomlu yayılan bir metafaz hücrede kompleks düzenlenmeleri doğru tanımlanması elde etmek kolay bir iş değildir. 22 ve 26 g arasında bir vücut ağırlığına sahip bir farede, 2 saat boyunca 100 uL% 0.05 kolşisin intraperitoneal uygulanması metafaz hücrenin yeterli sayıda orta yoğunlaştırılmış kromozomlar ile yayılır üretir. İkinci kritik adım hipotonik bir tedavi yöntemidir.birim, tedavi süresi ve hipotonik bir solüsyon etkisi kromozom morfolojileri sıcaklığı ve cam slayt üzerine kromozom yayılmasını. kısa bir süre için ya da bir alt-optimal sıcaklıkta bir hipotonik tedavi çakışan kromozomlar ile yayıldı metafaz hücrede sonuçlanan yayılmasını uygun kromozom önleyebilir. Kromozom örtüşen in situ hibridizasyon işlemi, floresan sinyallerin özgüllük ve düzenlenmeleri uygun tanımlanmasında aşağı engeller.

Üçüncüsü, post-hipotonik tespit hücre tutam oluşumunu önlemek için önemli bir adımdır. sabitleştirici yumuşak sabit, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için çalkalanarak bir santrifüj tüpüne tarafında aşağı yavaş yavaş eklenmesi gerekmiştir. Aksi takdirde, metafaz hücre yayılır yığınlarda tuzağa olacak ve kromozom tehlikeye olacak yayılıyor. Bununla birlikte, aynı zamanda yayılan kromozom t, hücre tipi, sıcaklık ve bağıl nem bağlıdırcam slaytlar üzerine hücre süspansiyonu bırakarak ime. Spurbeck tarafından bir önceki çalışmada bildirilen lenfositler için,% 60 bağıl nem ve yüksek metafaz alanında 18 bir 20 ° C sıcaklık sonucu. Buna ek olarak, kurutma süresi de optimum kromozom yaymak için kritik bir adımdır. Metafaz hücre kırık metafaz çok yavaş kuruyan sonuçları 18 kromozom ise kuru çok hızlı, çok örtüşen kromozomlu sıkı yayılır üretmek yayılır. Bununla birlikte, Deng, esas olarak yayılan kromozom kültürlenmiş hücrelerde 19 çeşitli nispi neme bağlı olduğunu göstermiştir. Dördüncü önemli adım kromozom denatürasyon süresini optimize etmektir. Daha uzun ve daha kısa denatürasyon süresi olumsuz prob hibridizasyon etkiler. kısa denatürasyon kromozomlarına prob etkileşimi engellemektedir süre daha denatürasyon, "kabarık" kromozom neden olur. Kromozom "Şişkinlik" azaltmak için başka bir yol, gece boyunca oda sıcaklığında yaşlanmaya slaytlara yapılmazön denatürasyon adımı. Kromozom boyama için kullanılmayan Slaytlar hemen -20 ° C'de bir kurutucuda süresiz olarak saklanabilir. Kromozom denatürasyon süresi slayt yaş, metafaz hücre yayılır etrafında sitoplazma miktarı ve hücreler slaytlar üzerine bırakılan hangi nem ile standardize edilmesi gerekmektedir. Probe denatürasyon ve hibridizasyon de başarılı kromozom boyama için önemlidir. Bu floresan sinyal sinyal yoğunluğu kaybetmek değil bu yüzden parlak ışığa problar doğrudan maruz kaçınılmalıdır.

MFISH ve SKY arası kromozomal kararlı sapmaları tespit etmek için güçlü teknikler olduğunu iyi bilinmektedir. Herhangi düzenlenmeleri yanı sıra kayıp veya boyalı kromozom kazanç kolayca bu iki yöntem ile tespit edilebilir. Bununla birlikte, içi kol arası kol kromozom değişimlerinin tespiti, bu teknikler ile mümkün değildir. içi kol ve inter-kol kromozomal değişim tanımlanması artık mümkün beca haline gelmiştirSırasıyla, kromozom kol özgü renkli FISH probları ve mBAND FISH probları geliştirilmesi kullanımı. Eski nükleer işçilere bir önceki çalışma mBAND analiz radyasyon hasarı 20 benzersiz imzaları belirlemek için güçlü bir araç olduğunu göstermiştir. Ayrıca, kardeş kromatid değişiminin tespiti, radyasyon hasarı 21 karakteristik bir özelliği, bu teknikler ile mümkün değildir. Buna ek olarak, mFISH ve SKY hem translokasyon olarak disentrik kromozomun hatalı puanlama neden olabilir kromozomların sentromer bölgesini, boya yeteneği sınırlıdır. teknikler translokasyon tesisinin kesme lokalizasyonunu belirlemek için uygun değildir. Buna ek olarak, floresan sinyalleri sürekli korunamaz, sinyal yoğunluğu zamanla azalır, ve flüoresan kromozom boya otomatik bir sistem ile analiz için uygun değildir. Bununla birlikte, flüoresan sinyal yoğunluğu kaydırılabilir depolayarak daha uzun bir süre muhafaza edilebilirDondurucuda es.

Kromozom boyama İki geliştirilmiş yöntemler mFISH ve SKY sınırlamaları aşmak için geliştirilmiştir: sırasıyla floresan olmayan kromozom boyama 22 ve spektral renk (TARAMA) 23 bantlama. BALIK resim üzerinde peroksidaz / diaminobenzidin (DAB) ile floresan olmayan kromozom boyama avantajları doğru sentromerik bölgenin belirlenmesi, parlak alan mikroskobu ile kromozomal düzenlenmesi tanımlanmasını ve bu kalıcı korunur olmayan floresan sinyal ve görüntü analizi yapabilir dahil otomatikleştirilebilir. TARAMA Probes, belirli bir kromozom şerit özel genomik DNA dizileri hazırlanır ve böylece, doğru kromozom bant kaynağını belirlemek çünkü, diğer yandan, TARAMA gökyüzünde avantajlıdır. TARAMA da içi kromozomal değişim belirlenmesini kolaylaştırır. gelişmiş tekniklerin yararları göz önüne alındığında, bu rutin kullanım i düşünülmelidirn klinik sitogenetik testler. Bununla birlikte, her bir kromozom çiftinin şerit özel genomik DNA dizisinden sondaların hazırlanması, teknik açıdan zor olan ve moleküler sitogenetik kullanımını sınırlar.

tedavi grupları arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirleme moleküler sitogenetik bir başka önemli yönüdür. Böyle metafaz hücre sayısı gibi Puanlama kriterleri, tedavi grubu, analiz sırasında yayılan metafaz hücre başına kromozom sayısı başına kullanılan hayvan sayısı, isimlendirme vb kromozom boyama sonra gözlenen sapmaları sınıflandırmak istatistiksel belirsizliği belirlenmesinde kritik bir rol oynamak için kullanılan, sayılır yayılır tedavi grupları arasında. Çeşitli laboratuvarlar özel puanlama kriterleri, hücre, en az 3-5 farelerde 40 iyi ayrılmış kromozomlar ile yayılır 100 metafaz 300 ve 20 gol olmasına rağmen genel olarak mFISH ve SKY anal istatistiksel anlamlılık belirlemek için tavsiye edilirSalman kararı, 24, 25. Ayrıca, boyalı kromozomlardaki sapmaları sınıflandırmak için kullanılan terminoloji seçimi istatistiksel belirsizliği değerlendirmek için önemli bir parametredir. Bütün kromozom boyama sondaları tarafından tespit edilen anormallikleri tanımlamak için kullanılıyor iki popüler isimlendirme sistemi vardır: (1) S & S Tucker ve ark Savage ve Simpson 26, 27 ve (2) BOYA terminoloji ile sınıflandırma yöntemi. 28. Her sistem Yapısal kromozomal anormalliklerin sınıflandırılmasında farklı önkoşullar dayanır ve kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır. BOYA anormal boyama desenleri bir açıklama sağlarken S & S sistemi, sapma kökenli mekanik yorumlanması için öncelikle uygundur. Knehr ve arkadaşları tarafından çalışmalar. BALIK boyalı kromozomlarda radyasyona bağlı kromozomal anomaliler üzerinde BOYA yöntemi, S & S sistemi gibi, aynı zamanda bazı modifikasyonların ile sapma kaynağını belirlemek için kullanılabileceğini göstermektedirve puanlama kriterleri üzerinde pratik uygulama 29 için en yararlı olacaktır.

Hem mFISH ve SKY yöntemleri kendi sınırlamaları vardır. Örneğin, mFISH ancak, sapmaları frekansını ölçmek için tüm kromozomlar ekran etmez küçük eğitimle hızlı puanlama izin verir ve çalışmada kullanılan boya kromozom sayısına bağlı olarak, sadece kısmi sapmaları frekansı göstermektedir. Ancak, bütün kromozom boyama tarafından gözlemlenen toplam değişim bir kısmını aslında Lucas ve ark öne formül ile tahmin edilebilir. 30 ve daha fazla BRASELMANN ve arkadaşları tarafından modifiye. 31. Bu matematiksel formül boyalı kromozomlar arasında ve boyalı ve zıt kromozomlar arasındaki değişimi dikkate alır. Örneğin, F p boyalı kromozom kapsadığı genomun fraksiyonel toplamını temsil izin 1 (F 1), 2 (F2) ve 3 (F 3) whe1 = 0,0696, 2 F = 0,0649 ve F F 3 = 0.0570 yeniden değerleri dişi farelerde tek tek kromozom genomik içeriğini temsil etmektedir. (- F p 1) = 0.808 Bu nedenle, f (p = f 1 + f 2 + f 3) = 0.192 ve zıt kesir olur. Boyalı ve zıt kromozom (F P) içeren değişim frekansı kolayca binom genişleme çapraz ürün (p + q) hesaplanabilir 2 p = 2 + 2PQ + q 2, s = F p ve q = (1 - f p). Böylece, F P = 2PQ = 2f p (1 - f p) = 0.310, anlamı kromozomal değişim% 31 fare kromozomu-1, -2 boyadıktan sonra gözlemlenebilir ve -3. Bu nedenle, 1 / 0.31 = 3.23 hücre, bir geniş bantlı metafaz hücrelerinin ya da bir tüm genom eşdeğer eşit atılır gerekir. Ayrıca, mFISH ve sky hem Belir yeteneği sınırlıdırically sapma oluşumunda rol ve aynı zamanda küçük duplications, inversiyon ve silme algılamak için hangi genlerin ve kesmenoktaları tespit.

mFISH ve SKY analizi uygulaması, temel araştırma ile sınırlı değildir. Her ikisi de düzenli olarak klinik çalışmalarda kullanılmaktadır. Bu teknikler aynı zamanda doğum öncesi ve sonrası tanı, risk değerlendirmesi ve kanser çeşitli belirlenmesine uygulanmıştır. Ayrıca, her iki Teknikler kromozom boya kullanılabilir. Sokolova, ilk kez 32 interfaz kromozom boya mFISH kullanılır. Bu teknikler aynı zamanda radyasyon 11, 33 iyonlaştırıcı yanlışlıkla ya da kasıtlı maruz kaldıktan sonra insanlarda sonrası ışınlama dozu tahmini ve risk değerlendirmesi için kullanılmaktadır. Bu nedenle, mFISH veya SKY kısmi veya tam genom analizi, sırasıyla çeşitli çalışmalar için arası kromozomal kararlı sapmaları tespit etmek için yararlı araçlardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi aracılığıyla Arkansas Uzay Grant Konsorsiyumu ve Ulusal Uzay Biyomedikal Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen, hibe NNX15AK32A (RP) ve RE03701 (MH-J), ve P20 GM109005 (MH-J) ve US Veterans Administration ( MH-J). Biz yazının hazırlanmasında editoryal yardım için Christopher Fettes, Arkansas Tıbbi Bilimler Üniversitesi Çevre ve İş Sağlığı Bölümü Program Koordinatörü, teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formamide Sigma-Aldrich 221198-100ML
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639-1L
SKY Laboratory Reagent for Mouse Applied Spectral Imaging FPRPR0030/M40
CAD - Concentrated Antibody Detection Kit Applied Spectral Imaging FPRPR0033
Single Paints Customized - 3 Colors; Mouse chromosome 1: Red, Mouse chromosome 2: Green, Mouse chromosome 3: Aqua Applied Spectral Imaging FPRPR0182/10
Glass coverslips Fisher Scientific 12-545B
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Hydrochloric acid, 37%, Acros Organics Fisher Scientific AC45055-0025 
Fisherbrand Glass Staining Dishes  with Screw Cap Fisher Scientific 08-816
KaryoMAX Potassium Chloride Solution  Life Technologies 10575-090
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Colcemid powder Fisher Scientific 50-464-757 
Histopaque-1083  Sigma-Aldrich 10831
Shepherd Mark I, model 25 137Cs irradiator J. L. Shepherd & Associates Model 484B
Syringe 1 mL BD Biosciences 647911
Ethyl Alcohol, 200 Proof Fisher Scientific MEX02761
PBS, (1x PBS Liq.), w/o Calcium and Magnesium Fisher Scientific ICN1860454
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-437-010
Methanol Fisher Scientific A454SK-4
Glacial acetic acid Fisher Scientific AC295320010
Zeiss Microscope Zeiss AXIO Imager.Z2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kodama, Y., et al. Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation. Radiat Res. 156, 337-346 (2001).
  2. Lucas, J. N. Cytogenetic signature for ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).
  3. Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy? Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).
  4. Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics. Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).
  5. Hande, M. P., et al. Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).
  6. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  7. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  8. Hopman, A. H., et al. Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization. Histochemistry. 85, 1-4 (1986).
  9. Nederlof, P. M., et al. Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry. 10, 20-27 (1989).
  10. Nederlof, P. M., et al. Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry. 11, 126-131 (1990).
  11. Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation. Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).
  12. Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure. Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).
  13. Edwards, A. A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).
  14. Bauchinger, M., et al. Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel. Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).
  15. Hieber, L., et al. Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH. J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691 (2011).
  16. Cohen, N., et al. detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype. Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).
  17. Pathak, R., et al. The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage. Pharm Res. (2016).
  18. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).
  19. Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. A new method for improving metaphase chromosome spreading. Cytometry A. 51, 46-51 (2003).
  20. Hande, M. P., et al. Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome. Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).
  21. Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values. Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).
  22. Kanda, R., et al. Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction. Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).
  23. Kakazu, N., et al. Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis. Lancet. 357, 529-530 (2001).
  24. Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions). Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).
  25. Abrahams, B. S., et al. Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation. Genesis. 36, 134-141 (2003).
  26. Savage, J. R., Simpson, P. On the scoring of FISH-"painted" chromosome-type exchange aberrations. Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).
  27. Savage, J. R., Simpson, P. FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges. Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).
  28. Tucker, J. D., et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting. Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).
  29. Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).
  30. Lucas, J. N., et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).
  31. Braselmann, H., et al. SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis. Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).
  32. Sokolova, I. A., et al. The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine. J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).
  33. Lindholm, C., et al. Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH. Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).
Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).More

Pathak, R., Koturbash, I., Hauer-Jensen, M. Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice. J. Vis. Exp. (119), e55162, doi:10.3791/55162 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter