Introduction
Биоминерализация представляет собой сложный ряд событий, который соединяет набор клеточных процессов , приводящих к производству изысканно упорядоченных минералов 1. Задача состоит в том, чтобы охарактеризовать как динамический процесс клеточного и сложных минеральных структур с использованием комбинации оптических и электронных методов микроскопии. Повышение внутриклеточного рН способствует образованию кристаллов CaCO 3, следовательно, идентифицирующий этап жизни , который имеет повышенный рН показывает время , когда кальциноз, вероятно, происходит 2, 3.
В кольчатых червей из семейства серпулиды являются общими calcifiers в океане 4. Он также является популярной моделью беспозвоночное для морских исследований, особенно в биообрастания 5, 6. В этом исследовании, процесс кальцификации минерализующих отсеков Дуринаблюдается нг биоминерализация. Быстрый процесс метаморфоза включает появление карбоната кальция структур 7, 8.
Мы показываем, как внутренний рН измерения могут быть выполнены на tubeworm, и как жизненные этапы и ткани, имеющие отношение к кальцификации могут быть подвергнуты скринингу. После того, как этап жизненного интереса идентифицируется, ткань отвечает за кальцификации может характеризоваться более высоким разрешением с помощью электронной микроскопии. С помощью флуоресцентной микроскопии, мы определяем время, необходимое для карбоната кальция, чтобы появиться после метаморфического индукции. Подобный этап жизни был впоследствии визуализировали с помощью SEM-EDS для элементного распределения состава, и осажденный минерал анализировали с использованием двух различных методов электронной микроскопии, в частности, SEM-EBSD и FIB-ПЭМ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Скрининг сценической жизни и тканей интересов с живых изображений
- Культура морской личинки компетенции в соответствии с ранее описанными методами 6, 7, 9. Выдержите личинки tubeworm при 5 личинок на плотность мл с фильтрованной морской водой с 10 мкМ Snarf-1 AM в течение ночи. Накройте контейнер с алюминиевой фольгой для защиты флуоресцентного зонда от фото-отбеливание.
- Обратите внимание на личинок с помощью микроскопа рассечение. Личинки Грамотная tubeworm готов к метаморфоз будет плавать в прямом направлении, а не кругового движения.
- Передача компетентную личинок сито 60 мкм. Нажмите сетку против чашку Петри, обеспечивая хорошее уплотнение, чтобы удерживать жидкость. Быстро освободить уплотнение, чтобы освободить и выбросьте морскую воду, содержащую флуоресцентный краситель, сохраняя при этом личинки.
- Промыть личинок с фильтрованной искусственной морской воде (FASW) дважды, принимаяосторожность, чтобы не иссякнуть личинок в процессе.
- Поместите 10 до 20 личинок в тонких со стеклянным дном посуды 5 мл FASW , содержащей 10 -4 М изобутилметилксантина (IBMX) для наблюдения процесса метаморфоза.
- Вставьте кубы фильтра для обнаружения Snarf-1 сигнал (Канал 1: Ex 510/25 580/30 Em; Канал 2: Ex 510/25 Em 640/35) и DIC образ личинок.
- Расположите личинки изменяясь под цели 20Х, а затем, оптимизировать время выдержки (100-300 мс) достаточно быстро, чтобы гарантировать, что четкое изображение живых животных захватывается.
- Установить расстояние 1 мкм, чтобы захватить Z-стек всех трех каналов, при визуализации живого животного, визуализации каждого слоя для всех трех каналов, прежде чем перейти к следующему слою направлении г позволит лучше корреляцию между каналами.
- Экспорт масштабировать изображения серые для всех каналов и слоев, как TIF файлов с программным обеспечением микроскопа: File | Экспорт | Тип файла TIF | Начало.
- Использование ImageJ, импорт последовательность изображений для каждого канала: Файл | Импорт | Последовательность изображений.
- Для импорта канала 1 λ 1 их, ввести начальное изображение 3 и приращение: 4.
- Для импорта канала 2 λ 2 их, ввести начальное изображение 4 и приращение: 4.
- Генерация составного изображения путем деления Х 2 ет на λ 1 EM для каждого слоя пиксель за пикселем (Process | Image Calculator ... | Графический файл 640 нм "разрыв" файла изображения 580 нм), т.е. 640/580 нм отношение.
- Выберите изображение | Таблицы поиска | 16 цветов.
- Выберите Анализ | Инструменты | Калибровка бар.
- Проверьте различные слои, идентифицирующий слой, содержащий большую разнородность. Это обеспечивает наиболее полезную информацию о внутреннем распределении рН.
- Используя связь между отношением 640/580 нм и рН, построить профиль участок визуализировать распределение внутреннего рН.
- После ночного окрашивания около 20 личинок с 10 мкМ Snarf-1 AM, добавить на складе решений нигерицина и KCl, чтобы компенсировать 50 мкМ нигерицина и 150 мМ KCl для калибровки.
- Доводят рН калибровки AFSW разбавленной NaOH или HCl, пока рН около 5,9 не будет достигнута. Обратите внимание, точное значение рН. Мера рН с помощью рН - метра со стеклянным электродом , который был откалиброван по морской воды на основе 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола (Трис) и 2-аминопиридин 9.
- Передача одного окрашенную личинок tubeworm вместе с жидкостью с известным рН для сухой и чистой тарелки для измерения интенсивности сигналов при 640 нм и 580 нм.
- Повторите шаги 2.2 и 2.3 для более четырех точек рН в диапазоне от 5,9 до 9,9. Они представляют собой ряд физиологически соответствующих значений.
- Убедитесь, что сигналы появляются гомогенным по всему телу животного. Это указывает на то, что внутриклеточная рН было еquilibrated с окружающей морской воды.
- Изображение личинки tubeworm в пяти различных средах морской воды рН, записывают интенсивности , показанные в "серых" значений при 640 нм и при 580 нм, т.е. λ 2 отл и Х 1 отл.
3. Анализ Логометрический визуализации данных
- Введите значения серого, измеренная от пяти случайных местах или из зоны интереса на листе распространения.
- Проверьте калибровку пять точек показали линейную зависимость , чтобы указать внутриклеточный рН (например, уравнение , как у = 0.30x - 1,47; у = серого значения; х = рН; r² = 0,934).
- Вычислить внутриклеточные значения рН из уравнения, используя 640/580 отношение измеренного нм интенсивности на этапе 1.13.
4. Сохранение проб, Обезвоживание и монтаж для электронной микроскопии
- Сохранение стадии жизни интересов с 4% параформальдегидом. в этом исследовании, Зафиксировать кольчатых червей 2-4 дня после прикрепления, не держать животных в фиксаторе до анализа.
- Работая в вытяжном шкафу, после фиксации образца с 1% осмия водного раствора четырехокиси в течение 30 мин, чтобы свести к минимуму усадку тканей в процессе дегидратации.
- Высушить образца с серии градуированных этанола: 50% этанол в течение 5 мин, 70% этанола в течение 5 мин, 85% этанола в течение 5 мин, 95% этанола в течение 5 мин, и, наконец, абсолютный этанол в течение 5 мин дважды.
- Работая в вытяжном шкафу, добавьте 1: раствор 1 этанола и гексаметилдисилазана (HMDS) к образцу, что позволяет жидкости испаряться полностью.
- В вытяжном шкафу, добавьте 100% HMDS в образце, что позволяет жидкости испаряться полностью.
- Используя алмазный нож, ввести несколько сокращений культуры блюдо, окружающих несколько кольчатых червей. С крышкой, держать блюдо дно с алюминиевой заглушкой, чтобы сломать блюдо.
- Под микроскопом рассечение, найти сломанную часть, содержащую интактный tubeworm,
- Нанесите краску на серебряной алюминиевой заглушки и закрепить фрагмент Заглушке тщательно. Краска по краям пластикового фрагмента, чтобы уменьшить время зарядки.
5. Обнаружение кальция Рич региона с помощью SEM-EDS
- Закрепите образец заглушки на держатель образца.
- Измерьте высоту всего узла с датчика, снабженного микроскопом, регулируя высоту, ослабив стопорную шайбу и вращая штангу, пока образец не находится на стандартной высоте, или ввести высоту, как записано.
- Признайтесь воздуха в теплообменной камере микроскопа и поверните дверцу камеры открытой. Вставьте держатель образца на конце обмена стержня. Затем закройте и вакуумировать камеру.
- Откройте задвижку и выдвиньте шток обмена в направлении микроскопа камеры. Вставьте обменно стержень весь путь, чтобы полностью вместить держатель образца в столик микроскопа. Снимите шток обмена и закройте задвижку.
- Ввод тон образец размеры и отправить на сцену в исходное положение, чтобы поместить образец под столбцом электронов.
- Установите уровень вакуумной камере до 20-30 Па в режиме VP-SEM. Установите электронный ускоряющее напряжение до 20 кВ и включить высокое напряжение на.
- Поднимите сцену на образец рабочей дистанции 10 мм. Приобретать живой корм и найдите образец. Оптимизация изображения Регулировка астигматизма и фокус по мере необходимости.
- Откройте программу SEM-EDS и выберите опцию режима EDS-SEM. Выберите пункт меню для запуска карты EDS.
- Изменение конденсатора объектива и диафрагмы для достижения мертвое время ~ 30%, в то время процесса 3, как отслеживается через измеритель скорости в программе SEM-EDS. Запуск процедуры луча и выравнивания диафрагмы после внесения каких-либо изменений в настройки луча.
- Выберите масштаб таким образом, что единый организм заполняет все поле зрения. Включите опцию коррекции дрейфа и захвата изображения в программе SEM-EDS.
- Приобретать мар данные с заполнением организм до всего поля зрения, используя время выдержки 50-100 мс. Выполнить карту, пока данные не показывает четкую локализацию Са в организме (приблизительно 15 мин).
- Для получения данных от точки количественного определения, изменения времени процесса до 6 и отрегулировать электронный зонд приобрести мертвое время ~ 30%. Выполнить шаги выравнивания и оптимизации изображения по мере необходимости.
- Выберите точку и опцию ID в программе SEM-EDS и приобрести другое изображение. С помощью одного инструмента точки, нажмите на тех областях, которые появились Ca богатый на карте СЭД, а также Са-дефицитных областей для сравнения. Сканирование каждую точку в течение живого времени 30 с.
6. Определение кристаллографической информации кальция богатых регионов с помощью сканирующего электронного микроскопа-ЭИ
- Удалите пластиковые фрагмент, содержащий образец интереса со стороны плоского образца заглушкой и прикрепить к скошенной поверхности 45 ° предварительно наклонена заглушкой с использованием серебра проводящего клея.
- Винт заглушки на образец чстарше и положение наклонной грани на заглушке (с образцом), по направлению к передней части держателя образца. Вставьте держатель образца в камеру микроскопа с помощью обменной камеры.
- Установите вакуумной камере до 30 Па и электрон ускоряющее напряжение до 20 кВ. Отправить образец под столбцом электронов и наклон 25 ° этап поместить поверхности образца приблизительно 70 ° от нормали к электронным пучком. Включите высокое напряжение на.
- Поднять сцену в рабочее расстояние ~ 18 мм. Используйте трекбол, чтобы переместить сцену и найти образец. Увеличение коэффициента увеличения кадра специфические особенности, представляющие интерес. Совместите луч и оптимизировать изображение по мере необходимости.
- Откройте программу SEM-EDS в режиме EBSD. Выберите кальцит и арагонит как фазы, представляющие интерес. Вставьте камеру ЭИ на расстоянии 154 мм. Установить условия камеры 1 х 1 биннинга и времени кадра 100 мс. Используя быстрый растр луча, приобретают фон.
Примечание: Различные частоты кадровможет потребоваться в зависимости от электронного зонда; отрегулировать частоту кадров или зонда камеры для достижения сигнала примерно на 90%. - Захват изображения в программе SEM-EDS. С помощью инструмента анализа пятна и нажмите где-нибудь на изображение, чтобы сканировать луч на этой точке. Обратите внимание на окно камеры, чтобы увидеть, если какие-либо модели Кикучи обнаружены.
- Нажмите на разных участках изображения для сканирования потенциальных участков кальцификации, наблюдая окно камеры в каждой точке, чтобы увидеть, если Кикучи полосы присутствуют. Если модели присутствуют и соответствует ни одному из выбранных фаз в базе данных, они будут автоматически проиндексированы.
7. TEM Приготовление образца С помощью FIB-SEM
- Sputter пальто подготовленные образца SEM с платиной или подобным материалом для создания проводящего слоя.
- Поместите ранее фиксированные, обезвоженные и смонтированные образцы в корпус распыл для нанесения покрытий и включите питание, чтобы начать прокачку камеру вниз.
- После того, как вакуумная камера считывает 40 мТорр или менее, повернуть переключатель газа на и увеличить поток газа аргона для достижения давления в камере 200 мТорр. Отрегулируйте подачу газа для достижения конечного давления в камере 80 мТорр.
- Поверните переключатель напряжения на и увеличить напряжение, чтобы достигнуть ток 15 мА. Установите таймер и пальто в течение длительного времени (~ 10 мин), чтобы создать толстый слой (~ 60 нм), который защищает поверхность образца от повреждения ионного облучения. Регулировать напряжение для поддержания стабильного 15 мА тока.
- После завершения, выключения питания устройства для нанесения покрытий, чтобы освободить вакуум и удалить образец.
- Винт основание Приготовленную, разбрызгивание образец, нанесенный на винтовой пост M4 держателя инструмента образца. Затянуть до руки туго, ослабьте стопорную гайку, а затем поверните держатель образца пост, чтобы изменить высоту сборки. Используйте датчик высоты лазерной и регулировать высоту, чтобы быть в пределах 1 мм (= 0,04 дюйма, как показано на видео) стандартного коммерцd с прибором.
- Закройте все клапаны пистолета в FIB-SEM, а затем признать воздуха в eucentric ступени воздушного шлюза. После того, как давление выравниваются с окружающей средой, скользят блокировки открыт воздух и прикрепить держатель образца на штырьков обменного стержня. Поверните ручку на конце обменного стержня в положение "LOCK". Закройте воздушный замок и эвакуировать шлюзовую камеру воздуха.
- После того, как замок eucentric эстрада был эвакуирован, а давление совпадает с камеры FIB-SEM, открыть задвижку и вставьте образец, нажав на биржевом стержня. Вставьте обменно стержень всю дорогу, чтобы сесть держатель образца на стадии прибора eucentric, а затем поверните обменный стержень в положение "разблокировать". Вставьте стержень обмена обратно и закрыть задвижку.
- Переместить сцену, чтобы поместить образец в колонке ионного пучка. Откройте запорные клапаны и приобретают живой ион-индуцированное вторичное электронное изображение FIB. Используйте низкий увеличением ибыстро растрового сканирования, чтобы свести к минимуму повреждения ионов. Сбросить фокус нормального луча наблюдения и поднять высоту Z сцены, пока образец не находится в фокусе. В этот момент образец находится в положении крестовой, где оба иона и электронные пучки ориентированы в том же месте.
- Использование вторичного электронного изображения из SEM, найти интересующую область в образце, используя трекбол для перемещения образца вокруг. Сферы интересов являются Са богатые районы, ранее определенные отображения СЭД. Поверните сцену по мере необходимости, чтобы получить интересующие вас объекты в соответствии с рамой окна.
- На интерфейсе FIB окна, захватить быстрый снимок образца при увеличении 1,000X с дополнительным цифровым зумом 2X и сделать шаблон для осаждения на ~ 8 мкм × 2 мкм над областью интереса. Размер увеличения коробки осаждения может быть скорректировано с учетом особенностей различных размеров. Установите условия для ионно-плазменным напылением нагара с использованием 40 кВ, 0,09 нА луч, используя время выдержки 0,5 мкс в течение 5 мин.
- После осаждения углерода, изменение условий осаждения для осаждения вольфрама с использованием 40 кВ, 0,7 нА пучка и депозит в течение 5 мин, чтобы генерировать вольфрамовую мкм колпачок с ~ 2-3.
- Захват FIB снимок с помощью луча наблюдения и использовать инструмент микрообразцов распылением нарисовать узор из четырех коробок вокруг крышки вольфрама. Установите верхние и нижние коробки, чтобы быть приблизительно 15 мкм х 8 мкм; правая коробка 10 мкм х 5 мкм, а левое окно 6 мкм х 5 мкм, или достаточно большой, чтобы окружить область интереса.
- Изменить условия изготовления сократить с использованием 40 кВ, 19 нА пучка, и время задержки 50 мкс, и 3-4 кадров сканирования для каждой из коробки. Затем изготовить шаблон. После изготовления, интересующей области, с защитными C и W слоев, будет напоминать остров, со всеми смежными удаляемого материала на верхней, нижней и правой сторон.
- Наклоните этап 58 °, чтобы поставить SAMPле нормали к поверхности колонны электронов и под острым углом по отношению к ионообменной колонке. Найдите заднюю часть образца "остров" с помощью FIB и захвата снимка при увеличении 1,000X и 2-4x цифровым зумом.
- Нарисуйте ~ 15 мкм × 2 мкм рисунок распылением над нижней части задней стороны образца "острова" в самом конце, где она видна. Изготовить коробку, используя балку 4 нА в течение 3 мин, или до тех пор пока луч не прорезать дно образца "острова".
- Наклоните eucentric Stage -58 ° от текущей позиции (обратно к нулю). Вставьте вольфрамовой микрообразцов зонд, нажав кнопку "Probe In" в интерфейсе FIB. Выберите "MS" на панели управления стадии и использовать трекбол для перемещения зонда над верхней части образца.
- Приобретать в прямом эфире с ФВБ при увеличении 1 кх и расположить датчик таким образом, что наконечник находится прямо над правой стороны вольфрама колпачка микрообразца. Наблюдая живойSE изображения из SEM, используйте ручку управления Z панели ступени, чтобы опустить зонд, пока он контактирует с вольфрамовой крышкой. Зуммер будет звучать, как только контакт был сделан.
- Захват снимок с помощью FIB с использованием 40 кВ, 0,01 нА пучка, при увеличении 1,000X и 2-кратным цифровым зумом. С помощью инструмента осаждения нарисовать окно х 2 мкм 2 мкм через наконечник зонда, где он контактирует с вольфрамовой колпачок микрообразца.
- Установите условия для осаждения вольфрама с использованием 40 кВ, 0,09 нА пучка, в течение 2 мин и время выдержки 0,5 мкс. Затем изготовить шаблон.
- Нарисуйте ~ 2 мкм х 5 мкм рисунок распылени над левым концом микрообразца "рука" (где он все еще подключен к объему образца). Изготовить шаблон с помощью 40 кВ, 0,7 нА пучка, в течение 2 мин, или до тех пор пока сигнал не указывает на то, что микрообразца был отделен от объемного образца.
- С помощью ручки управления Z, чтобы поднять зонд с прикрепленным микрообразца доона очищает объемный образец, а затем отведите зонд. Отправить этап eucentric либо на дому или положение Exchange.
- Поместите медный половину сетки в держатель бокового входа и загрузите держатель в боковой вход этап продувки камеры. Откачать камеру и вставьте держатель бокового входа. Установите держатель в положение FIB.
- Нажмите сбоку на панели управления стадии и использовать трекбол, чтобы принести половину сетки в поле зрения на мониторе FIB. Переместить, чтобы очистить площадь половины сетки и с помощью ручки Z, чтобы довести поверхность в фокусе.
- Пресс-зонд в систему, чтобы вставить зонд, нажмите MS на панели управления стадии, и используйте ручку трекбола и Z в положение микрообразца через половину сетки. Опустите зонд до микрообразца контактов сетки.
- Захват изображения на FIB при 1,000X увеличении (2X зум). С помощью инструмента осаждения и нарисуйте узор на ~ 10 мкм х 3 мкм по нижней стороне микрообразца. Депозит вольфрама с 40 кВ, 0,7 нА пучка, используя обитать тIME 0,5 мкс в течение 3 мин.
- С помощью инструмента и распылением нарисуйте небольшой 1 мкм рисунок х 3 мкм над кончиком зонда. Изготовить шаблон с использованием 40 кВ, 0,7 нА пучка при времени выдержки 3 мс, чтобы сократить зонд от микрообразца. Отвести зонд один раз бесплатно.
- Захват FIB изображение при увеличении 5,000X и нарисуйте два шаблона ионно-плазменным напылением 7 мкм х 4 мкм в верхней и нижней части микрообразца, оставляя зазор в мкм ~ 1 между ящиками. Сосредоточьте узоры таким образом, чтобы не отрезать левую и правую стороны микрообразца. Изготовить оба шаблона с использованием 40 кВ, 4-нА заряда пучка и время выдержки 3 мкс, в течение 2 мин, определение направления растра по направлению к центру микрообразца.
- Захват другое изображение с помощью луча наблюдения FIB на 5,000X. Изменение размера предыдущие коробки брызгать слюной до ~ 6,5 мкм х 1 мкм, сближаются, чтобы оставить зазор ~ 0,5 мкм, и изготовить с использованием 40 кВ, 0,7 нА пучка.
- Наклоните этапе ввода боковую 0,5 ° и колпачокTURE другой FIB изображение. Изменение размера распыл коробки шириной до 6 мкм. Поместите верхний рисунок над верхней стороной микрообразца и изготовить с использованием 40 кВ, 0,7 нА пучка. Наклон -0.5 ° и повторить с нижним рисунком, распыл и нижней стороне микрообразца.
- Дальнейшее уменьшение ширины шаблона на ~ 0,5 мкм. Наклон 0,5 ° и бормотать верхнюю сторону микрообразца с использованием 40 кВ, 0,09 нА пучка. Повторите с нижней стороной при -0.5 ° наклона.
- Наклоните этап 2,2 ° и приобрести FIB изображение на 10,000X. Изменение размеров моделей с ионно-плазменным напылением шириной 5 мкм и изменить условия луча до 5 кВ, 0,03 нА. Поместите верхний рисунок над верхней стороной микрообразца, вплоть до верхнего края, и изготовить. Наклон -2.2 ° и повторить с нижней стороной и нижней шаблон.
- Повторите 5 шагов фрезерных кВ до микрообразца не станет прозрачной электронной (~ 100 нм толщиной). После того, как закончите, закройте gunvalves и снимите держатель бокового входа.
8. Obtaining Выделенная область дифракционный рисунок на ПЭМ
- Для того, чтобы подготовить инструмент для анализа, как заполнить Дьюара колб с жидким азотом и установить ускоряющее напряжение до 300 кВ.
- После подготовки образца с помощью FIB, снимите держатель входа сбоку от FIB-SEM и отрегулируйте положение штифта таким образом, чтобы длина держателя, что соответствует кВ ТЭМ 300. Поверните наконечник держателя в правильное положение наблюдения, в очередной раз, сравнивая его со стандартным держателем TEM для обеспечения правильной ориентации образца.
- В качестве альтернативы, удалите половину сетки с прикрепленными пластинками из держателя FIB-SEM и место в стандартном держателе ПЭМ.
- Загрузите держатель образца в обменном камеру ПЭМ и вакуумировать камеру. Убедитесь в том, что пистолет клапан инструмент закрывается, когда воздух поступает в камеру обмена. После того, как замена камера подкачала вниз, звуковой сигнал будет звучать. Поверните держатель образца по часовой стрелке и позволяют Vācuгм, чтобы вытащить держатель образца, чтобы на первой позиции остановки.
- Разрешить вакуумный инструмент для восстановления, а затем открыть клапан пистолета. Сброс фокуса и масштабирования до увеличения приблизительно 10,000X.
- С помощью ручки выравнивания для смещения луча к центру экрана люминофором. Контракт и расширение луча и обеспечить, чтобы все движения луча концентрическими. Отрегулируйте для конденсатора честолюбия по мере необходимости.
- Поворот держателя образца против часовой стрелки и позволяют вакуум, чтобы вытащить держатель полностью в колонну. С помощью перемещения ручки этапа для навигации и обнаружения образца.
- Увеличение увеличение на образце и отрегулировать Z-высоту, пока образец не находится в фокусе. Используйте оптические окуляры по мере необходимости.
- Вставьте камеру и удалить люминесцентный экран. Разверните луч по мере необходимости, чтобы избежать oversaturating камеры. Настройка фокуса и камеры параметров, а затем начать сбор для захвата изображения.
- Чтобы получить дифракционную картину, первый центр вособенностью интереса. Снимите апертуры объектива и вставьте дифракционную диафрагму.
- Изменение в режиме дифракционной линзы, нажав на кнопку DIFF на панели управления и использовать ручку управления DIFF, чтобы уменьшить луч.
- Вставьте подавитель по мере необходимости, чтобы предотвратить центр дифракционной картины от выгорания экрана камеры или люминофора. Начало приобретения камеры для захвата изображения шаблона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ниже приведены некоторые наблюдения процесса кальцинации во время метаморфоза tubeworm. На рисунке 1 показано , что значения рН вблизи области воротниковой выше , чем в других тканях после метаморфоза. Рисунок 2г показывает tubeworm с однородным распределением Са, предполагая никаких серьезных кальцификации событий не началось; Рисунок 2П показывает tubeworm , который кальцинированная в течение более длительного периода, что предполагает кальцификации вышел за пределы времени точки интереса; Рисунок 2iii показывает tubeworm со стадией кальцификации интереса, который был выбран для дальнейшего анализа , чтобы понять ткани , ответственного за минерализацию. Рисунок 3 показывает более высокие значения рН коррелируют с более высокими ионных сигналов Са от обоих кальцеиновой окрашивания и картирования SEM-EDX. Из этих наблюдений, ткань от стадии жизненного интереса был рассмотрен на приветGher разрешение использовать более локализованный технику, SEM-EBSD. После открытия минеральной фазы, на рисунке 4 показано применение сфокусированным ионным пучком , чтобы поднять из материала , представляющего интерес для ТЭМ и выбранного анализа область дифракции для подтверждения кристалличности минерала.
Рисунок 1: внутриклеточная отображение рН tubeworm (от Chan и соавт 2015.). В 71 ч после обработки IBMX, A tubeworm, Hydroides Элеганс, который представляет собой более медленный темп метаморфоза демонстрирует большую гетерогенность в внутриклеточное распределение рН. DIC изображение (слева вверху) и pseudocolorized композитные изображения, генерируемые из значений серого при 640 нм, деленное на серых значений при 580 нм (вверху справа) показаны. Рассчитанные значения серого от отношения 640/580 нм пропорциональна внутриклеточного рН. Profiле серых значений из композитных изображений, были преобразованы в внутриклеточных значениях рН на расстояние вдоль продольной оси тела в tubeworm (нижняя панель). Соотношение между внутриклеточного рН и соотношение 640/580 нм в эмиссии была установлена в пробирке калибровки (у = 0.30x - 1,47; R2 = 0,934; у, значение серого; х, внутриклеточный рН). Области с внутриклеточного рН выше рН 8,5 (в красном) имеют соответствующие регионы, где были обнаружены кальцинированные структуры. Масштабные полоски = 100 мкм; с, воротник; б, жаберные лепестки; муравей, anteior; пост, задняя. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Определение стадии жизненного интереса с помощью SEM-EDS.
Кольчатых червей при разныхмомент времени метаморфоза были экранированы, чтобы захватить вновь обызвествляющиеся этап для дальнейшего анализа (I) День 1 пост-метаморфических tubeworm показывает равномерное распределение сигнала Ca (II) Быстрее растет 2-й день после метаморфические tubeworm показывает короткое кольцо сигнала Ca (III) медленнее растет 2-й день пост метаморфических tubeworm показывает пятна сигнала Са. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Определение характеристик сигналов Ca с использованием живой микроскопии (от Chan и др 2015.). (I-IV), SEM-EDS (V-VII) и SEM-ЭИ (VIII-X). Распределение ионов кальция , как коррелируется с сигналом кальцеиновой на 31 ч и 53 ч после метаморфоза из Элеганс Hydroides. Изображения DIC (левая панель, 3i и III) и тон кальцеиновыми сигнал (левая панель, 2П и IV) показаны. Коррелятивное электронная микроскопия на 2 -й день после метаморфических Элеганс Hydroides обнаружены пятна кальцифицированных структур, как показано на более низком напряжении (5 кВ) СЭМ - изображение (средняя панель, 3в). отображение анализа SEM-EDS, осуществляется при 20 кВ, показывает неоднородное распределение кальция (средней панели, 3vi, Ca, желтым цветом). Содержание Ca представлены в виде чисел, наложенной большую поверхность детали низкого напряжения (5 кВ) изображение tubeworm, Са содержание (мол% вес, десятичные точки выровнены, чтобы показать расположение пятна анализов), полученные из пятна количественной оценки ( с SEM-EDS при 20 кВ) (средняя панель; 3vii). Области с содержанием Ca выше, чем 15 мол% по весу, вероятно, будут кальцифицированным структуры. SEM-ЭИ анализ кальция богатых регионов illuastrated в правой панели 2viii-х. Богатые регионы кальция (белая коробка), как в результатах SEM-EDS были дополнительно проанализированы с помощью EBSD (правая панель; 3viii) (II) Круг (правая панель;3iX) указывает на сайт анализа ЭИ; картина Кикучи (правая панель; 2x) предлагает сайт арагонитовый из интерфейса / ЭИ микроанализа программного обеспечения СЭД. с, воротник; б, жаберные лепестки; муравей, передний; пост, задняя. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Определение характеристик кристаллической структуры с помощью FIB-ПЭМ (от Chan и др 2015.). (Я) Область выставляется образец Кикучи из EBSD вырезают для получения образца ТЕМ, (II) снятую окружающий материал, вырезанную с помощью сфокусированного ионного пучка (FIB) техники (вид сверху), (III) материал был снят с использованием вольфрамовый зонд (вид сбоку), (IV), образец с конечной толщиной ~ 200 нм, который был получен при более низком напряжении. Объезжанная область в (v) былианализировали на наличие выбраны междугородним дифракционной картины в ПЭМ (VI), показывая монокристаллический образец арагонит. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Живая оптическая томография является полезным методом для наблюдения клеточных событий в многоклеточного организма. Здесь, внутренние показатели рН и ионов кальция, были использованы для измерения потока ионов на минерализация участках. В этих регионах, активный ион накачки требуется , чтобы поднять рН и концентрацию Ca 2+ , чтобы включить кальцификации 2, 3. При нанесении флуоресцентных молекул для изучения организм, чрезвычайно важно, чтобы гарантировать, что используемая концентрация имеет незначительную токсичность и позволяет организму выполнять в физиологически соответствующим образом. Более низкая концентрация окрашивание будет менее токсичным и, как правило , в сочетании с более длительным временем окрашивания 10. Важно, чтобы держать низкую плотность личинок во время инкубации, сводя к минимуму лишение кислорода и накопления отходов в период окрашивания.
До преследуя методы FIB / TEM, который включает в себя локализованнуюобласть интереса, это имеет решающее значение для скрининга через стадию и ткани интереса с использованием методов с низким разрешением, как SEM-EDS и SEM-EBSD жизни. Наблюдая образец под обратнорассеянного режиме позволяет визуализировать относительного элементного состава , где легче контраст коррелирует с более тяжелым атомным весом 11. Таким образом, SEM-BSE изображения также обеспечивают оценку, где тяжелые элементы, такие как ионы кальция и осмий окрашенными липидных глобул расположены. Анализ SEM-EDS позволяет более конкретное отображение ионов кальция на образцах. Тем не менее, это не подтверждает наличие кристаллической CaCO 3. SEM-ЭИ позволяет обнаружить кристаллических структур, хотя традиционные методы ЭИ требуют полированной поверхности 12. Это исследование показывает, как SEM-ЭИ на необработанного образца может дать полезную информацию. Ток пучка 20 кВ обеспечивает большую глубину анализа на поверхности образца. Поэтому ЭИ является желательным методом для обнаруженияналичие Биоминеральные, особенно на небольших, неповрежденных биологических образцов, таких как морских личинок. Хотя неполированный образцы дали бы ложные негативы , когда минералы не сталкиваются детектор при температуре около 70 °, видя образец Кикучи считается однозначным свидетельством минеральной фазы в интересующей области 13.
Методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) позволяет структурную характеристику более широкого спектра материалов 14. Сфокусированный пучок ионов (FIB) позволяет на конкретных участках добычи и подготовки образца с характерными размерами для анализа TEM 15. Поэтому методика FIB / TEM представляет собой подходящий метод для анализа вновь осажденные биоматериалы на локализованном участке. Комбинированные FIB-SEM инструменты также позволяют без повреждений наблюдение образца за счет использования интегрированной колонки электронного пучка. Вольфрам покрытие распылением образца повышает проводимость и пределы ионов Implantation и облучение повреждение образца 16. Использование тонко сфокусированным пучком ионов с малым временем задержки позволяет фрезерование органических материалов. Внутри FIB-SEM, конкретный признак интереса могут быть извлечены из массивного образца и разбавить электронов прозрачности для анализа TEM 17. Из-за высокой энергии пучка ионов, кристаллические материалы могут быть аморфизации. Это может произойти при подготовке тонкую ламель для анализа ПЭМ и могут быть смягчены с использованием низких ускоряющих ионного напряжения пучка для удаления аморфного слоя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexamethyldisilazane | Electron Microscopy Sciences | 16700(EM) | |
| Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 19192 | |
| IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine | ThermoFisher Scientific | PHZ1124 | |
| Nigericin, Free Acid | ThermoFisher Scientific | N7143-5MG | |
| 35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat | ThermoFisher Scientific | D110400 | |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | ThermoFisher Scientific | C-1271 | |
| BDH Potassium Chloride, ACS Grade | VWR | BDH0258-500G | |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline |
Sigma | P6148 | |
| 1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 083-01095 | |
| 0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 199-02185 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| FASW | Iwaki Co. Ltd. | Rei-sea Marine | |
| Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm | ADVANTEC | A045A047A | |
| ethanol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 051-00476 | |
| Artificial seawater for buffers | by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf | ||
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 191-01665 | |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 163-03545 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 135-00165 | |
| Calcium Chloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 039-00475 | |
| Sodium Sulfate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 197-03345 | |
| Hydrochloric Acid | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 089-08415 | |
| 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 207-06275 | |
| 2-aminopyridine | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | 011-02775 | |
| Orion 5-star Plus pH meter | Thermo Scientific | ||
| PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP | Thermo Scientific | ||
| Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 | Zeiss | ||
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| HRTEM H500 | Hitachi | ||
| SU6600 VPSEM | Hitachi | ||
| NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system | Hitachi |
References
- Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
- de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
- de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
- Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
- Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14 (1998).
- Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
- Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
- DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
- Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97 (2015).
- Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
- Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
- Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
- Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
- Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
- Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
- Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
- Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).
