Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Karakterisering av Forkalkning Hendelser Bruke levende Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine tubeworm

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/55164
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

Introduction

Biomineralization er en kompleks serie av hendelser, som broer en pakke med cellulære aktiviteter som resulterer i produksjon av utsøkt bestilt mineraler 1. Utfordringen er å karakterisere både den dynamiske cellulære prosessen og de sofistikerte mineral strukturer ved hjelp av en kombinasjon av optiske og elektronmikroskopi metoder. En forhøyning av intracellulær pH begunstiger dannelse av CaCO 3 krystaller, dermed identifisere livsfase som har en øket pH-verdi viser tiden når forkalkning er sannsynlig å ha oppstått 2, 3.

De tubeworms fra familien Serpulidae er vanlige calcifiers i havet 4. Det er også en populær virvelløse modell for marin forskning, spesielt i begroing 5, 6. I denne studien, er prosessen med forkalkning i mineralise avdelinger During biomineralization er observert. Den raske prosess med metamorfose inkluderer fremveksten av kalsiumkarbonat strukturer 7, 8.

Vi viser hvordan indre pH-målinger kan utføres på tubeworm, og hvor livsstadier og vev er relevante for forkalkning kan screenes. Etter livsfase av interesse er identifisert, kan vevet ansvarlig for forkalkning karakteriseres ved en høyere oppløsning ved hjelp av elektronmikroskopi metoder. Ved hjelp av fluorescerende mikroskopi, vi bestemme den tiden som kreves for kalsiumkarbonat vises etter metamorfe induksjon. En tilsvarende fasen av livet ble deretter visualisert med SEM-EDS for elementsammensetning distribusjon, og det avsatte mineral ble analysert ved hjelp av to ulike elektronmikroskopi metoder, spesielt SEM-EBSD og FIB-TEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Screening for Life Stage og Tissue av interesse med live Imaging

  1. Kultur marine larver til kompetanse i henhold til tidligere rapporterte metoder 6, 7, 9. Inkuber tubeworm larver på fem larver per ml tetthet med filtrert sjøvann med 10 mm snarf-en AM natten. Dekk beholderen med aluminiumsfolie for å beskytte den fluorescerende probe fra foto-bleking.
  2. Observer larvene ved hjelp av en disseksjon mikroskop. Kompetent tubeworm larver klar for metamorfose vil svømme i en retning fremover i stedet for en sirkelbevegelse.
  3. Overfør den kompetente larvene til en 60 pm sikt. Trykker nettingen mot en petriskål, som gir en god tetning for å holde på væske. slipp den raskt forseglingen for å frigjøre og kast sjøvann som inneholder fluorescerende fargestoff, beholde larvene.
  4. Vask larver med filtrert kunstig sjøvann (FASW) to ganger, tarPass på å ikke tørke ut larvene i prosessen.
  5. Plasser 10 til 20 larver i tynne glassbunn retter med 5 ml FASW inneholdende 10 -4 M isobutylmethylxanthine (IBMX) for observasjon av metamorfose prosess.
  6. Sett filter kuber å oppdage snarf-en signal (Kanal 1: Ex 510/25 Em 580/30, Kanal 2: Ex 510/25 Em 640/35), og DIC bilde av larver.
  7. Plasser metamorphosing larver under 20X objektiv, da, optimalisere lukkertiden (100-300 ms) fort nok til å sikre at et klart bilde av levende dyr er tatt.
  8. Sett en mikrometer avstand for å fange en Z-stack av alle tre kanalene, når avbildning et levende dyr, bildebehandling hvert lag for alle tre kanaler før du går videre til neste lag av z-retningen vil gi en bedre sammenheng mellom kanalene.
  9. Eksport gråtonebilder for alle kanaler og lag som TIF-filer fra mikroskop programvare: Fil | eksport | Filtype TIF | Start.
  10. Bruke ImageJ, import bildesekvensen for hver kanal: Fil | import | Bildesekvens.
    1. Slik importerer Kanal 1 λ en em, skriv startbildet 3 og tilvekst: 4.
    2. Slik importerer Channel 2 λ 2 em, skriv startbildet fire og tilvekst: 4.
  11. Genererer et sammensatt bilde ved å dele λ 2 em av λ en em for hvert lag piksel for piksel (Process | Bilde kalkulator ... | Bildefil 640 nm "dele" bildefil 580 nm), dvs. 640/580 nm forholdet.
  12. Velg bilde | Oppslag Tabeller | 16 farger.
  13. Velg Analyser | verktøy | Kalibrering bar.
  14. Inspiser de ulike lagene, identifisere laget som inneholder mest heterogene. Dette gir den mest nyttig informasjon om interne pH distribusjon.
  15. Ved hjelp av forholdet mellom 640/580 nm forhold og pH, konstruere et plott profil for å visualisere fordelingen av indre pH.

  1. Etter over natten farging av ca 20 larver med 10 mm snarf-en AM, legge på lager løsninger av nigericin og KCl å gjøre opp 50 mikrometer nigericin og 150 mM KCl for kalibrering.
  2. Juster pH på kalibrerings AFSW med fortynnet NaOH eller HCl, inntil en pH-verdi omkring 5,9 er oppnådd. Legg merke til den eksakte pH-verdi. Mål pH med et pH-meter med en glasselektrode som er kalibrert med sjøvann basert 2-amino-2-hydroksymetyl-1,3-propandiol (Tris) og 2-aminopyridin 9.
  3. Overfør en farget tubeworm larver sammen med en væske med kjent pH til en tørr og ren parabolen for måling av signaler intensitet ved 640 nm og 580 nm.
  4. Gjenta trinn 2.2 og 2.3 for fire flere pH punkter som spenner 5,9 til 9,9. De representerer et spekter av fysiologisk relevante verdier.
  5. Sjekk for å sikre at de signaler som synes homogen gjennom hele dyrets kropp. Dette indikerer at den intracellulære pH-verdien har vært equilibrated med miljø sjøvann.
  6. Bilde av tubeworm larver på de fem ulike sjøvann pH-miljøer, registrere intensiteter vist som "grå verdier" på 640 nm og 580 nm, dvs. λ 2 exc og λ en exc.

3. Analyse av Proporsjonellekspansjon Imaging data

  1. Skriv inn de grå verdiene målt fra fem tilfeldige steder eller fra et område av interesse på et regneark.
  2. Sjekk for å se fem poeng kalibreringen viste en lineær sammenheng for å indikere intracellulær pH (f.eks ligningen som y = 0.30x - 1,47; y = grå verdi; x = pH, Ri = 0,934).
  3. Beregn intracellulære pH-verdier fra ligningen ved hjelp av den målte 640/580 nm intensitet ratio på trinn 1.13.

4. Prøve Bevaring, dehydrering og montering for elektronmikroskopi

  1. Bevar livsfase av interesse med 4% paraformaldehyde. I denne studien, Fikse tubeworms 2-4 dager etter vedlegg, holde dyr i fiksativ til analyse.
  2. Arbeid i en avtrekkshette, post-fix prøven med 1% osmiumtetroksid vandig oppløsning i 30 min for å minimere vev krymping under dehydrering prosessen.
  3. Dehydrere prøven med en gradert etanolserie: 50% etanol i 5 min, 70% etanol i 5 min, 85% etanol i 5 min, 95% etanol i 5 min, og til slutt absolutt etanol i 5 min to ganger.
  4. Å arbeide i et avtrekksskap, tilsett en 1: 1 løsning av etanol og heksametyldisilazan (HMDS) til prøven, slik at væsken til å fordampe fullstendig.
  5. I avtrekksskap, tilsett 100% HMDS til prøven, slik at væsken til å fordampe fullstendig.
  6. Ved hjelp av en diamant kniv, presentere noen kutt til kultur fatet, rundt et par tubeworms. Med lokket på, holder fatet bunnen mot en aluminiums spire å bryte fatet.
  7. Under en disseksjon mikroskop, finne en brukket stykke som inneholder en intakt tubeworm.
  8. Anvende sølvmaling til et aluminium stump og feste-fragmentet til stussen nøye. Male rundt kantene av plast-fragmentet for å redusere lading.

5. Finne en Calcium Rich Region Bruke SEM-EDS

  1. Fest prøven spire på prøveholderen.
  2. Mål høyden på hele forsamlingen mot måleren følger med mikroskopet, justere høyden ved å løsne låseskiven og rotere post inntil prøven er i standard høyde, eller angi høyde som registreres.
  3. Innrøm luft inn i mikroskopet utvekslingskammeret og svinge kammer døren åpen. Skyver prøveholderen på enden av utvekslingen stangen. Lukk og evakuere kammeret.
  4. Åpne sluseventilen og skyver stangen utveksling i mot mikroskop kammeret. Skyv utveksling tangen helt inn til skikkelig på plass prøveholderen inn i mikroskop scenen. Fjern utveksling stangen og lukke sluseventilen.
  5. Input than prøve dimensjoner og sende scenen til startposisjon for å plassere prøven under elektron kolonnen.
  6. Sett kammeret vakuumnivået til 20-30 Pa i VP-SEM-modus. Sett elektron akselerasjonsspenning til 20 kV og slå på høy spenning på.
  7. Hev scenen til en prøve arbeidsavstand på 10 mm. Erverve en live feed og finn prøven. Optimalisere bildet justere astigmatisme og fokus etter behov.
  8. Åpne SEM-EDS-programmet og velge modus alternativet EDS-SEM. Velg menyvalget for å kjøre en EDS kartet.
  9. Endre kondensator objektiv og blenderåpning for å oppnå en dødtid på ~ 30% ved en prosess tid med tre som overvåkes gjennom hastigheten meter i SEM-EDS program. Kjør bjelke og blenderåpning oppretting etter å gjøre noen endringer i stråleinnstillinger.
  10. Velge en forstørrelse slik at en enkelt organisme fyller hele synsfeltet. Aktiver korreksjon av drifting alternativet og ta et bilde i SEM-EDS program.
  11. Acquire map data med organismen fyller opp hele synsfeltet, ved bruk av en oppholdstid på 50-100 ms. Kjør kartet til data viser tydelig lokalisering av Ca innenfor organismen (ca. 15 min).
  12. For å få punkt-kvantifisering data, endre prosessen tid til seks og justere elektronet probe å skaffe seg en død tid på ~ 30%. Kjør justeringstrinn og optimalisere bildet etter behov.
  13. Velg Pek og alternativ ID i SEM-EDS program og få et annet bilde. Bruke enkelt punkt verktøyet, klikk på områder som dukket Ca rik på kartet EDS, samt Ca mangelfull områder for sammenligning. Skann hvert punkt for en live på 30 s.

6. Identifisere krystallografiske informasjon kalsium rik Regioner Bruke SEM-EBSD

  1. Fjern plastfragment inneholder eksemplar av interesse fra flat prøven spire og fest til skrånet ansiktet til en 45 ° pre-vippet stump bruker sølv ledende lim.
  2. Skru stussen på prøven hEldre og posisjon den vinklede flate av stussen (med prøve) mot fronten av prøveholderen. Sett prøveholder inn i kammeret i mikroskopet ved hjelp av utvekslingskammeret.
  3. Sett kammer vakuum til 30 Pa og elektron akselerasjonsspenning til 20 kV. Sende prøven under elektron kolonnen og vippe trinn 25 ° for å plassere prøveoverflaten ca 70 ° fra normal til elektronstrålen. Slå høy spenning på.
  4. Hev scenen til en arbeidsavstand av ~ 18 mm. Bruk styrekulen til å flytte scenen og finn et eksemplar. Øk forstørrelsen å ramme spesifikke funksjoner av interesse. Rett strålen og optimalisere bildet etter behov.
  5. Åpne SEM-EDS programmet i EBSD modus. Velg kalsitt og aragonitt som faser av interesse. Sett EBSD kamera i en avstand på 154 mm. Sett kameraet forhold til 1 x 1 binning og en 100 ms ramme tid. Ved hjelp av en rask bjelke raster, få en bakgrunn.
    MERK: En annen bildefrekvensDet kan være nødvendig, avhengig av elektron sonde; juster probe eller kameraets bildefrekvensen for å oppnå et signal på omtrent 90%.
  6. Ta et bilde i SEM-EDS program. Bruk spotanalyseverktøyet, og klikk et sted på bildet for å skanne strålen på det punktet. Observer kameraet vinduet for å se om det oppdages Kikuchi mønstre.
  7. Klikk på forskjellige områder av bildet for å skanne potensielle forkalkning nettsteder, observere kameraet vindu på hvert punkt for å se om Kikuchi band er til stede. Hvis mønstre er til stede og matche noen av de valgte fasene i databasen, vil de automatisk bli indeksert.

7. TEM Prøvepreparering Bruke FIB-SEM

  1. Frese frakk oppkjørte SEM prøven med platina eller lignende materiale for å skape et ledende lag.
    1. Plasser de tidligere faste, dehydrert, og montert prøver i huset til frese belegger og slå på strømmen for å begynne å pumpe kammeret ned.
    2. Når kammeret vakuum leser 40 mTorr eller mindre, slår gassen bryteren på og øke argon gasstrømmen for å nå et kammertrykk på 200 mTorr. Juster gasstrømmen for å oppnå en endelig kammertrykk på 80 mTorr.
    3. Dreies spenningsbryteren på og øke spenningen for å oppnå en strøm på 15 mA. Sett timeren og pels over lengre tid (~ 10 min) for å skape et tykt lag (~ 60 nm) som beskytter prøveoverflaten fra ion bestråling skade. Regulere spenningen for å opprettholde en stabil 15 mA strøm.
    4. Når du er ferdig, slå av beleggeren for å løsne vakuum og ta prøven.
  2. Skrue i bunnen av klare, frese belagte prøven på M4 skrue stolpen av instrumentet prøveholderen. Strammes til for hånd, løsne låsemutteren, og deretter rotere prøveholderen post for å endre høyden på forsamlingen. Bruk laser høydemåler og justere høyden til å være innenfor 1 mm (= 0,04 inches som vises i videoen) av standard supplied med instrumentet.
  3. Lukk alle pistol ventiler på FIB-SEM, og deretter innrømmer luft inn i eucentric scenen luftslusen. Når trykket har utlignet med miljøet, skyver luften låse åpen og fest prøveholderen på utstikkerne av utveksling stang. Vri knotten på slutten av utveksling stang til "lock" posisjon. Lukk luftsluse og evakuere luften slusekammer.
  4. Når eucentric trinns luftlåsen har blitt evakuert og trykket stemmer overens med FIB-SEM kammer, åpne sluseventilen og sett prøven ved å trykke på utveksling stang. Skyv utveksling tangen helt inn til plass prøveholderen i instrumentet eucentric scenen, og roter utveksling stang til "låse opp" posisjon. Skyv utveksling stang ut igjen og lukke porten ventilen.
  5. Flytt trinnet for å plassere prøven under ionestrålen kolonnen. Åpne porter og få en live ion-indusert sekundærelektron bilde av FIB. Bruk lav forstørrelse og enrask raster scan for å minimere ion skade. Tilbake fokus for normal observasjon strålen og heve Z høyden på scenen før prøven er i fokus. På dette tidspunkt prøven er ved krysningspunktet stilling hvor både ione og elektronstråler er fokusert på samme sted.
  6. Bruke sekundærelektronbildet fra SEM, finn område av interesse i prøven, ved hjelp av styrekulen for å flytte prøven rundt. Områder av interesse er Ca rike områder som tidligere bestemt av EDS kartlegging. Rotere trinnet som er nødvendig for å få egenskapene av interesse i linje med rammen av vinduet.
  7. På FIB vindu grensesnitt, ta et øyeblikksbilde av prøven ved en forstørrelse på 1,000X med en ekstra 2X digital zoom og tegne en ~ 8 mikrometer x 2 mikrometer deponering mal over området av interesse. Forstørrelsen størrelsen av avsetnings esken kan bli justert for å tilpasse funksjoner av forskjellige størrelser. Sett frese forhold til innskudd karbon ved hjelp av en 40 kV, 0,09 nA bjelke, ved hjelp av en oppholdstid på 0,5 us i 5 min.
  8. Etter avsetning av karbon, endre avsetning forhold til innskudd wolfram ved hjelp av en 40 kV, 0,7 nA bjelke, og innskudd i 5 minutter for å generere en ~ 2-3 mikrometer wolfram cap.
  9. Fange en FIB stillbilde med observasjon stråle og bruke microsampling frese verktøy for å tegne et mønster av fire bokser rundt wolfram cap. Setter de øvre og nedre kasser å være omtrent 15 um x 8 um; den høyre boksen 10 mikrometer x 5 mikrometer, og den venstre boksen 6 mikrometer x 5 mikrometer, eller store nok til å omringe området av interesse.
    1. Endre fabrikasjon forhold til å kutte ved hjelp av en 40 kV, 19 nA bjelke, og en oppholdstid på 50 us, og 3-4 skanne rammer for hver boks. Så dikte mønsteret. Etter fabrikasjon, området av interesse, med beskyttende C og W lag, vil likne en øy, med alle tilstøtende materialet fjernet på toppen, bunnen, og høyre side.
  10. Vipp scenen 58 ° for å sette SAMPle overflaten normalt på elektron kolonne og ved en bratt vinkel i forhold til ione-kolonne. Finn baksiden av prøven "øy" ved hjelp av FIB og ta et øyeblikksbilde 1,000X forstørrelse og 2-4x digital zoom.
  11. Tegn en ~ 15 mikrometer x 2 mikrometer frese mønster over bunnen av baksiden av prøven "øy", helt på slutten av hvor det er synlig. Fremstille boksen ved hjelp av en 4 nA bjelke i 3 minutter, eller inntil bjelken avklarte gjennom bunnen av prøven "øy".
  12. Vipp eucentric scenen -58 ° fra den aktuelle posisjonen (tilbake til null). Sett wolfram microsampling sonde ved å klikke på "Probe I" i FIB-grensesnittet. Velg "MS" på scenen kontrollpanelet og bruke styrekulen til å flytte sonden over toppen av prøven.
  13. Erverve en live feed fra FIB ved en forstørrelse på 1 kx og plassere sonden slik at spissen er rett over høyre side av wolfram lokket av microsample. Mens observere en liveSE bilde fra SEM, bruker du Z kontrollknappen på scenen panelet for å senke sonden til den kommer i kontakt med tungsten cap. Et lydsignal høres når kontakten har blitt gjort.
  14. Ta et bilde med det FIB ved hjelp av en 40 kV, 0,01 nA bjelke, ved en forstørrelse på 1,000X og 2X digital zoom. Bruk avsetning verktøyet til å tegne en 2 um x 2 um boks over spissen av sonden, hvor den har kontakt med wolfram lokket av microsample.
    1. Setter premissene for å avsette wolfram ved bruk av en 40 kV, 0,09 nA bjelke, i 2 min og en oppholdstid på 0,5 us. Så dikte mønsteret.
  15. Tegn en ~ 2 um x 5 um frese mønster over den venstre ende av microsample "arm" (der det fremdeles er koblet til hoveddelen av prøven). Fremstille et mønster ved hjelp av en 40 kV, 0,7 nA bjelke, i 2 minutter, eller inntil den pip indikerer at microsample har blitt løsgjort fra samleprøven.
  16. Bruk Z kontrollknappen for å heve sonden med vedlagte microsample tildet klarner samleprøven, deretter trekke sonden. Send eucentric scenen til enten hjem eller Exchange-posisjon.
  17. Plasser en kobber halv-gitter inn i en sideinngang holder og laste holderen inn i sideinngangstrinnet spylekammer. Evakuer kammeret og sette inn sideinngangen holderen. Sett holderen til FIB posisjon.
  18. Trykk Side på scenen kontrollpanelet og bruke styrekulen for å bringe den halve rutenett til syne på FIB skjermen. Flytt for å rense området for halv gitter og bruke z knotten slik at overflaten i fokus.
  19. Trykk Probe I å sette inn sonden, trykker MS på scenen kontrollpanelet, og bruke styrekulen og Z knappen for å plassere microsample over halvparten rutenett. Senk sonden inntil microsample kontakt med rutenett.
  20. Ta et bilde på FIB på 1,000X forstørrelse (2X zoom). Bruk avsetning verktøyet og trekke en ~ 10 um x 3 mikrometer mønster over den nedre side av microsample. Innskudd wolfram med en 40 kV, 0,7 nA bjelke, ved hjelp av en oppholdstid time på 0,5 ms for 3 min.
  21. Bruk frese-verktøyet og trekke en liten 1 um x 3 mikrometer mønster over spissen av sonden. Fremstille et mønster ved hjelp av en 40 kV, 0,7 nA bjelke ved en oppholdstid på 3 ms for å skjære sonden bort fra microsample. Trekk sonden gang gratis.
  22. Fange en FIB bilde på 5,000X forstørrelse og trekker to frese mønstre 7 pm x 4 mikrometer på toppen og bunnen av microsample, etterlot seg en ~ 1 mikrometer gap mellom boksene. Sentrer mønstrene slik som å ikke kutte venstre og høyre side av microsample. Fremstill begge mønstre ved hjelp av en 40 kV, fire nA bjelke, og en oppholdstid på 3 us, i 2 minutter, etterjustering av raster retning mot midten av microsample.
  23. Ta et nytt bilde med FIB observasjon strålen mot 5,000X. Resize tidligere frese boksene til ~ 6,5 mikrometer x 1 mikrometer, flytter tettere sammen for å forlate et gap på ~ 0,5 mikrometer, og dikte ved hjelp av en 40 kV, 0,7 nA bjelke.
  24. Vipp side oppføring scenen 0,5 ° og capture annen FIB bilde. Endre størrelse frese boksene til 6 mikrometer brede. Plasser den øverste mønster over toppen siden av microsample og dikte ved hjelp av en 40 kV, 0,7 nA bjelke. Vippe -0,5 ° og gjenta med den nedre frese mønster og bunnsiden av microsample.
  25. Ytterligere redusere mønsterbredden ved ~ 0,5 mikrometer. Vippe 0,5 ° og frese oversiden av microsample ved bruk av en 40 kV, 0,09 nA bjelke. Gjenta med undersiden på -0,5 ° tilt.
  26. Vipp scenen 2,2 ° og få en FIB bilde med 10.000. Resize frese mønstre til 5 mikrometer brede og endre stråle forhold til 5 kV, 0,03 nA. Plasser den øvre mønster over oversiden av microsample, rett opp den øverste kanten, og dikte. Vippe -2,2 ° og gjenta med den nedre side og bunn mønster.
  27. Gjenta 5 kV maletrinn til microsample blir elektronet gjennomsiktig (~ 100 nm tykkelse). Når du er ferdig, lukker gunvalves og fjerne sideinngang holder.

8. Obtaining valgte området diffraksjon mønster på en TEM

  1. For å forberede instrument for analyse, fylle både Dewar flasker med flytende nitrogen og sette den akselererende spenning til 300 kV.
  2. Etter prøveopparbeidelse bruker FIB, fjerne side oppføring holderen fra FIB-SEM og justere pinneposisjon slik at innehaveren lengden stemmer overens med 300 kV TEM. Rotere spissen av holderen til riktig observasjon posisjon, for igjen å sammenligne den med standard TEM holderen sikre korrekt orientering prøven.
    1. Alternativt, ta ut halv rutenett med vedlagt lameller fra FIB-SEM holder og plass i standard TEM holderen.
  3. Installering av prøveholderen inn i utvekslingskammeret for TEM og evakuere kammeret. Forsikre deg om at instrumentet pistolen ventilen er lukket når luft slippes inn i utvekslingskammeret. Når børsen kammeret har pumpet ned, vil en hørbar alarm. Roter prøveholderen med klokken og la vacuum å trekke prøveholderen inn til første stopp.
  4. La instrument vakuum for å komme seg, og deretter åpne pistolen ventilen. Tilbake fokus og zoom til en forstørrelse på om 10,000X.
  5. Bruk justeringsknottene å forskyve strålen til midten av fosforskjerm. Kontrakt og utvide bjelken og sikre at alle strålen bevegelsen er konsentriske. Juster for kondensator stigmatism som nødvendig.
  6. Rotere prøveholderen mot urviseren og tillate vakuumet å trekke holderen helt inn i kolonnen. Bruk scenen bevegelsen knotter å navigere og finne prøven.
  7. Øke forstørrelse på prøven og å justere den Z-høyde inntil prøven er i fokus. Bruk optiske okularene etter behov.
  8. Sett kameraet og ta ut fosfor skjermen. Utvide strålen som er nødvendig for å unngå oversaturating kameraet. Juster fokus og kameraets parametere, og deretter starte oppkjøp for å ta et bilde.
  9. For å få en diffraksjon mønster, først sentrumfunksjon av interesse. Fjern objektiv blenderåpning og sett diffraksjon blenderåpning.
  10. Bytt til diffraksjon objektiv modus ved å trykke på DIFF knappen på kontrollpanelet, og bruk DIFF knappen mot krympe strålen.
  11. Sett tømming som er nødvendig for å forhindre midten av diffraksjonsmønsteret fra brenning kameraet eller fosforskjerm. Begynn kjøpet av kameraet for å ta et bilde av mønsteret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Følgende er noen observasjoner av forkalkning prosessen under metamorfose av tubeworm. Figur 1 viser at de pH-verdier i nærheten av kraven regionen er høyere enn de andre vev etter metamorfose. Figur 2i viser en tubeworm med homogen fordeling av Ca, tyder ingen store forkalkning hendelser har begynt; Figur 2ii viser en tubeworm som har forkalket for en lengre periode, noe som tyder forkalkning har gått utover tiden severdighet; Figur 2iii viser en tubeworm med forkalkning stadium av interesse, som ble valgt for videre analyser for å forstå vevet ansvarlig for mineralisering. Figur 3 viser de høyere pH-verdier er korrelert med de høyere Ca ione-signaler fra både calcein farging og SEM-EDX kartlegging. Fra disse observasjonene, ble vevet fra livet fasen av interesse undersøkes ved en heigher oppløsning ved hjelp av en mer lokalisert teknikk, SEM-EBSD. Ved oppdagelsen av mineralfasen, Figur 4 viser påføringen av fokuserte ionestråle å løfte ut det materiale av interesse for TEM og utvalgt område sjonsanalyse for å bekrefte krystalliniteten av mineralet.

Figur 1
Figur 1: Intracellulær pH kartlegging av tubeworm (fra Chan et al 2015).. På 71 timer etter IBMX behandling, en tubeworm, Hydroides elegans, som representerer langsomt metamorfose demonstrerer en stor heterogenitet i den intracellulære pH distribusjon. DIC bilde (øverst til venstre) og pseudocolorized sammensatte bilder som genereres fra de grå verdiene ved 640 nm delt gråverdier på 580 nm (øverst til høyre) er vist. De beregnede gråtoneverdier fra 640/580 nm-forholdet er proporsjonalt med den intracellulære pH. den profiles av de grå verdiene fra de sammensatte bilder, ble konvertert til de intracellulære pH-verdier over distanse langs den langsgående kroppsakse tubeworm (nedre panel). Forholdet mellom intracellulære pH og 640/580 nm-forholdet i utslipps ble etablert ved in vitro-kalibrering (y = 0.30x - 1,47; R2 = 0,934; y, grå verdi, x, intracellulær pH). Regioner med intracellulær pH ​​over pH 8,5 (i rødt) er tilsvarende de regionene hvor forkalkede strukturer ble funnet. Skala barer = 100 mikrometer; c, krage; b, branchial lapper; maur, anteior; post, posterior. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Identifisere livsfase interessepunkt ved hjelp SEM-EDS.
Tubeworms på uliketidspunkt for metamorfose ble undersøkt for å fange den nylig calcifying scenen for videre analyse (i) En dag en post-metamorfe tubeworm viser homogen fordeling av Ca signal (ii) En raskere vokser dag to post-metamorfe tubeworm viser en kort ring av Ca signal (iii) En saktere vokser dag 2 innlegg metamorfe tubeworm viser flekker av Ca signal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Karakterisering av Ca signaler ved hjelp av levende mikroskopi (fra Chan et al 2015).. (I-iv), SEM-EDS (V-VII) og SEM-EBSD (viii-x). Fordelingen av kalsium ion som korrelert til calcein signal på 31 h og 53 timer etter metamorfose av Hydroides elegans. DIC bilder (venstre panel, 3i og iii) og than Calcein signal (venstre panel, 2ii og iv) vises. Samsvarende elektronmikroskopi på dag to post-metamorfe Hydroides elegans oppdaget flekker av forkalkede strukturer, som vist i en lavere spenning (5 kV) SEM bilde (midtpanelet, 3V). SEM-EDS analyse kartlegging, utført ved 20 kV, viser en heterogen fordeling av kalsium (midtre panelet 3vi, Ca, i gult). Ca Innholdet presenteres som tall overliggende en større overflate detalj av lavere spenning (5 kV) bilde av tubeworm, Ca innhold (mol vekt%, blir desimaler justert for å vise plasseringen av sted analyser) oppnådd fra sted kvantifisering ( med SEM-EDS ved 20 kV) (midten panel; 3vii). Regioner med en Ca-innhold høyere enn 15 mol vekt% er sannsynlig å være forkalkede strukturer. SEM-EBSD analyse av kalsium rik regionene er illuastrated i panel 2viii-x høyre. Kalsium rike regioner (hvit boks) som finnes i SEM-EDS resultater ble videre analysert med EBSD (panel høyre; 3viii) (ii) Sirkelen (høyre panel;3ix) indikerer EBSD analyse nettstedet; en Kikuchi mønster (høyre panel, 2x) antyder nettstedet er aragonittiske fra grensesnittet av EDS / EBSD mikroanalyse programvare. c, krage; b, branchial lapper; maur, anterior; post, posterior. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Karakterisering av krystallinsk struktur ved hjelp av FIB-TEM (fra Chan et al 2015).. (I) Den region som oppviser en Kikuchi mønster fra EBSD ble skåret ut for å fremstille en TEM-prøve, (ii) det fjernede materiale rundt utskåret ved en fokusert ionestråle (FIB) teknikk (sett ovenfra), (iii) materialet ble løftet ved hjelp av en wolfram sonde (sett fra siden), (iv) prøven med en endelig tykkelse på ~ 200 nm, som ble oppnådd ved en lavere spenning. Sirklet område i (v) varanalysert for tilstedeværelse av valgte område-diffraksjonsmønster i en TEM (vi), som viser et enkeltkrystall mønster av aragonitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Live-optisk avbildning er en nyttig metode for å observere cellulære hendelser i en flercellet organisme. Her ble det interne pH og kalsiumioner indikatorer brukes for å måle fluksen av ioner ved mineraliseringssteder. I disse regionene er aktiv ion pumping nødvendig for å heve pH og Ca 2+ konsentrasjon å aktivere forkalkning to, tre. Ved påføring av fluorescerende molekyler for å studere en organisme, er det viktig å sikre at den anvendte konsentrasjon har neglisjerbar toksisitet og gjør det mulig for organismen å utføre i et fysiologisk relevant måte. En lavere farging konsentrasjon vil være mindre toksisk, og er vanligvis kombinert med en lengre tid flekker 10. Det er viktig å holde en lav tetthet av larver i løpet av inkubasjonstiden, minimalisere oksygenmangel og avfall akkumulering i fargingstiden.

Før forfølge FIB / TEM metoder, som innebærer en lokalisertregion av interesse, er det viktig å skjerme gjennom livsfase og vev av interesse å bruke lavere oppløsning metoder som SEM-EDS og SEM-EBSD. Observerer prøven under tilbakespredte modus lar visualisering av relativ elementær komposisjon der lysere kontrast korrelerer til tyngre atomvekt 11. Derfor SEM-BSE bilder gir også en estimering av hvor de tyngre elementer som kalsiumioner og Osmium farget lipid dråper er plassert. SEM-EDS analyse gir mer spesifikk avbildning av kalsiumioner på prøvene. Men det betyr ikke bekrefte tilstedeværelse av krystallinsk CaCO 3. SEM-EBSD tillater påvisning av krystallinske strukturer, selv om konvensjonelle EBSD metoder krever en polert overflate 12. Denne studien viser hvordan SEM-EBSD på en upolert prøve kan gi nyttig informasjon. En 20 kV strålestrømmen muliggjør større dybde av analyse ved prøvens overflate. Derfor er EBSD en ønskelig metode for å detekteretilstedeværelsen av biomineral, særlig på små, intakte biologiske prøver som marine larver. Selv om upolert prøvene ville gi ut falske negativer når mineralene ikke er vendt mot detektoren ved ca. 70 °, ser en Kikuchi mønster er ansett for å være utvetydig bevis av en mineralfase ved området av interesse 13.

Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) gjør det mulig strukturell karakterisering av et bredere spekter av materialer 14. Det fokuserte ion stråle (FIB) åpner for stedsspesifikke utvinning og forberedelse av en prøve med typiske dimensjoner for TEM analyse 15. Derfor er det FIB / TEM teknikk en egnet metode for å analysere nylig avsatt biomaterialer på et lokalisert område. Kombinerte FIB-SEM-instrumenter også tillate skadefri observasjon av en prøve ved bruk av en integrert elektronstråle-kolonne. Wolfram frese belegg av prøven øker ledningsevnen og grenser ion jegmplantation og bestråling skade av prøven 16. Bruken av en fint fokusert ionestråle med en lav oppholdstid muliggjør maling av organiske materialer. Inne i FIB-SEM, kan en bestemt funksjon av interesse være hentet fra en bulk prøven og tynnet til elektron åpenhet for TEM-analyse 17. På grunn av den høye energi av ionestrålen, kan det krystallinske materialer gjøres amorf. Dette kan forekomme ved fremstilling av en tynn lamell for TEM-analyse, og kan reduseres ved å bruke en lav akselererende spenning ionestråle for å fjerne den amorfe lag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hexamethyldisilazane  Electron Microscopy Sciences 16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine ThermoFisher Scientific PHZ1124
Nigericin, Free Acid ThermoFisher Scientific N7143-5MG
35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat ThermoFisher Scientific D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate ThermoFisher Scientific C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade VWR BDH0258-500G
Paraformaldehyde
reagent grade, crystalline		 Sigma P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 199-02185
Calcein Sigma C0875
FASW Iwaki Co. Ltd. Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm ADVANTEC A045A047A
ethanol Wako Pure Chemical Industries, Ltd 051-00476
Artificial seawater for buffers by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 191-01665
Potassium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 135-00165
Calcium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 039-00475
Sodium Sulfate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 197-03345
Hydrochloric Acid Wako Pure Chemical Industries, Ltd 089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) Wako Pure Chemical Industries, Ltd 207-06275
2-aminopyridine Wako Pure Chemical Industries, Ltd 011-02775
Orion 5-star Plus pH meter Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 Zeiss
ImageJ NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500 Hitachi
SU6600 VPSEM Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system Hitachi 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
  2. de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
  3. de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
  4. Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
  5. Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14 (1998).
  6. Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
  7. Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
  8. DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
  9. Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97 (2015).
  10. Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
  11. Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
  12. Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
  13. Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
  14. Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  15. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
  16. Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
  17. Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).

Tags

Mikrobiologi Proporsjonellekspansjon pH-måling EDS EBSD Fokusert Ion Beam (FIB) TEM elektronmikroskopi biovitenskap (General)
Karakterisering av Forkalkning Hendelser Bruke levende Optiske og elektronmikroskopi teknikker i en Marine tubeworm
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, V. B. S., Toyofuku, T.,… More

Chan, V. B. S., Toyofuku, T., Wetzel, G., Saraf, L., Thiyagarajan, V., Mount, A. S. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. J. Vis. Exp. (120), e55164, doi:10.3791/55164 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter