Introduction
Biomineralization هو عبارة عن سلسلة معقدة من الأحداث، التي تمثل جسرا بين مجموعة من الأنشطة الخلوية الناتجة في إنتاج المعادن أمر رائع 1. ويتمثل التحدي في وصف كل من العملية الخلوية الحيوية والهياكل المعدنية المتطورة باستخدام مزيج من أساليب المجهر الضوئي والإلكترون. ارتفاع درجة الحموضة داخل الخلايا تفضل تشكيل كربونات الكالسيوم 3 البلورات، وبالتالي تحديد مرحلة الحياة التي لديها زيادة درجة الحموضة يكشف عن الوقت الذي من المحتمل أن تحدث 2، 3 التكلس.
والديدان الأنبوبية من عائلة Serpulidae هي calcifiers مشتركة في المحيط 4. بل هو أيضا نموذج اللافقارية شعبية للبحوث البحرية، وخاصة في biofouling 5، 6. في هذه الدراسة، فإن عملية تكلس في مقصورات التمعدن الدوريلوحظ نانوغرام biomineralization. وتشمل العملية السريعة للتحول ظهور هياكل كربونات الكالسيوم 7 و 8.
نحن لشرح كيفية قياس درجة الحموضة الداخلية لا يمكن أن يؤديها على tubeworm، وكيف يمكن فحص مراحل والأنسجة ذات الصلة للتكلس الحياة. بعد أن يتم تحديد مرحلة الحياة من الفائدة، والأنسجة المسؤولة عن تكلس يمكن أن توصف بدقة أعلى باستخدام أساليب المجهر الإلكتروني. باستخدام المجهر الفلورسنت، علينا أن نحدد الوقت اللازم لكربونات الكالسيوم لتظهر بعد تحريض المتحولة. وقد تصور مرحلة مماثلة من الحياة في وقت لاحق مع SEM-EDS للتوزيع التركيب العنصري، وتحليل المعادن المودعة باستخدام طريقتين مختلفتين المجهر الإلكتروني، وتحديدا SEM-EBSD وFIB-تيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. فحص للمرحلة الحياة والأنسجة من الاهتمام مع تصوير لايف
- ثقافة اليرقات البحرية إلى الكفاءة وفقا للأساليب ذكرت سابقا 6 و 7 و 9. احتضان يرقات tubeworm في 5 اليرقات في كثافة مل مع مياه البحر التي تمت تصفيتها مع 10 ميكرومتر SNARF-01:00 ليلا. تغطية الحاويات مع رقائق الألومنيوم لحماية التحقيق الفلورسنت من الصور تبيض.
- مراقبة اليرقات باستخدام مجهر تشريح. سوف tubeworm المختصة اليرقات جاهزة للتحول السباحة في الاتجاه إلى الأمام بدلا من حركة دائرية.
- نقل اليرقات المختصة لشبكة 60 ميكرون. اضغط على شبكة ضد طبق بتري، وتوفير ختم جيدة للاحتفاظ السائل. بسرعة الافراج ختم لاطلاق سراح والتخلص من مياه البحر التي تحتوي على صبغة الفلورسنت، والإبقاء على اليرقات.
- غسل اليرقات مع مياه البحر الاصطناعي تصفيتها (FASW) مرتين، مع الأخذلا يهمني أن تجف اليرقات في هذه العملية.
- ضع 10-20 اليرقات في أطباق أسفل الزجاج رقيقة مع 5 مل من FASW تحتوي على 10 -4 M isobutylmethylxanthine (IBMX) لمراقبة عملية التحول.
- تضاف مكعبات مرشح للكشف عن SNARF-1 إشارة (القناة 1: تحويلة 510/25 م 580/30، القناة 2: تحويلة 510/25 م 640/35)، وصورة مدينة دبي للإنترنت من اليرقات.
- وضع اليرقات المتحول في إطار الهدف 20X، ثم، وتحسين وقت مصراع (100-300 مللي ثانية) سريع بما فيه الكفاية لضمان صورة واضحة من الحيوانات الحية يتم التقاطها.
- مجموعة 1 ميكرون المسافة لالتقاط Z-كومة من جميع القنوات الثلاث، عند التصوير الحيوانات الحية، تصوير كل طبقة لجميع القنوات الثلاث قبل أن ينتقل إلى الطبقة التالية من ض الاتجاه من شأنه أن تمكين علاقة أفضل بين القنوات.
- تصدير الصور على نطاق والرمادية لجميع القنوات والطبقات كملفات TIF من برنامج المجهر: ملف | تصدير | نوع الملف TIF | بداية.
- باستخدام يماغيج، والتراسل الفوري ميناء تسلسل صورة لكل قناة: ملف | استيراد | تسلسل الصور.
- لاستيراد قناة 1 λ 1 م، أدخل بدءا صورة 3 و الزيادة 4.
- لاستيراد قناة 2 λ 2 م، أدخل بدءا صورة 4 و الزيادة 4.
- توليد صورة مركبة عن طريق تقسيم λ 2 م من قبل λ 1 م لكل بكسل طبقة من بكسل (عملية | صورة حاسبة ... | ملف صورة 640 نانومتر "الفجوة" ملف الصورة 580 نانومتر)، أي 640/580 نانومتر النسبة.
- اختر صورة | طاولات البحث | 16 الألوان.
- اختر تحليل | أدوات | شريط المعايرة.
- تفقد الطبقات المختلفة، وتحديد الطبقة التي تحتوي على معظم التجانس. وهذا يوفر معلومات مفيدة للغاية فيما يتعلق بتوزيع الرقم الهيدروجيني الداخلي.
- باستخدام العلاقة بين نسبة 640/580 نانومتر، ودرجة الحموضة، وبناء الشخصية مؤامرة لتصور توزيع درجة الحموضة الداخلية.
= "jove_title"> 2. معايرة درجة الحموضة الداخلية
- بعد تلطيخ بين عشية وضحاها من حوالي 20 اليرقات مع 10 ميكرومتر SNARF-01:00، إضافة في الحلول الأسهم من nigericin وبوكل لتعويض 50 nigericin ميكرومتر و 150 ملي بوكل للمعايرة.
- ضبط درجة الحموضة من AFSW معايرة مع مخفف هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك، حتى يتم تحقيق درجة الحموضة حوالي 5.9. ملاحظة قيمة الرقم الهيدروجيني بالضبط. قياس درجة الحموضة مع متر الرقم الهيدروجيني مع الزجاج الكهربائي الذي تم معايرة مياه البحر على أساس 2-أمينو-2-hydroxymethyl-1،3-propanediol (تريس) و 2 aminopyridine 9.
- نقل أحد اليرقات tubeworm الملون مع السائل مع الرقم الهيدروجيني تعرف على طبق جاف ونظيف لقياس كثافة إشارات في 640 نانومتر و 580 نانومتر.
- كرر الخطوات من 2.2 و 2.3 لأربع نقاط الحموضة المزيد تتراوح 5،9-9،9. وهي تمثل مجموعة من القيم ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
- الاختيار لضمان إشارات تظهر متجانسة في جميع أنحاء جسم الحيوان. هذا يدل على أن درجة الحموضة داخل الخلايا وكانت الإلكترونيةquilibrated مع مياه البحر على البيئة.
- صورة اليرقات tubeworm في مختلف البيئات مياه البحر ودرجة الحموضة خمسة، وتسجيل شدة كما هو موضح "القيم الرمادية" في 640 نانومتر و 580 نانومتر، أي λ 2 مريض بالحب وλ 1 غير شامل.
3. تحليل البيانات التصوير Ratiometric
- أدخل القيم الرمادية التي تقاس من خمسة مواقع عشوائية أو من منطقة الفائدة على ورقة انتشار.
- تحقق لمعرفة ما أظهرت معايرة خمس نقاط وجود علاقة خطية للإشارة إلى درجة الحموضة داخل الخلايا (على سبيل المثال، المعادلة مثل ذ = 0.30x - 1.47، ذ = قيمة الرمادي، س = درجة الحموضة، R² = 0.934).
- حساب القيم ودرجة الحموضة داخل الخلايا من المعادلة باستخدام 640/580 نانومتر نسبة كثافة يقاس في خطوة 1.13.
4. المحافظة على عينة، الجفاف وتصاعد لالمجهر الإلكترون
- الحفاظ على مسرح الحياة في المصالح مع 4٪ لامتصاص العرق. في هذه الدراسة، وتحديد الديدان الأنبوبية 2-4 أيام بعد التعلق، والحفاظ على الحيوانات في تثبيتي حتى التحليل.
- العمل في غطاء الدخان، بعد إصلاح العينة مع 1٪ الأوسيميوم محلول مائي رباعي أكسيد لمدة 30 دقيقة لتقليل انكماش الأنسجة أثناء عملية الجفاف.
- يذوى العينة مع سلسلة الايثانول متدرج: 50٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق، و 70٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق، 85٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق، 95٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق، والايثانول المطلق أخيرا لمدة 5 دقائق مرتين.
- العمل في غطاء الدخان، إضافة 1: الحل 1 من الإيثانول وhexamethyldisilazane (HMDS) لعينة، والسماح للسائل أن تتبخر تماما.
- في غطاء الدخان، إضافة 100٪ HMDS إلى العينة، مما يسمح للسائل أن تتبخر تماما.
- باستخدام سكين الماس، وإدخال بعض التخفيضات على الطبق الثقافة، المحيطة بضعة الديدان الأنبوبية. مع غطاء على، عقد أسفل الطبق ضد كعب الألومنيوم لكسر الطبق.
- تحت المجهر تشريح، والعثور على قطعة بكسر تحتوي على tubeworm سليمة.
- تطبيق الطلاء الفضة إلى كعب الألومنيوم وتأمين جزء من كعب بعناية. رسم حول حواف جزء من البلاستيك للحد من الشحن.
5. تحديد موقع على الكالسيوم الغنية منطقة عن طريق SEM-EDS
- تأمين كعب العينة على صاحب العينة.
- قياس ارتفاع كامل التجمع ضد مقياس المقدمة مع المجهر، وضبط الارتفاع من خلال تخفيف غسالة قفل وتدوير المنصب حتى العينة هي في ارتفاع قياسي، أو أدخل ارتفاع كما هو مسجل.
- أعترف الهواء في غرفة الصرف المجهر وتأرجح في باب الغرفة مفتوحا. حرك حامل العينة على نهاية قضيب الصرف. على مقربة ثم وإخلاء القاعة.
- فتح صمام بوابة، وحرك قضيب الصرف في نحو غرفة المجهر. حرك قضيب الصرف على طول الطريق في مقعد كامل صاحب العينة في المرحلة المجهر. إزالة قضيب الصرف وإغلاق صمام البوابة.
- إدخال رانه أخذ عينات أبعاد وإرسال مرحلة لموقف الرئيسية لوضع العينة تحت العمود الإلكترون.
- تعيين مستوى فراغ الغرفة ل20-30 بنسلفانيا في وضع VP-SEM. تعيين الإلكترون تسريع الجهد إلى 20 كيلو فولت وتحويل الجهد العالي على.
- رفع مرحلة لمسافة عينة عمل من 10 ملم. الحصول على البث المباشر وتحديد العينة. تحسين الصورة بضبط الاستجماتيزم والتركيز عند الضرورة.
- فتح برنامج SEM-EDS وتحديد خيار الوضع EDS-SEM. حدد خيار القائمة لتشغيل خريطة EDS.
- تغيير عدسة مكثف وإعدادات فتحة لتحقيق الوقت الميت من ~ 30٪ في وقت عملية (3) ورصدها من خلال العداد معدل في برنامج SEM-EDS. تشغيل الإجراءات شعاع والمواءمة فتحة بعد إجراء أية تغييرات على إعدادات شعاع.
- حدد التكبير بحيث كائن واحد يملأ الحقل بأكمله نظر. تمكين الخيار تصحيح الانحراف والتقاط صورة في برنامج SEM-EDS.
- الحصول أماهالبيانات ع مع الكائن يملأ الحقل بأكمله نظر، وذلك باستخدام مدة انتظار 50-100 مللي ثانية. تشغيل الخريطة حتى تظهر البيانات توطين متميز من الكالسيوم داخل الكائن الحي (حوالي 15 دقيقة).
- للحصول على بيانات نقاط القياس الكمي، تغيير الوقت عملية ل6 وضبط التحقيق الإلكترون للحصول على الوقت الميت من ~ 30٪. تشغيل الخطوات المواءمة وتحسين صورة عند الضرورة.
- حدد الخيار معرف نقطة وفي برنامج SEM-EDS والحصول على صورة أخرى. باستخدام أداة نقطة واحدة، انقر على المناطق التي ظهرت الكالسيوم الغنية في الخريطة EDS، وكذلك المناطق التي تعاني من نقص الكالسيوم للمقارنة. مسح كل نقطة لفترة المباشر لمدة 30 ثانية.
6. تحديد البلورات معلومات من الكالسيوم المناطق الغنية عن طريق SEM-EBSD
- إزالة جزء يحتوي على عينة من البلاستيك الفائدة من كعب عينة شقة ويضعوا على وجه منحدر من كعب يميل ما قبل 45 درجة باستخدام الفضة اصق موصل.
- المسمار كعب على عينة حكبار السن وموقف وجه الزاوية من كعب (مع عينة) نحو الجزء الأمامي من صاحب العينة. إدراج صاحب العينة في غرفة المجهر باستخدام غرفة الصرف.
- تعيين فراغ الغرفة إلى 30 با والإلكترون تسريع الجهد إلى 20 كيلو فولت. إرسال العينة تحت العمود الإلكترون والميل المرحلة 25 درجة إلى وضع سطح العينة حوالي 70 درجة من الطبيعي أن شعاع الالكترون. تحويل الجهد العالي على.
- رفع مرحلة لمسافة عمل ~ 18 ملم. استخدام كرة لتحريك خشبة المسرح، وتحديد موقع العينة. زيادة التكبير لتأطير ملامح محددة من الفائدة. محاذاة شعاع وتحسين صورة عند الضرورة.
- فتح برنامج SEM-EDS في وضع EBSD. حدد الكالسيت وأراجونيت كما مراحل الفائدة. أدخل الكاميرا EBSD على مسافة 154 مم. وضع شروط الكاميرا إلى 1 × 1 binning والإطار الزمني 100 مللي ثانية. باستخدام شعاع النقطية سريع، الحصول على الخلفية.
ملاحظة: معدل إطار مختلفقد تكون هناك حاجة اعتمادا على التحقيق الإلكترون. ضبط التحقيق أو الكاميرا معدل الإطار لتحقيق إشارة من حوالي 90٪. - التقاط صورة في برنامج SEM-EDS. استخدام أداة تحليل نقطة وانقر في أي مكان على الصورة لمسح شعاع حول هذه النقطة. مراقبة نافذة الكاميرا لمعرفة ما إذا تم الكشف عن أية أنماط كيكوتشي.
- انقر على مناطق مختلفة من صورة لمسح المواقع تكلس المحتملة، ومراقبة نافذة الكاميرا في كل نقطة لمعرفة ما اذا العصابات كيكوتشي موجودة. إذا ظلت أنماط موجودة وتطابق أي من مراحل محددة في قاعدة البيانات، وسوف يكون تلقائيا فهرستها.
7. تيم تحضير العينة عن طريق FIB-SEM
- تفل معطف العينة ووزارة شؤون المرأة مستعدة مع البلاتين أو مواد مماثلة لخلق طبقة موصلة.
- وضع العينات المحدد سابقا، المجففة، والتي شنت في السكن من المغطي تفل وتحويل السلطة لبدء ضخ غرفة أسفل.
- مرة واحدة يقرأ فراغ الغرفة 40 mTorr أو أقل، أدر مفتاح الغاز على وزيادة تدفق غاز الأرجون للوصول إلى ضغط الغرفة من 200 mTorr. ضبط تدفق الغاز لتحقيق ضغط الغرفة النهائي من 80 mTorr.
- أدر مفتاح التيار الكهربائي عن وزيادة الجهد للتوصل إلى تيار 15 أمبير. تعيين جهاز ضبط الوقت ومعطف لفترة طويلة (~ 10 دقيقة) لخلق طبقة سميكة (~ 60 نانومتر) التي تحمي سطح العينة من التلف أيون التشعيع. تنظيم الجهد للحفاظ على استقرار 15 مللي أمبير الحالية.
- بمجرد الانتهاء وخفض استهلاك الطاقة والمغطي للافراج عن فراغ وإزالة عينة.
- المسمار قاعدة مستعدة، تفل عينة المغلفة على آخر المسمار M4 من صاحب العينة الصك. تشديد حتى ناحية ضيق، وتخفيف الجوز قفل، ثم تناوب منصب صاحب العينة لتغيير ارتفاع للجمعية. استخدام مقياس الارتفاع الليزر وضبط ارتفاع لتكون ضمن 1 ملم (= 0.04 بوصة كما هو معروض في الفيديو) من توريدها القياسيةد مع الصك.
- إغلاق كافة الصمامات بندقية في FIB-SEM، ومن ثم الاعتراف الهواء إلى مرحلة القفل eucentric. بمجرد التعادل الضغط مع البيئة، والانزلاق في الهواء الطلق قفل ويضعوا صاحب العينة على شوكات للقضيب الصرف. أدر مفتاح في نهاية قضيب الصرف لموقف "قفل". إغلاق قفل الهواء وإخلاء الغرفة قفل الهواء.
- مرة واحدة وقد تم اجلاء القفل مرحلة الهواء eucentric وضغط المباريات التي من غرفة FIB-وزارة شؤون المرأة، فتح صمام البوابة وإدخال العينة عن طريق دفع في قضيب الصرف. حرك قضيب الصرف على طول الطريق في لمقعد صاحب العينة في المرحلة الصك eucentric، ثم تناوب قضيب الصرف لموقف "فتح". حرك قضيب الصرف الى الخروج وإغلاق صمام البوابة.
- نقل المرحلة لوضع العينة تحت العمود شعاع أيون. فتح صمامات البوابة والحصول على صورة الإلكترون الثانوي الناجم عن أيون حية لالاكذوبه. استخدام التكبير المنخفض ومسح النقطية سريع للحد من الأضرار أيون. إعادة تركيز شعاع المراقبة العادية ورفع ارتفاع Z المرحلة حتى هي العينة في التركيز. في هذه المرحلة كانت العينة في موقف عبر نقطة حيث تتركز كل من ايون والإلكترون الحزم في نفس الموقع.
- استخدام صورة الإلكترون الثانوية من وزارة شؤون المرأة، تحديد مساحة من الاهتمام في العينة، وذلك باستخدام كرة التتبع للنقل العينة حولها. مجالات الاهتمام هي الكالسيوم المناطق الغنية تحديدها كما سبق رسم الخرائط EDS. تدوير مرحلة الضرورة للحصول على ميزات من الفائدة تمشيا مع إطار النافذة.
- على واجهة نافذة الاكذوبه، والتقاط لقطة سريعة للعينة في التكبير من 1،000X مع تقريب رقمي إضافية 2X و رسم قالب ترسب ~ 8 ميكرون × 2 ميكرون فوق منطقة الفائدة. ويمكن تعديل حجم التكبير من مربع ترسيب لاستيعاب ملامح من مختلف الأحجام. تهيئة الظروف تفل على أن تودع الكربون باستخدام 40 كيلو فولت، 0.09 غ شعاع، وذلك باستخدام مدة انتظار 0.5 ميكرو ثانية لمدة 5 دقائق.
- بعد ترسب الكربون، تعديل شروط ترسب لإيداع التنغستن باستخدام 40 كيلو فولت، 0.7 شعاع نا، وديعة لمدة 5 دقائق لتوليد ~ 2-3 غطاء ميكرون التنغستن.
- التقاط لقطة الاكذوبه باستخدام شعاع المراقبة واستخدام أداة microsampling تفل لرسم نمط من أربعة صناديق حول الغطاء التنغستن. ضبط صناديق العلوية والسفلية إلى أن حوالي 15 ميكرون × 8 ميكرون. اليمين مربع 10 ميكرون × 5 ميكرون، وترك مربع 6 ميكرون × 5 ميكرون، أو كبيرة بما فيه الكفاية لتطويق المنطقة من الفائدة.
- تعديل شروط التصنيع لقطع باستخدام 40 كيلو فولت، 19 شعاع نا، ومدة انتظار 50 ميكرو ثانية، و3-4 إطارات مسح لكل مربع. ثم افتعال النمط. بعد التصنيع، ومجال الاهتمام، مع C و W طبقات واقية، وتشبه جزيرة، مع جميع المواد المجاورة إزالة على أعلى، أسفل، والجانبين الأيمن.
- إمالة المرحلة 58 درجة لوضع عصيدةلو السطح الطبيعي للعمود الإلكترون وبزاوية حادة إلى العمود الأيوني. تحديد الجهة الخلفية من عينة "الجزيرة" باستخدام الاكذوبه والتقاط لقطة في 1،000X التكبير و2-4X تقريب رقمي.
- رسم نمط تفل ~ 15 ميكرون × 2 ميكرون على الجزء السفلي من المؤخر من عينة "الجزيرة" في النهاية من حيث كان مرئيا. افتعال مربع باستخدام شعاع 4 غ لمدة 3 دقائق، أو حتى قطع شعاع من خلال الجزء السفلي من عينة "الجزيرة".
- إمالة مرحلة eucentric -58 درجة من الوضع الحالي (العودة إلى الصفر). إدراج التنغستن microsampling التحقيق بالنقر على "التحقيق في" في واجهة الاكذوبه. حدد "MS" على لوحة التحكم مرحلة واستخدام كرة التتبع للنقل التحقيق على أعلى من العينة.
- الحصول على البث المباشر من الاكذوبه في التكبير من 1 KX ووضع المسبار بحيث غيض مباشرة فوق الجانب الأيمن من الغطاء التنغستن من microsample. مع مراعاة حيةصورة SE من وزارة شؤون المرأة، واستخدام مقبض Z السيطرة على لوحة مرحلة لخفض التحقيق حتى إنها تجري اتصالات مع غطاء التنغستن. وهناك صفارة الصوت مرة واحدة أحرز للإتصال به.
- التقاط لقطة باستخدام الاكذوبه باستخدام 40 كيلو فولت، 0.01 غ شعاع، في التكبير من 1،000X و2X تقريب رقمي. استخدام أداة ترسب لرسم مربع × 2 ميكرون 2 ميكرون على رأس لجنة التحقيق حيث اتصلت عليه غطاء التنغستن من microsample.
- تهيئة الظروف لإيداع التنغستن باستخدام 40 كيلو فولت، 0.09 غ شعاع، لمدة 2 دقيقة ومدة انتظار 0.5 ميكرو ثانية. ثم افتعال النمط.
- رسم نمط تفل ~ 2 ميكرون × 5 ميكرون على الطرف الأيسر من microsample "تسليح" (حيث لا يزال متصلا إلى الجزء الأكبر من العينة). افتعال نمط باستخدام 40 كيلو فولت، 0.7 غ شعاع، لمدة 2 دقيقة، أو حتى يشير صفير أن microsample تم فصل من عينة كبيرة الحجم.
- استخدام مقبض Z من السيطرة لزيادة التحقيق مع microsample تعلق حتىكان مسح العينة الأكبر، ثم يتراجع عن التحقيق. إرسال المرحلة eucentric إما إلى الصفحة الرئيسية أو موقف التبادل.
- وضع النحاس نصف الشبكة، إلى حامل دخول الجانب وتحميل حامل في الجانب دخول غرفة مرحلة تطهير. إخلاء الغرفة وتضاف حامل دخول الجانب. تعيين حامل لموقف الاكذوبه.
- الصحافة جانبية على لوحة التحكم مرحلة واستخدام كرة لجلب نصف الشبكة، في طريقة العرض على الشاشة الاكذوبه. نقل لتنظيف المنطقة من الشوط الشبكة واستخدام Z مقبض الباب لجعل السطح إلى التركيز.
- صحافة التحقيق في إدراج التحقيق، اضغط MS على لوحة التحكم المرحلة، واستخدام كرة وZ مقبض الباب لوضع microsample خلال النصف الشبكة. خفض التحقيق حتى الاتصالات microsample الشبكة.
- التقاط صورة على الاكذوبه في 1،000X التكبير (2X التكبير). استخدام أداة ترسب ورسم نمط ~ 10 ميكرون × 3 ميكرون على الجانب السفلي من microsample. التنغستن الودائع مع 40 كيلو فولت، 0.7 غ شعاع، وذلك باستخدام يسكن رIME من 0.5 ميكرو ثانية لمدة 3 دقائق.
- استخدام أداة تفل ورسم 1 ميكرون صغير نمط × 3 ميكرون على رأس لجنة التحقيق. افتعال نمط باستخدام 40 كيلو فولت، 0.7 غ شعاع في وقت يسكن من 3 مللي ثانية إلى قطع التحقيق بعيدا عن microsample. التراجع عن التحقيق مرة واحدة مجانا.
- التقاط صورة الاكذوبه في 5،000X التكبير ورسم نمطين تفل 7 ميكرون × 4 ميكرون في الجزء العلوي والسفلي من microsample، مما يترك فجوة ميكرون ~ 1 بين الصناديق. توسيط أنماط وذلك لعدم قطع الجانبين الأيسر والأيمن من microsample. افتعال كل من أنماط استخدام 40 كيلو فولت، 4 شعاع نا، ومدة انتظار 3 ميكرو ثانية، لمدة 2 دقيقة، وتحديد الاتجاه النقطية نحو وسط microsample.
- التقاط صورة أخرى باستخدام شعاع المراقبة الاكذوبه في 5،000X. تغيير حجم صناديق تفل السابقة إلى ~ 6.5 ميكرومتر × 1 ميكرون، الاقتراب معا لترك فجوة ~ 0.5 ميكرون، وافتعال باستخدام 40 كيلو فولت، 0.7 غ شعاع.
- إمالة دخول مرحلة الجانب 0.5 درجة والحد الأقصىتلح صورة الاكذوبه آخر. تغيير حجم صناديق تفل إلى 6 ميكرون واسع. وضع نموذج القمة على الجانب العلوي من microsample وافتعال باستخدام 40 كيلو فولت، 0.7 غ شعاع. إمالة -0.5 درجة وتكرار مع انخفاض نمط تفل والجانب السفلي من microsample.
- وعلاوة على ذلك إنقاص عرض نمط كتبها ~ 0.5 ميكرون. إمالة 0.5 درجة وتفل على الجانب العلوي من microsample باستخدام 40 كيلو فولت، 0.09 غ شعاع. كرر مع الجانب السفلي في -0.5 درجة الميل.
- إمالة ° المرحلة 2.2 والحصول على صورة الاكذوبه في 10،000X. تغيير أنماط تفل إلى 5 ميكرون واسعة وتغيير الظروف شعاع إلى 5 كيلو فولت، 0.03 غ. ضع نمط العلوي على الجانب العلوي من microsample، وصولا الحافة العلوية، وتلفيق. إمالة -2.2 درجة وكرر مع الجانب السفلي والمقلوب.
- كرر الخطوات 5 كيلو فولت الطحن حتى يصبح microsample شفافة الإلكترون (~ 100 سمك نانومتر). بمجرد الانتهاء، gunvalves وثيقة وإزالة حامل دخول الجانب.
8. ياbtaining مختارة منطقة الحيود نمط على TEM
- لإعداد أداة للتحليل، وملء كل من ديوار قوارير مع النيتروجين السائل وتعيين الجهد يتسارع إلى 300 كيلو فولت.
- بعد إعداد العينات باستخدام الاكذوبه، وإزالة حامل دخول الجانب من الاكذوبه، ووزارة شؤون المرأة وضبط الموقف دبوس مثل أن طول حامل يطابق من 300 كيلو فولت تيم. تدوير غيض من حامل لموقف الملاحظة الصحيح، مرة أخرى مقارنتها لصاحب تيم القياسية لضمان التوجه عينة الصحيح.
- بدلا من ذلك، إزالة نصف الشبكة مع الصفيحة المرفقة من صاحب FIB-SEM ومكان في حامل تيم القياسية.
- تحميل صاحب العينة في غرفة صرف تيم وإخلاء القاعة. تأكد من أن صمام بندقية أداة مغلق كلما اعترف الهواء في غرفة الصرف. مرة واحدة ضخت غرفة الصرف إلى أسفل، وإنذار مسموع الصوت. تدوير في اتجاه عقارب الساعة صاحب العينة والسماح للvacuأم لسحب صاحب العينة في لموقف المحطة الأولى.
- السماح للفراغ أداة لاسترداد، ومن ثم فتح صمام بندقية. إعادة التركيز والتكبير والتكبير من حوالي 10،000X.
- استخدام المقابض محاذاة إلى تحويل شعاع إلى وسط الشاشة الفوسفور. عقد وتوسيع شعاع والتأكد من أن جميع حركة الشعاع هو متحدة المركز. ضبط لوصم مكثف عند الضرورة.
- تدوير صاحب العينة عكس اتجاه عقارب الساعة، والسماح للفراغ لسحب حامل تماما في العمود. استخدم مرحلة حركة المقابض للتنقل وتحديد العينة.
- زيادة التكبير على عينة وضبط Z-ارتفاع حتى هي العينة في التركيز. استخدام العدسات البصرية عند الضرورة.
- أدخل الكاميرا وإزالة الفوسفور الشاشة. توسيع شعاع عند الضرورة لتجنب oversaturating الكاميرا. ضبط معايير التركيز والكاميرا، ثم البدء في شراء لالتقاط صورة.
- للحصول على نمط الحيود، أول مركز للميزة من الفائدة. إزالة فتحة موضوعية وإدراج فتحة الحيود.
- تغيير إلى وضع عدسة الحيود عن طريق الضغط على زر مهرجان دبي السينمائي الدولي على لوحة التحكم واستخدام مفتاح التحكم مهرجان دبي السينمائي الدولي لتقليص شعاع.
- إدراج أكثر فتورا عند الضرورة لمنع المركز من نمط حيود من حرق الكاميرا أو الفوسفور الشاشة. بدء الاستحواذ على الكاميرا لالتقاط صورة من هذا النموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفيما يلي بعض الملاحظات من عملية تكلس خلال التحول من tubeworm. ويبين الشكل (1) أن قيم الرقم الهيدروجيني بالقرب من منطقة طوق أعلى من الأنسجة الأخرى بعد التحول. ويبين الشكل 2I على tubeworm مع توزيع متجانس من الكالسيوم، مما يشير إلى لم تبدأ أحداث تكلس الرئيسية؛ ويبين الشكل 2ii على tubeworm الذي متكلسة لفترة أطول، مما يشير إلى تكلس قد تجاوز نقطة زمنية في المصالح؛ ويبين الشكل 2iii على tubeworm مع مرحلة تكلس الفائدة، الذي تم اختياره لمزيد من التحليل لفهم الأنسجة المسؤولة عن تمعدن. ويبين الشكل 3 تترابط القيم الرقم الهيدروجيني أعلى مع ارتفاع إشارات أيون الكالسيوم من كلا تلطيخ calcein ورسم الخرائط SEM-EDX. من هذه الملاحظات، تم فحص الأنسجة من مسرح الحياة الفوائد في مرحباقرار gher باستخدام تقنية أكثر محلية، SEM-EBSD. عند اكتشاف المرحلة المعدنية، ويبين الشكل 4 تطبيق شعاع الأيون لاخراج المواد التي تهم تيم واختيار تحليل منطقة الحيود لتأكيد تبلور المعادن.
الشكل 1: رسم الخرائط درجة الحموضة داخل الخلايا من tubeworm (من شان وآخرون 2015). في 71 ساعة بعد العلاج IBMX، وtubeworm، ايليجانس Hydroides، وهو ما يمثل معدل أبطأ من التحول تظهر أن هناك تباين كبير في توزيع درجة الحموضة داخل الخلايا. صورة مدينة دبي للإنترنت (أعلى اليسار) وpseudocolorized الصور المركبة الناتجة عن القيم الرمادية في 640 نانومتر مقسوما على القيم الرمادية في 580 نانومتر (أعلى اليمين) وترد. القيم الرمادية محسوبة على أساس نسبة نانومتر 640/580 يتناسب مع درجة الحموضة داخل الخلايا. وبروفيليه القيم الرمادية من الصور المركبة تم تحويلها، إلى قيم درجة الحموضة داخل الخلايا على مسافة طول محور الجسم الطولية للtubeworm (اللوحة السفلية). تأسست العلاقة بين درجة الحموضة داخل الخلايا ونسبة 640/580 نانومتر في الانبعاثات في المختبر المعايرة (ذ = 0.30x - 1.47، R 2 = 0.934، ص، قيمة الرمادي؛ العاشر، ودرجة الحموضة داخل الخلايا). المناطق ذات درجة الحموضة داخل الخلايا فوق درجة الحموضة 8.5 (باللون الأحمر) هي المقابلة للمناطق التي عثر فيها على الهياكل المتكلسة. الحانات النطاق = 100 ميكرون. ج، طوق. ب، فصوص خيشومي. النمل، anteior. آخر، الخلفي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد مرحلة الحياة ذات الاهتمام باستخدام SEM-EDS.
الديدان الأنبوبية في مختلفتم فحص نقطة زمنية من التحول للقبض على مرحلة التكلس حديثا لمزيد من التحليل (ط) يوم تظهر 1 بعد المتحولة tubeworm توزيع متجانس للإشارة الكالسيوم (ب) وتظهر اليوم tubeworm 2 بعد المتحولة الأسرع نموا حلقة قصيرة من إشارة الكالسيوم (ج) وتظهر أبطأ تتزايد يوما 2 آخر المتحولة tubeworm بقع إشارة الكالسيوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: توصيف إشارات الكالسيوم باستخدام المجهر الحية (من شان وآخرون 2015). (من الأول إلى الرابع)، SEM-EDS (الخامس الى السابع) وSEM-EBSD (الثامن والعاشر). توزيع أيون الكالسيوم كما ربطها إشارة calcein في 31 ساعة و 53 ساعة بعد التحول من ايليجانس Hydroides. صور مدينة دبي للإنترنت (اللوحة اليسرى، 3I وج) و رانه calcein إشارة (اللوحة اليسرى، 2ii والرابع) ترد. المتلازم المجهر الإلكتروني في يوم ايليجانس Hydroides 2 بعد المتحولة الكشف عن بقع بنية متكلسة، كما هو مبين في انخفاض الجهد (5 كيلو فولت) صورة ووزارة شؤون المرأة (لوحة المتوسطة، 3V). SEM-EDS رسم الخرائط والتحليل، أجريت في 20 كيلو فولت، ويظهر التوزيع غير المتجانس للكالسيوم (لوحة المتوسطة، 3vi، الكالسيوم، باللون الأصفر). وتعرض محتويات الكالسيوم كأرقام تتراكب تفصيل سطح أكبر من انخفاض الجهد (5 كيلو فولت) صورة tubeworm، كا محتويات (مول٪ بالوزن، يتم محاذاة النقاط العشرية لإظهار موقع بقعة تحليلات) تم الحصول عليها من القياس الكمي بقعة ( مع SEM-EDS في 20 كيلو فولت) (لوحة المتوسطة، 3vii). المناطق ذات محتوى الكالسيوم أعلى من 15 مول٪ بالوزن من المرجح أن تكون الهياكل متكلسة. وilluastrated تحليل SEM-EBSD من المناطق الغنية بالكالسيوم في اللوحة اليمنى من 2viii السينية. وقد تم تحليل المناطق الغنية بالكالسيوم (مربع أبيض) كما وجدت في نتائج SEM-EDS مع مزيد من EBSD (اللوحة اليمنى. 3viii) (ب) الدائرة (لوحة اليمنى.3ix) يشير موقع تحليل EBSD. نمط كيكوتشي (اللوحة اليمنى. 2X) يوحي الموقع aragonitic من واجهة من EDS البرمجيات / EBSD تحليل مجهري. ج، طوق. ب، فصوص خيشومي. النمل، الأمامي. آخر، الخلفي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توصيف البنية البلورية باستخدام FIB-تيم (من شان وآخرون 2015). (ط) تم رفعه المنطقة واظهار نمط كيكوتشي من EBSD لإعداد عينة تيم، (ب) المواد المحيطة إزالة رفعه من قبل شعاع الأيون (FIB) تقنية (رأي كبار)، (ج) تم رفع المواد باستخدام التحقيق التنغستن (عرض الجانب)، (د) عينة بسمك النهائي من ~ 200 نانومتر، والتي تم الحصول عليها في انخفاض الجهد. منطقة حلقت في (ت) كانتتحليل لوجود منطقة مختارة نمط حيود في تيم (السادس)، مما يدل على نمط الكريستال واحد من الأراغونيت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التصوير الضوئي يعيش هو وسيلة مفيدة لمراقبة الأحداث الخلوية في متعددة الخلايا. هنا استخدمت المؤشرات درجة الحموضة وأيون الكالسيوم الداخلية لقياس تدفق الأيونات في مواقع التمعدن. في هذه المناطق، مطلوب ضخ الأيونات النشطة لرفع درجة الحموضة والكالسيوم 2+ تركيز لتمكين تكلس 2 و 3. عند تطبيق جزيئات الفلورسنت لدراسة كائن حي، فمن الأهمية بمكان لضمان التركيز المستخدم لديه سمية تذكر وتمكن الكائن الحي لأداء بطريقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ومن شأن تركيز تلطيخ أقل تكون أقل سمية، وعادة ما يقترن مع قتا أطول تلطيخ 10. فمن المهم للحفاظ على انخفاض كثافة اليرقات أثناء فترة الحضانة، والتقليل من نقص الأكسجين وتراكم النفايات في الفترة تلطيخ.
قبل ممارسة أساليب الاكذوبه / تيم، الذي ينطوي على المترجمةالمنطقة من اهتمام، فمن الأهمية البالغة لفحص من خلال مسرح الحياة والأنسجة من الاهتمام باستخدام الأساليب دقة أقل مثل SEM-EDS وSEM-EBSD. مراقبة العينة تحت وضع الأشعة المرتدة تمكن التصور من التركيب العنصري النسبي حيث يرتبط النقيض أخف وزنا إلى أثقل الوزن الذري 11. ولذلك، أيضا توفير صور SEM-BSE تقدير حيث توجد عناصر أثقل مثل أيونات الكالسيوم والأوسيميوم الملون كريات الدهن. تحليل SEM-EDS يسمح رسم الخرائط أكثر تحديدا من أيونات الكالسيوم في العينات. ومع ذلك، فإنه لا تؤكد وجود بلوري كربونات الكالسيوم 3. SEM-EBSD يسمح الكشف عن الهياكل البلورية، على الرغم من أن وسائل EBSD التقليدية تتطلب سطح مصقول 12. وتوضح هذه الدراسة كيف SEM-EBSD على عينة غير المصقول يمكن أن توفر معلومات مفيدة. تمكن شعاع الحالي 20 كيلو فولت عمق أكبر من التحليل على سطح العينة. لذلك، EBSD هي طريقة مرغوب فيه للكشف عنوجود biomineral، وخاصة على عينات بيولوجية سليمة الصغيرة مثل يرقات البحرية. على الرغم من أن العينات غير المصقول من شأنه أن نعطيه السلبيات الكاذبة عندما لا تواجه المعادن كاشف في نحو 70 درجة، ورؤية ويعتبر نمطا كيكوتشي أن يكون دليلا لا لبس فيه مرحلة المعدنية في المنطقة من الفائدة 13.
انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) يسمح توصيف الهيكلي من مجموعة واسعة من المواد 14. شعاع الأيون (FIB) يسمح لموقع استخراج وإعداد عينة مع أبعاد نموذجية للتحليل تيم 15 معين. ولذلك، فإن تقنية الاكذوبه / تيم هي طريقة مناسبة لتحليل المواد الحيوية المودعة حديثا في منطقة محلية. جنبا إلى جنب أدوات FIB-SEM تسمح أيضا الملاحظة خالية من الضرر من عينة من خلال استخدام عمود متكامل شعاع الالكترون. طلاء التنغستن تفل من العينة يزيد الموصلية وحدود أيون طmplantation وإشعاع الضرر من العينة 16. استخدام شعاع ايون ركزت ناعما مع مدة انتظار منخفض يمكن طحن المواد العضوية. داخل الاكذوبه، ووزارة شؤون المرأة، وهي ميزة معينة من الفائدة يمكن استخراجه من عينة كبيرة الحجم وضعيفة إلى إلكترون الشفافية لتحليل تيم 17. ويرجع ذلك إلى ارتفاع الطاقة من شعاع أيون، يمكن تقديم المواد البلورية غير متبلور. قد يحدث هذا عند إعداد الصفيحة رقيقة لتحليل تيم ويمكن تخفيفها باستخدام تسريع شعاع الجهد أيون منخفض لإزالة طبقة غير متبلور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
| Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
| IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
| Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
| 35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
| BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
| 1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
| 0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
| Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
| ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
| Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
| Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
| Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
| Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
| 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
| 2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
| Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
| PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
| Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| HRTEM H500 | Hitachi | ||
| SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
| NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |
References
- Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
- de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
- de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
- Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
- Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14 (1998).
- Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
- Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
- DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
- Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97 (2015).
- Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
- Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
- Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
- Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
- Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
- Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
- Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).
