Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Karakterisering af Forkalkning Events med Live Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine Tubeworm

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/55164
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

Introduction

Biomineralization er en kompleks serie af begivenheder, der bygger bro en suite af cellulære aktiviteter resulterer i produktion af udsøgt bestilte mineraler 1. Udfordringen er at karakterisere både den dynamiske cellulære processen og de sofistikerede mineralske strukturer ved hjælp af en kombination af optiske og elektronmikroskopi metoder. En højde af intracellulær pH fremmer dannelsen af CaCO 3-krystaller dermed identificerer livstrin der har en forøget pH afslører det tidspunkt, hvor forkalkning kan forventes at blive forekommende 2, 3.

De tubeworms fra familien Serpulidae er almindelige calcifiers i havet 4. Det er også en populær hvirvelløse model for havforskning, især i biologisk forurening 5, 6. I denne undersøgelse processen med forkalkning i mineraliseringsmidler rum during biomineralization overholdes. Den hurtige proces med metamorfose omfatter fremkomsten af calciumcarbonat strukturer 7, 8.

Vi viser, hvordan indre pH-målinger kan udføres på tubeworm, og hvordan livsstadier og væv er relevante for kalcifikation kan screenes. Efter livstrin af interesse er identificeret, kan vævet ansvarlig for forkalkning karakteriseres ved en højere opløsning ved anvendelse af elektronmikroskopi metoder. Ved hjælp af fluorescerende mikroskopi, vi bestemme den nødvendige tid til calciumcarbonat skal vises efter metamorfe induktion. Et tilsvarende tidspunkt i livet blev efterfølgende visualiseret med SEM-EDS for grundstofsammensætning distribution og den deponerede mineral blev analyseret ved hjælp af to forskellige elektronmikroskopi metoder, specielt SEM-EBSD og FIB-TEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Screening for Life Stage og væv af interesse med live Imaging

  1. Kultur det marine larver til kompetenceudvikling i henhold til tidligere rapporterede metoder 6, 7, 9. Inkuber tubeworm larver ved 5 larver pr mL tæthed med filtreret havvand med 10 pM snarf-01:00 natten over. Dæk beholderen med aluminiumfolie for at beskytte den fluorescerende probe fra foto-blegning.
  2. Overhold larverne ved hjælp af en dissektion mikroskop. Kompetent tubeworm larver klar til metamorfose vil svømme i en fremadgående retning i stedet for en cirkulær bevægelse.
  3. Overfør kompetente larver til en 60 um mesh. Tryk masken mod en petriskål, der giver en god tætning til at tilbageholde væske. Hurtigt frigive forseglingen for at frigøre og kassér havvand indeholder fluorescerende farvestof, bevarer larverne.
  4. Vask larverne med filtreret kunstigt havvand (FASW) to gange, idet derPas på ikke at tørre ud larverne i processen.
  5. Placer 10 til 20 larver i tynde glasbund retter med 5 ml FASW indeholder 10 -4 M isobutylmethylxanthin (IBMX) til observation af metamorfose proces.
  6. Sæt filter kuber at opdage snarf-1 signal (kanal 1: Ex 510/25 Em 580/30, Kanal 2: Ex 510/25 Em 640/35), og DIC billede af larverne.
  7. Placer metamorphosing larver under 20X målet, så, optimere lukkertid tid (100-300 ms) hurtigt nok til at sikre, at et klart billede af de levende dyr er fanget.
  8. Set 1 um afstand til at indfange en Z-stak af alle tre kanaler, når billeddannelse et levende dyr, billeddannelse hvert lag for alle tre kanaler før man går videre til det næste lag af z-retningen ville muliggøre en bedre sammenhæng mellem kanalerne.
  9. Eksport gråtoner billeder for alle kanaler og lag som TIF filer fra mikroskopet software: Filer | Eksport | Filtype TIF | Start.
  10. Ved hjælp af ImageJ, import billedsekvensen for hver kanal: Fil | Import | Billedsekvens.
    1. Sådan importeres Kanal 1 λ 1 em, indtaste startbillede 3 og tilvækst: 4.
    2. Sådan importeres Kanal 2 λ 2 em, indtaste startbillede 4 og tilvækst: 4.
  11. Generer et sammensat billede ved at dividere λ 2 em ved λ 1 em for hvert lag pixel for pixel (Process | Billede Calculator ... | Billedfil 640 nm "kløft" billedfil 580 nm), dvs. 640/580 nm forholdet.
  12. Vælg billede | Opslagstabeller | 16 farver.
  13. Vælg Analyser | Værktøjer | Kalibrering bar.
  14. Undersøg de forskellige lag, der identificerer lag, der indeholder den mest heterogenitet. Dette giver den mest nyttige oplysninger om indre pH distribution.
  15. Ved hjælp af forholdet mellem 640/580 nm-forholdet og pH, konstruere et plot profil for at visualisere fordelingen af ​​indre pH.

  1. Efter natten over farvning af omkring 20 larver med 10 pM snarf-01:00, tilføje i stamopløsninger af nigericin og KCI at gøre op 50 uM nigericin og 150 mM KCl til kalibrering.
  2. PH indstilles kalibrering AFSW med fortyndet NaOH eller HCl, indtil en pH omkring 5,9 er opnået. Bemærk den nøjagtige pH-værdi. Mål pH med et pH-meter med en glaselektrode, der er blevet kalibreret af havvand baseret 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol (Tris) og 2-aminopyridin 9.
  3. Overfør en farvet tubeworm larver sammen med en væske med en kendt pH til et tørt og rent fad til måling af signaler intensitet ved 640 nm og 580 nm.
  4. Gentag trin 2.2 og 2.3 for fire flere pH punkter spænder fra 5,9 til 9,9. De repræsenterer en række fysiologisk relevante værdier.
  5. Kontrollér de signaler synes homogene i hele dyrets krop. Dette indikerer, at den intracellulære pH-værdien er equilibrated med den miljømæssige havvand.
  6. Billede af tubeworm larver på de fem forskellige havvand pH-miljøer, registrere intensiteter vises som "grå værdier" på 640 nm og ved 580 nm, dvs. λ 2 exc og λ 1 exc.

3. Analyse af Ratiometrisk Imaging data

  1. Indtast de grå værdier målt fra fem tilfældige steder eller fra et område af interesse på et regneark.
  2. Kontroller at se fem punkter kalibrering viste en lineær sammenhæng at indikere intracellulær pH (fx ligning som y = 0.30x - 1,47; y = grå værdi x = pH, R = 0,934).
  3. Beregn de intracellulære pH-værdier fra ligningen ved hjælp af den målte 640/580 nm intensitet ratio på trin 1.13.

4. Prøve Preservation, dehydrering og Montage til elektronmikroskopi

  1. Bevar livet etape af interesse med 4% paraformaldehyd. I denne undersøgelse, Fastsætte tubeworms 2-4 dage efter vedhæftet fil, holde dyrene i fiksativ indtil analyse.
  2. Arbejder i et stinkskab, post-fix præparatet med 1% osmiumtetroxid vandig opløsning i 30 min for at minimere væv krympning under tørringen.
  3. Dehydrere præparatet med en gradueret ethanol serie: 50% ethanol i 5 minutter, 70% ethanol i 5 minutter, 85% ethanol i 5 minutter, 95% ethanol i 5 minutter, og til sidst absolut ethanol i 5 minutter to gange.
  4. Arbejder i et stinkskab, tilføje en 1: 1 opløsning af ethanol og hexamethyldisilazan (HMDS) til modellen, idet vaskevandet fordampe fuldstændigt.
  5. I stinkskab, tilsættes 100% HMDS til modellen, så væsken fordampe helt.
  6. Ved hjælp af en diamant kniv, indføre et par stykker til kultur parabol, der omgiver et par tubeworms. Med låget på, skal du holde fadet bunden mod en aluminium stub at bryde fadet.
  7. Under en dissektion mikroskop, finde en brækket stykke indeholder en intakt tubeworm.
  8. Påfør sølv maling til en aluminium stub og fastgør fragmentet til stubben omhyggeligt. Male omkring kanterne af plast fragment til at reducere opladningen.

5. Lokalisering af en Calcium Rich Region Brug SEM-EDS

  1. Fastgør prøven stub på indehaveren prøven.
  2. Mål højden af ​​hele samlingen mod måleren følger med mikroskopet, justere højden ved at løsne låseskiven og drejning af post indtil prøven er på standard højde, eller indtaste højden som registreret.
  3. Indrøm luft ind i mikroskopet udveksling kammer og svinge kammeret døren åben. Skub holderen prøven på enden af ​​udvekslingen stang. Så tæt og evakuere kammeret.
  4. Åbn porten ventilen og skub udvekslingen stangen ind mod mikroskopet kammeret. Skub udveksling stangen helt ind til fuldt ud Sæde Holder prøven i mikroskopbordet. Fjern udvekslingen stang og lukke indgangen ventilen.
  5. Input than prøve dimensioner og sende scenen til udgangspositionen at placere prøven under elektron kolonnen.
  6. Sæt kammeret vakuum niveauet til 20-30 Pa i VP-SEM-tilstand. Indstil elektron accelerationsspænding til 20 kV og drej høj spænding på.
  7. Hæv scenen til en prøve arbejdsafstand på 10 mm. Anskaf en levende foder og find prøven. Optimer billedet justere bygningsfejl og fokus efter behov.
  8. Åbn SEM-EDS-programmet og vælg EDS-SEM-mode mulighed. Vælg menupunktet for at køre en EDS kortet.
  9. Skift kondensator linse og blændeindstillinger at opnå en dødtid på ~ 30% ved en proces tid på 3 som overvåget gennem sats meter i SEM-EDS-program. Kør beam og blænde justeringsprocedurerne efter at eventuelle ændringer i indstillingerne stråle.
  10. Vælg en forstørrelse, således at en enkelt organisme fylder hele synsfeltet. Aktiver drift korrektion option og tage et billede i SEM-EDS-program.
  11. Anskaf map data med organismen fylder hele synsfeltet, ved anvendelse af en opholdstid på 50-100 ms. Kør kortet, indtil dataene viser tydelig lokalisering af Ca i organismen (ca. 15 min).
  12. At opnå point-kvantificering data, ændre procestiden til 6 og justere elektron probe til at erhverve en dødtid på ~ 30%. Kør opretningstrinene og optimere billedet efter behov.
  13. Vælg punkt og ID-indstilling i SEM-EDS-programmet og erhverve et andet billede. Brug af enkelt punkt værktøj, skal du klikke på områder, der dukkede op Ca rig i EDS kortet, samt Ca mangelfulde områder til sammenligning. Scan hvert punkt for en levende på 30 s.

6. Identifikation Krystallografisk Information af Calcium rige regioner Brug SEM-EBSD

  1. Fjern plastik fragment indeholdende eksemplar af interesse fra flad eksemplar stub og anbringe den skrånende ansigtet af en 45 ° pre-vippes stub ved hjælp sølv ledende lim.
  2. Skrue stub ned på prøven hældre og position skrå flade stub (med prøve) mod fronten af ​​holderen prøven. Sæt holderen prøven ind i kammeret af mikroskopet med udvekslingen kammer.
  3. Indstil kammeret vakuum til 30 Pa og elektron accelerationsspænding til 20 kV. Send prøven under elektron kolonnen og vippe scenen 25 ° for at placere prøveoverfladen cirka 70 ° fra normal til elektronstrålen. Drej høj spænding på.
  4. Hæv scenen til en arbejdsgruppe afstand på ~ 18 mm. Brug trackball til at flytte scenen og find en prøve. Øge forstørrelsen at indramme specifikke træk af interesse. Juster bjælken og optimere billedet efter behov.
  5. Åbn SEM-EDS program i EBSD mode. Vælg calcit og aragonit som faser af interesse. Sæt EBSD kameraet i en afstand af 154 mm. Indstil kamera betingelser til 1 x 1 binning og en 100 ms ramme tid. Ved hjælp af en hurtig stråle raster, erhverver en baggrund.
    BEMÆRK: En anderledes billedhastighedkan være påkrævet afhængigt af elektron probe; justere proben eller kamera frame rate at opnå et signal på ca. 90%.
  6. Fang et billede i SEM-EDS-program. Brug stedet analyseværktøjet og klik et sted på billedet for at scanne bjælken på dette punkt. Overhold vinduet kamera for at se, hvis der opdages nogen Kikuchi mønstre.
  7. Klikke på forskellige områder af billedet til at scanne potentielle forkalkning sites, observere vinduet kameraet ved hvert punkt for at se om Kikuchi bånd er til stede. Hvis mønstre er til stede og svarer til nogen af ​​de udvalgte faser i databasen, vil de automatisk blive indekseret.

7. TEM Prøveforberedelse Brug FIB-SEM

  1. Sputter coate forberedte SEM prøve med platin eller lignende materiale til at skabe et ledende lag.
    1. Placer de tidligere fastsatte, dehydrerede, og monterede enheder i hus pådampningsbelægningsmaskinen og tænde for strømmen for at begynde at pumpe kammeret ned.
    2. Når kammeret vakuum læser 40 mTorr eller mindre, drejes gas tænde og øge argon gasstrøm at nå et kammertryk på 200 mTorr. Juster gasstrømmen at opnå en endelig kammertryk på 80 mTorr.
    3. Drej spænding tænde og øge spændingen til at nå en strøm på 15 mA. Indstil timeren og pels i længere tid (~ 10 min) for at skabe et tykt lag (~ 60 nm), der beskytter prøvens overflade fra ion bestråling skader. Regulere spændingen for at opretholde en stabil 15 mA strøm.
    4. Når færdig, power ned coater at frigive vakuum og tag prøven.
  2. Skru bunden af ​​den forberedte, sputter coatet prøve på M4 skruen stillingen som indehaver instrumentets prøve. Spænd indtil hånd stram, løsnes låsemøtrikken, og drej prøveholderen indlæg til at ændre højden af ​​samlingen. Brug af laseren højde gauge og justere højden at være inden for 1 mm (= 0,04 inches som vist i video) af standard supplied med instrumentet.
  3. Luk alle pistol ventiler i FIB-SEM, og derefter indrømme luft ind i eucentric fase luftsluse. Når trykket er udlignet med miljøet, skubbe luften lås åben og anbringer prøveholderen på tænderne i udvekslingen stang. Drej knappen på enden af ​​udvekslingen stang til "lock" position. Luk luften lås og evakuere luftlåsekammeret.
  4. Når eucentric scene luften lås er blevet evakueret og trykket passer med FIB-SEM kammer, åbne porten ventil og indsætte prøven ved at skubbe i udvekslingen stang. Skub udveksling stang hele vejen i at sæde prøveholderen i instrumentet eucentric scenen, og drej udveksling stang til "låse" position. Skub udvekslingen stangen tilbage ud og luk lågen ventilen.
  5. Flyt stadium at placere prøven under ionstrålen kolonnen. Åbn skydeventiler og erhverve en live ion-induceret sekundær elektron billede af FIB. Brug lav forstørrelse og enhurtig raster scanning for at minimere ion skader. Nulstil fokus for den normale observationsstrålen og hæve Z højden af ​​scenen indtil prøven er i fokus. På dette tidspunkt er prøven på tværs af punktet, hvor både ion og elektronstråler er fokuseret på det samme sted.
  6. Brug af sekundære elektron billede fra SEM, lokalisere området af interesse i prøven, ved hjælp af trackball til at flytte prøven rundt. Områder af interesse er Ca rige områder som tidligere bestemt af EDS kortlægning. Rotere scenen som nødvendigt for at få de funktioner af interesse i overensstemmelse med rammen af ​​vinduet.
  7. På FIB vinduet interface, indfange et hurtigt øjebliksbillede af prøven ved en forstørrelse på 1.000X med en ekstra 2X digital zoom og tegne en ~ 8 um x 2 um deposition skabelon over området af interesse. Forstørrelsen størrelse aflejringen boksen kan justeres til at rumme funktioner i forskellige størrelser. Indstil sputter betingelser at deponere carbon under anvendelse af en 40 kV, 0,09 nA stråle under anvendelse af en opholdstid på 0,5 mikrosekunder i 5 minutter.
  8. Efter aflejring af kulstof, ændre depositionsbetingelserne at deponere wolfram ved hjælp af en 40 kV, 0,7 nA stråle, og depositum for 5 min til at generere en ~ 2-3 um wolfram cap.
  9. Fang en FIB snapshot ved hjælp af observation stråle og bruge microsampling sputter til at tegne et mønster af fire kasser rundt om wolfram cap. Indstil de øvre og nedre bokse til at være ca. 15 um x 8 um; højre felt 10 um x 5 um, og den venstre kasse 6 um x 5 um, eller stor nok til at omgive det interessante område.
    1. Rediger fabrikation betingelser for at skære ved hjælp af en 40 kV, 19 nA stråle, og en opholdstid på 50 mikrosekunder, og 3-4 scan rammer for hver kasse. Derefter fabrikere mønsteret. Efter fremstilling, det interessante område, med beskyttende C og W lag, vil ligne en ø, med alle tilstødende materiale fjernes i toppen, bunden, og højre side.
  10. Vip stadium 58 ° at sætte Sample overflade vinkelret på elektronen søjlen og ved en stejl vinkel med ion kolonnen. Find bagsiden af ​​prøven "ø" ved hjælp af FIB og fange et øjebliksbillede på 1.000X forstørrelse og 2-4X digital zoom.
  11. Tegn en ~ 15 pm x 2 um sputter mønster over bunden af ​​bagsiden af ​​prøven "ø", i slutningen af ​​hvor den er synlig. Fabrikere boksen anvendelse af en 4 nA bjælke i 3 min, eller indtil strålen sender gennem bunden af ​​prøven "ø".
  12. Vip eucentric etape -58 ° fra den aktuelle position (tilbage til nul). Sæt wolfram microsampling sonde ved at klikke på "Probe I" i FIB interface. Vælg "MS" på scenen kontrolpanel og bruge trackball til at flytte sonden over toppen af ​​prøven.
  13. Anskaf en levende foder fra FIB ved en forstørrelse på 1 kx og placere sonden sådan at spidsen er direkte over højre side af wolfram hætten af ​​microsample. Mens observere en levendeSE billede fra SEM Brug Z betjeningsknappen af ​​panelet scenen for at sænke sonden, indtil den berører wolfram cap. En buzzer lyder, når kontakt er foretaget.
  14. Fang et øjebliksbillede ved hjælp af FIB ved hjælp af en 40 kV, 0,01 nA stråle, ved en forstørrelse på 1.000X og 2X digital zoom. Brug deposition til at tegne en 2 um x 2 um boksen over spidsen af ​​sonden, hvor det har kontaktet wolfram hætten af ​​microsample.
    1. Indstil betingelserne for at deponere wolfram under anvendelse af en 40 kV, 0,09 nA stråle, i 2 min og en opholdstid på 0,5 mikrosekunder. Derefter fabrikere mønsteret.
  15. Tegn en ~ 2 um x 5 um sputter mønster over den venstre ende af den microsample "arm" (hvor det stadig er forbundet til hovedparten af ​​prøven). Fabrikere mønstret ved hjælp af en 40 kV, 0,7 nA stråle, i 2 min, eller indtil bip indikerer, at microsample er løsrevet fra bulkprøven.
  16. Brug Z kontrolknappen det at hæve sonden med vedhæftede microsample indtildet rydder bulkprøven, derefter trække sonden. Send eucentric scenen til enten hjem eller Exchange position.
  17. Placer en kobber halv-grid i en sideindgang holder og indlæse holderen ind i siden adgangsstadie purge kammer. Evakuer kammeret og sæt holderen sidemontering. Sæt holderen til FIB position.
  18. Tryk Side på scenen kontrolpanel og bruge trackball til at bringe den halve gitter til syne på FIB-skærmen. Flyt til rent område af den halve nettet og bruge Z knappen for at bringe overfladen i fokus.
  19. Tryk Probe I at indsætte sonden, tryk MS på scenen kontrolpanelet, og brug trackball og Z knappen for at placere microsample over halvdelen nettet. Sænk sonden, indtil microsample kontakter gitter.
  20. Capture et billede på FIB på 1.000X forstørrelse (2X zoom). Brug deposition værktøjet og tegn en ~ 10 um x 3 um mønster over den nedre side af microsample. Deposit wolfram med et 40 kV, 0,7 nA stråle, ved anvendelse af en opholdstid time på 0,5 mikrosekunder for 3 min.
  21. Brug sputter værktøjet og tegn en lille 1 um x 3 um mønster over spidsen af ​​sonden. Fabrikere det mønster under anvendelse af en 40 kV, 0,7 nA stråle mod en opholdstid på 3 ms at skære sonden væk fra microsample. Træk sonden en gang gratis.
  22. Indfange en FIB billede med 5,000X forstørrelse og drage to sputter mønstre 7 um x 4 um ved toppen og bunden af ​​microsample, hvilket efterlader en ~ 1 um mellemrum mellem kasserne. Centrer de mønstre, således at ikke skære venstre og højre side af microsample. Fabrikere begge mønstre ved hjælp en 40 kV, 4 nA stråle, og en opholdstid på 3 mikrosekunder, i 2 min, indstilling af raster retning mod midten af ​​den microsample.
  23. Capture et andet billede ved hjælp af FIB observation stråle mod 5,000X. Resize de tidligere sputter kasser til ~ 6,5 um x 1 um, rykke tættere sammen for at efterlade et hul på ~ 0,5 um, og fabrikere bruge en 40 kV, 0,7 nA stråle.
  24. Vip sideindgang fase 0,5 ° og kasketTure anden FIB billede. Resize sputter kasser til 6 um brede. Placer øverste mønster over oversiden af ​​microsample og fabrikere ved anvendelse af en 40 kV, 0,7 nA stråle. Vip -0.5 ° og gentag med den nedre sputter mønster og undersiden af ​​microsample.
  25. Yderligere mindske mønster bredde ved ~ 0,5 um. Vip 0,5 ° og sputter oversiden af ​​microsample under anvendelse af en 40 kV, 0,09 nA stråle. Gentag med bundsiden med -0,5 ° hældning.
  26. Vip fase 2.2 ° og erhverve et FIB billede på 10.000X. Resize sputter mønstre til 5 um bred og ændre beam betingelser til 5 kV, 0,03 nA. Placer øvre mønster over oversiden af ​​microsample, helt op den øverste kant, og fabrikere. Vip -2,2 ° og gentag med den nederste side og bund mønster.
  27. Gentag 5 kV fræsning trin, indtil microsample bliver elektron transparent (~ 100 nm tykkelse). Når færdig, tæt gunvalves og fjern sideindgang holder.

8. Obtaining Selected Area diffraktionsmønster på en TEM

  1. For at forberede instrumentet til analyse, fylde både Dewar kolber med flydende nitrogen og sæt den accelererende spænding til 300 kV.
  2. Efter prøveforberedelse hjælp af FIB, fjerne holderen side post fra FIB-SEM og justere stiften position, således at indehaveren længde passer med 300 kV TEM. Roter spidsen af ​​holderen til den korrekte observation position, igen sammenligne det med TEM indehaveren standard for at sikre korrekt prøve orientering.
    1. Alternativt, skal du fjerne halve nettet med vedhæftede lameller fra FIB-SEM holder og plads i TEM holder standarden den.
  3. Læg holderen prøven i udvekslingen kammer TEM og evakuere kammeret. Sørg for, at instrumentet pistol ventilen er lukket, når luft optaget i udvekslingen kammer. Når udvekslingen kammer har pumpet ned, vil en alarm lyder. Drej prøveholder med uret og tillade Vacuum til at trække prøveholderen i den første stopstilling.
  4. Lad instrumentet vakuum at komme sig, og derefter åbne pistolen ventil. Nulstil fokus og zoome til en forstørrelse på ca. 10.000X.
  5. Brug alignment drejeknapper til at flytte strålen til midten af ​​phosphor screen. Kontrakt og udvide strålen og sikre, at alle stråle bevægelse er koncentriske. Juster til kondensator stigmatism som nødvendigt.
  6. Roter prøveholderen mod uret og tillade vakuum at trække holderen helt ind i søjlen. Brug scenen bevægelsen drejeknapper til at navigere og finde prøven.
  7. Øge forstørrelsen på prøven og juster Z-højde indtil prøven er i fokus. Brug optiske okularer efter behov.
  8. Sæt kameraet og fjerne fosfor skærmen. Udvide strålen efter behov for at undgå oversaturating kameraet. Juster fokus og kamera parametre, og derefter begynde købet at tage et billede.
  9. At erhverve en diffraktionsmønster, første center fortræk af interesse. Fjern målet blænde og indsæt diffraktion blænde.
  10. Skift til diffraktion linse ved at trykke på knappen DIFF på kontrolpanelet, og brug DIFF reguleringsknappen den til at skrumpe strålen.
  11. Sæt Blanker som nødvendigt for at forhindre centrum af diffraktionsmønsteret fra brændende skærm kameraet eller fosfor. Start erhvervelse af kameraet til at tage et billede af mønstret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Følgende er nogle observationer af forkalkning processen under metamorfose af tubeworm. Figur 1 viser, at pH-værdierne nær kraven region er højere end de andre væv efter metamorfose. Figur 2i viser en tubeworm med homogen fordeling af Ca, hvilket tyder på nogen større forkalkning begivenheder er begyndt; Figur 2ii viser en tubeworm der har forkalkede i en længere periode, hvilket tyder på forkalkning er gået ud over den tid, seværdighed; Figur 2iii viser en tubeworm med forkalkning fase af interesse, som blev udvalgt til yderligere analyse for at forstå vævet ansvarlig for mineralisering. Figur 3 viser de højere pH-værdier korreleres med de højere Ca ion signaler fra både calcein-farvning og SEM-EDX kortlægning. Ud fra disse observationer, blev vævet fra livet etape af interesse undersøgt på et higher opløsning ved hjælp af en mere lokaliseret teknik, SEM-EBSD. På opdagelsen af mineralet fase, Figur 4 viser anvendelsen af fokuseret ionstråle til løft materiale af interesse for TEM og valgte område gendiffraktionsanalyse at bekræfte krystalliniteten af mineralet.

figur 1
Figur 1: Intracellulær pH kortlægning af tubeworm (fra Chan et al 2015.). På 71 timer efter IBMX behandling, en tubeworm, Hydroides elegans, som repræsenterer en langsommere metamorfose viser en stor uensartethed i den intracellulære pH-distribution. DIC billede (øverst til venstre) og pseudocolorized sammensatte billeder genereret fra de grå værdier ved 640 nm divideret med grå værdier ved 580 nm (øverst til højre) er vist. De beregnede grå værdier fra 640/580 nm-forholdet er proportional med den intracellulære pH. Den profiles af de grå værdier fra de sammensatte billeder, blev omdannet til intracellulære pH-værdier over distancen langs de langsgående organ akse tubeworm (nederste panel). Forholdet mellem intracellulære pH og 640/580 nm-forholdet i emissionen blev etableret ved in vitro kalibrering (y = 0.30x - 1,47; R2 = 0,934; y, grå værdi x, intracellulær pH). Regioner med intracellulær pH ​​over pH 8,5 (i rødt) er svarende til de områder, hvor forkalkede strukturer blev fundet. Scale barer = 100 um; c, krave; b, Branchialfodder lapper; ant, anteior; indlæg, posterior. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Identifikation af liv fase af interesse ved hjælp af SEM-EDS.
Tubeworms på forskelligetidspunkt af metamorfose blev screenet for at fange den nyligt kalcificerende fase for yderligere analyse (i) En dag 1 efter metamorfe tubeworm viser homogen fordeling af Ca signal (ii) En hurtigere vokser dag 2 efter metamorfe tubeworm viser en kort ring af Ca signal (iii) En langsommere voksende dag 2 efter metamorfe tubeworm viser pletter af Ca signal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Karakterisering af Ca signaler med levende mikroskopi (fra Chan et al 2015.). (I-iv), SEM-EDS (v-vii) og SEM-EBSD (viii-x). Fordelingen af calciumioner som korreleret med calcein signal ved 31 timer og 53 timer efter metamorfose af Hydroides elegans. DIC-billeder (venstre panel, 3i og iii) og than calcein signal (venstre panel, 2ii og iv) er vist. Korrelative elektronmikroskopi på dag 2 efter-metamorfiske Hydroides elegans detekterede pletter af forkalkede strukturer, som vist i en lavere spænding (5 kV) SEM billede (midterste panel, 3v). SEM-EDS analyse kortlægning, udført ved 20 kV, viser en heterogen fordeling af calcium (midterste panel, 3vi, Ca, i gul). Ca indhold præsenteres som tal overlejrer en større overflade detalje af lavere spænding (5 kV) billede af tubeworm, Ca indhold (mol vægt%, er decimaler på linie for at vise placeringen af ​​stedet analyser) opnået fra spot kvantificering ( med SEM-EDS ved 20 kV) (midterste panel, 3vii). Regioner med en Ca-indhold højere end 15 mol vægt% sandsynligvis vil være forkalkede strukturer. SEM-EBSD analyse af calcium rige regioner er illuastrated i højre panel af 2viii-x. De calcium rige regioner (hvid boks) som findes i SEM-EDS resultater blev yderligere analyseret med EBSD (højre panel, 3viii) (ii) Cirklen (højre panel;3iX) angiver EBSD analysen stedet; en Kikuchi mønster (højre panel, 2x) antyder webstedet er aragonitic fra grænsefladen af ​​EDS / EBSD mikroanalyse software. c, krave; b, Branchialfodder lapper; ant, anterior; indlæg, posterior. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Karakterisering af krystallinsk struktur ved hjælp FIB-TEM (fra Chan et al 2015.). (I) Regionen udviser en Kikuchi mønster fra EBSD blev udskåret til fremstilling af en TEM prøve, (ii) det fjernede omgivende materiale udskåret ved en fokuseret ionstråle (FIB) teknik (top view), (iii) materialet blev løftet ved anvendelse af en wolfram probe (set fra siden), (iv) prøven med en endelig tykkelse på ~ 200 nm, som blev opnået ved en lavere spænding. Kredsede område (v) blevanalyseret for tilstedeværelsen af ​​udvalgte-område diffraktionsmønster i en TEM (vi), der viser en enkelt-krystal mønster af aragonit. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Levende optisk afbildning er en nyttig metode til iagttagelse cellulære begivenheder i en multicellulær organisme. Her blev indre pH og calcium ion indikatorer anvendes til at måle strømmen af ​​ioner ved mineraliseringen sites. I disse regioner er aktiv ion pumpning kræves for at ophøje pH og Ca 2+ koncentration for at aktivere forkalkning 2, 3. Ved ansøgning fluorescerende molekyler til at studere en organisme, er det vigtigt at sikre, at den anvendte koncentration har ubetydelig toksicitet og muliggør organismen at udføre i en fysiologisk relevant måde. En lavere farvning fusion vil være mindre giftigt og er normalt kombineret med en længere farvning tid 10. Det er vigtigt at holde en lav tæthed af larver under inkubationstiden, minimerer iltmangel og ophobning af affald i farvningen periode.

Før forfølge de FIB / TEM metoder, der indebærer en lokaliseretregion af interesse, er det afgørende at screene gennem livet scenen og væv af interesse ved hjælp af metoder lavere opløsning som SEM-EDS og SEM-EBSD. Observere prøven under tilbagekastet tilstand muliggør visualisering af relativ grundstofsammensætningen hvor lysere kontrast korrelerer til tungere atomvægt 11. Derfor SEM-BSE billeder giver også en vurdering af, hvor de tungere elementer som calciumioner og osmium farvede lipid kugler er placeret. SEM-EDS analyse giver mere specifik kortlægning af calciumioner på prøverne. Men det ikke bekræfte tilstedeværelsen af krystallinsk CaCO3. SEM-EBSD tillader påvisning af krystallinske strukturer, selv om konventionelle EBSD metoder kræver en blank overflade 12. Denne undersøgelse viser, hvordan SEM-EBSD på et upoleret prøve kan give nyttige oplysninger. En 20 kV stråle strøm muliggør en større dybde analyse på prøveoverfladen. Derfor EBSD er en ønskelig fremgangsmåde til at påvisetilstedeværelsen af ​​biomineral, især for små, intakte biologiske prøver såsom marine larver. Skønt de upolerede prøver ville give falske negativer, når mineraler ikke står detektoren ved ca. 70 °, se en Kikuchi mønster anses for at være utvetydigt bevis på en mineralsk fase ved området af interesse 13.

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) tillader strukturel karakterisering af en bredere vifte af materialer 14. Den fokuserede ion beam (FIB) giver mulighed for stedspecifikke udvinding og forarbejdning af en prøve med typiske dimensioner for TEM-analyse 15. Derfor FIB / TEM teknik er en egnet metode til at analysere nyligt deponerede biomaterialer på et lokaliseret område. Kombinerede FIB-SEM instrumenter tillader også ubeskadiget observation af en prøve ved brug af en integreret elektronstråle kolonne. Wolfram sputter belægning af prøven øger ledningsevne og grænser ion jegmplantation og bestråling beskadigelse af prøven 16. Anvendelsen af ​​en fint fokuseret ionstråle med lav opholdstid muliggør fræsning af organiske materialer. Inde i FIB-SEM, kan en bestemt funktion af interesse udvindes fra en bulk prøve og tyndet til elektron gennemsigtighed for TEM-analyse 17. På grund af den høje energi af ionstrålen, kan krystallinske materialer gøres amorfe. Dette kan ske ved udarbejdelsen af ​​en tynd lamel for TEM-analyse og kan afbødes ved anvendelse af en lav accelerationsspænding ionstråle at fjerne det amorfe lag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hexamethyldisilazane  Electron Microscopy Sciences 16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine ThermoFisher Scientific PHZ1124
Nigericin, Free Acid ThermoFisher Scientific N7143-5MG
35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat ThermoFisher Scientific D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate ThermoFisher Scientific C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade VWR BDH0258-500G
Paraformaldehyde
reagent grade, crystalline		 Sigma P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 199-02185
Calcein Sigma C0875
FASW Iwaki Co. Ltd. Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm ADVANTEC A045A047A
ethanol Wako Pure Chemical Industries, Ltd 051-00476
Artificial seawater for buffers by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 191-01665
Potassium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 135-00165
Calcium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 039-00475
Sodium Sulfate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 197-03345
Hydrochloric Acid Wako Pure Chemical Industries, Ltd 089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) Wako Pure Chemical Industries, Ltd 207-06275
2-aminopyridine Wako Pure Chemical Industries, Ltd 011-02775
Orion 5-star Plus pH meter Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 Zeiss
ImageJ NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500 Hitachi
SU6600 VPSEM Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system Hitachi 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
  2. de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
  3. de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
  4. Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
  5. Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14 (1998).
  6. Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
  7. Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
  8. DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
  9. Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97 (2015).
  10. Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
  11. Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
  12. Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
  13. Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
  14. Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  15. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
  16. Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
  17. Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).

Tags

Mikrobiologi Ratiometrisk pH-måling EDS EBSD Focused Ion Beam (FIB) TEM elektronmikroskopi biovidenskab (Generelt)
Karakterisering af Forkalkning Events med Live Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine Tubeworm
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, V. B. S., Toyofuku, T.,… More

Chan, V. B. S., Toyofuku, T., Wetzel, G., Saraf, L., Thiyagarajan, V., Mount, A. S. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. J. Vis. Exp. (120), e55164, doi:10.3791/55164 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter