Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Caracterización de la calcificación Eventos en vivo mediante técnicas ópticas y microscopía electrónica en un Gusano Tubícola Marina

Published: February 28, 2017 doi: 10.3791/55164
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biological Sciences, Clemson University, 2Department of Marine Biodiversity Research (BioDive), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Advanced Material Research Laboratory (AMRL), Clemson University, 4Swire Institute of Marine Sciences and School of Biological Sciences, The University of Hong Kong

Introduction

Biomineralización es una compleja serie de eventos, que tiende un puente sobre un conjunto de actividades celulares que resultan en la producción de minerales exquisitamente ordenados 1. El reto es caracterizar tanto el proceso celular dinámica y las estructuras minerales sofisticados usando una combinación de métodos de microscopía óptica y electrónica. Una elevación del pH intracelular favorece la formación de CaCO 3 cristales, por lo tanto, la identificación de la etapa de la vida que tiene un mayor pH revela el momento en que es probable que se produce 2, 3 calcificación.

Los gusanos de tubo de la familia Serpulidae son calcificadores comunes en el océano 4. También es un modelo de invertebrados popular para la investigación marina, especialmente en la contaminación biológica 5, 6. En este estudio, el proceso de calcificación en compartimentos mineralizantes Durise observa ng biomineralización. El rápido proceso de metamorfosis incluye la aparición de estructuras de carbonato de calcio 7, 8.

Demostramos cómo las mediciones de pH interno se puede realizar en el tubeworm, y cómo etapas y tejidos relevantes para la calcificación de la vida puede ser examinado. Una vez que se identifica la etapa de desarrollo de interés, el tejido responsable de la calcificación se puede caracterizar con mayor resolución utilizando métodos de microscopía electrónica. El uso de microscopía de fluorescencia, se determina el tiempo requerido para el carbonato de calcio a aparecer después de la inducción metamórficas. Una etapa similar de la vida se visualizó posteriormente con SEM-EDS para la distribución de la composición elemental, y el mineral depositado se analizó utilizando dos métodos diferentes de microscopía electrónica, específicamente SEM-FIB-EBSD y TEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. La detección de fase de vida y tejido de interés con imágenes en vivo

  1. Cultura las larvas marinas con la competencia de acuerdo con los métodos previamente reportados 6, 7, 9. Incubar las larvas tubeworm en 5 larvas por densidad ml con agua de mar filtrada con 10 mM SNARF-01 a.m. durante la noche. Cubra el recipiente con papel de aluminio para proteger la sonda fluorescente de foto-blanqueo.
  2. Observar las larvas utilizando un microscopio de disección. larvas tubeworm competente listos para la metamorfosis nadará en una dirección hacia adelante en lugar de un movimiento circular.
  3. Transferir las larvas competentes para una malla de 60 micras. Pulse la malla contra una placa de Petri, proporcionando un buen sellado para retener líquido. liberar rápidamente el sello para liberar y deseche el agua de mar que contiene colorante fluorescente, conservando las larvas.
  4. Lavar las larvas con el agua de mar artificial filtrada (FASW) dos veces, teniendocuidado de no secar las larvas en el proceso.
  5. Coloque 10 a 20 larvas en placas de fondo de cristal delgado, con 5 ml de FASW que contiene 10 -4 M isobutilmetilxantina (IBMX) para la observación de proceso de la metamorfosis.
  6. Introducir los cubos de filtros para detectar la señal SNARF-1 (Canal 1: Ex 510/25 Em 580/30; Canal 2: Ex 510/25 640/35 Em) Imagen DIC de las larvas, y.
  7. Coloque las larvas metamorfosis bajo el objetivo 20X, a continuación, optimizar el tiempo de obturación (100-300 ms) lo suficientemente rápido como para asegurar que una imagen clara de los animales vivos es capturado.
  8. Conjunto 1 m de distancia para captar una pila Z de los tres canales, cuando imágenes de un animal vivo, la formación de imágenes de cada capa para los tres canales antes de pasar a la siguiente capa de la dirección z que permitiría una mejor correlación entre los canales.
  9. Exportar imágenes en escala de grises para todos los canales y capas como archivos TIF desde el software de microscopio: Archivo | exportación | Tipo de archivo TIF | Comienzo.
  10. El uso de ImageJ, impuerto de la secuencia de imágenes para cada canal: Archivo | importación | secuencia de imágenes.
    1. Para importar el canal 1 λ em 1, introduzca la imagen inicial y el incremento de 3: 4.
    2. Para importar el canal 2 λ 2 em, introduzca la imagen inicial y el incremento de 4: 4.
  11. Generar una imagen compuesta dividiendo λ 2 λ em por 1 em para cada píxel a píxel capa (Proceso | Calculadora de Imágenes ... | Archivo de imagen de 640 nm "brecha" archivo de imagen de 580 nm), es decir, 640/580 nm relación.
  12. Seleccionar Imagen | Tablas de búsqueda | 16 colores.
  13. Seleccione Analizar | Herramientas | La barra de calibración.
  14. Inspeccionar las diferentes capas, la capa que contiene la identificación de los más heterogeneidad. Esto proporciona la información más útil sobre la distribución pH interno.
  15. Usando la relación entre la relación 640/580 nm y pH, construir un perfil de trama para visualizar la distribución de pH interno.

  1. Después de la tinción durante la noche de aproximadamente 20 larvas con 10 mM SNARF-1 de la mañana, añadir en soluciones madre de nigericin y KCl para compensar nigericin 50 mM y KCl 150 mM para la calibración.
  2. Ajustar el pH de AFSW calibración con NaOH diluido o HCl, hasta que se alcanza un pH alrededor de 5,9. Tenga en cuenta el valor exacto del pH. Medida de pH con un medidor de pH con un electrodo de vidrio que ha sido calibrado por el agua de mar basado 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol (Tris) y 2-aminopiridina 9.
  3. Transferir una larva tubeworm de colores junto con un líquido con un pH conocido a un plato limpio y seco para la medición de la intensidad de las señales a 640 nm y 580 nm.
  4. Repita los pasos 2.2 y 2.3 para cuatro más puntos de pH oscilaban entre 5,9 y 9.9. Representan un rango de valores fisiológicamente relevantes.
  5. Compruebe que las señales aparecen homogénea por todo el cuerpo animal. Esto indica que el pH intracelular ha sido equilibrated con el agua de mar del medio ambiente.
  6. La imagen de larvas tubeworm en los cinco ambientes de agua de mar de pH diferentes, registrar las intensidades mostradas como "valores grises" a 640 nm ya 580 nm, es decir, λ 2 λ exc y 1 exc.

3. Análisis de los datos de imagen radiométrica

  1. Introduzca los valores de gris medido desde cinco lugares al azar o de un área de interés en una hoja de cálculo.
  2. Compruebe la calibración de cinco puntos mostró una relación lineal para indicar el pH intracelular (por ejemplo, la ecuación como y = 0.30x - 1,47; y = valor de gris; pH = x; R² = 0,934).
  3. Calcular los valores de pH intracelular de la ecuación usando la relación de intensidad 640/580 nm medido en el paso 1.13.

4. La preservación de la muestra, deshidratación y montaje para microscopía electrónica

  1. Preservar la etapa de desarrollo de interés con paraformaldehído al 4%. en este estudio, Fijar los gusanos de tubo de 2-4 días después de la unión, mantener a los animales en fijador hasta su análisis.
  2. Trabajando en una campana de extracción, posterior a fijar los muestra con una solución acuosa de tetróxido de osmio al 1% durante 30 min para minimizar la contracción del tejido durante el proceso de deshidratación.
  3. Deshidratar la muestra con una serie de etanol: 50% de etanol durante 5 min, 70% de etanol durante 5 min, 85% de etanol durante 5 min, 95% de etanol durante 5 min, y etanol absoluto para finalmente 5 min dos veces.
  4. Trabajando en una campana de extracción, añadir una solución 1: 1 de etanol y hexametildisilazano (HMDS) a la muestra, permitiendo que el líquido se evapore por completo.
  5. En la campana de humos, añadir 100% HMDS a la muestra, permitiendo que el líquido se evapore completamente.
  6. Usando un cuchillo de diamante, introducir unos recortes en la placa de cultivo, en torno a unos gusanos de tubo. Con la tapa puesta, mantenga la parte inferior del plato contra un trozo de aluminio para romper el plato.
  7. Bajo un microscopio de disección, encontrar una pieza que contiene una fractura tubeworm intacta.
  8. Aplicar la pintura de plata a un trozo de aluminio y asegurar el fragmento al stub cuidadosamente. Pintura alrededor de los bordes del fragmento de plástico para reducir la carga.

5. Localización de una región rica en calcio El uso de SEM-EDS

  1. Asegurar el talón de muestra en el soporte de la muestra.
  2. Medir la altura de todo el conjunto en contra de la galga suministrada con el microscopio, el ajuste de la altura aflojando la arandela de seguridad y haciendo girar el palo hasta que la muestra está a la altura del estándar, o introduzca la altura como está registrado.
  3. Admitir aire en la cámara de intercambio de microscopio y el swing de la puerta de la cámara abierta. Deslizar el soporte de muestra en el extremo de la varilla de cambio. Después cierre y evacuar la cámara.
  4. Abra la válvula de compuerta y deslice la varilla de cambio hacia la cámara del microscopio. Deslice la varilla de cambio hasta el fondo para asentar completamente el soporte de la muestra en la platina del microscopio. Retire la varilla de cambio y cerrar la válvula de compuerta.
  5. t entradaque muestra Dimensiones y enviar el escenario a la posición de inicio para colocar la muestra debajo de la columna de electrones.
  6. Establecer el nivel de vacío de la cámara de 20-30 Pa en el modo VP-SEM. Ajuste el voltaje de aceleración de electrones a 20 kV y girar a la alta tensión.
  7. Elevar la etapa a una distancia de muestra de trabajo de 10 mm. Adquirir una transmisión en vivo y localizar la muestra. Optimizar la imagen ajustando el astigmatismo y enfoque según sea necesario.
  8. Abra el programa SEM-EDS y seleccione la opción de modo EDS-SEM. Seleccionar la opción de menú para ejecutar un mapa EDS.
  9. Cambio lente condensadora y la configuración de la apertura para lograr un tiempo muerto de 30 ~% a un tiempo de proceso de 3 según se monitoriza a través de la tasa de metros en el programa SEM-EDS. Ejecutar procedimientos de alineación de haz y apertura después de hacer cualquier cambio en los ajustes de haz.
  10. Seleccione una magnificación de tal manera que un solo organismo llena todo el campo de visión. Habilitar la opción de corrección de la deriva y capturar una imagen en el programa SEM-EDS.
  11. adquirir madatos p con el organismo de llenar todo el campo de vista, el uso de un tiempo de permanencia de 50-100 ms. Ejecutar el mapa hasta que los datos muestra distinta localización de Ca dentro del organismo (aproximadamente 15 min).
  12. Para obtener datos de punto cuantificación, cambiar el tiempo de proceso para 6 y ajustar la sonda de electrones para adquirir un tiempo muerto de ~ 30%. Ejecutar los pasos de alineación y optimizar la imagen según sea necesario.
  13. Seleccione la opción de Identificación de puntos y en el programa SEM-EDS y adquirir otra imagen. Con la herramienta de un solo punto, haga clic en las áreas que aparecían Ca rico en el mapa EDS, así como las áreas con deficiencia de Ca para la comparación. Analiza cada punto durante un tiempo de 30 s en vivo.

6. La identificación de información cristalográfica de calcio regiones ricas Usando SEM-EBSD

  1. Retire fragmento que contiene el espécimen de plástico de interés por parte de talón de probeta plana y colocar sobre la cara inclinada de un talón de pre-inclinada 45 ° utilizando pegamento conductor de plata.
  2. Atornillar el código auxiliar en la muestra hmayor y la posición de la cara en ángulo de la stub (con muestra) hacia la parte delantera del soporte de la muestra. Inserte el soporte de la muestra en la cámara del microscopio usando la cámara de intercambio.
  3. Ajuste el vacío de la cámara a 30 Pa y un voltaje de aceleración de electrones a 20 kV. Enviar la muestra debajo de la columna de electrones y la inclinación de la etapa de 25 ° para colocar la superficie de la muestra de aproximadamente 70 ° de la normal al haz de electrones. Girar la alta tensión.
  4. Elevar el escenario para una distancia de trabajo de ~ 18 mm. Utilice la rueda de desplazamiento para mover el escenario y localizar un espécimen. Aumentar la ampliación de enmarcar las características específicas de interés. Alinear el haz y optimizar la imagen según sea necesario.
  5. Abra el programa SEM-EDS en el modo de EBSD. Seleccionar calcita y aragonita como fases de interés. Inserte la cámara EBSD a una distancia de 154 mm. Establecer condiciones de la cámara de 1 x 1 y un tiempo de hurgar en la basura bastidor 100 ms. El uso de un haz de trama rápido, adquirir un fondo.
    NOTA: Una velocidad de fotogramas distintapuede ser necesaria dependiendo de la sonda de electrones; ajustar la velocidad de cuadro de la sonda o de la cámara para conseguir una señal de aproximadamente 90%.
  6. Captura de una imagen en el programa SEM-EDS. Utilice la herramienta de análisis de punto y haga clic en algún lugar de la imagen para explorar el haz en ese punto. Observe la ventana de la cámara para ver si se detectan patrones Kikuchi.
  7. Haga clic en diferentes áreas de la imagen para escanear posibles sitios de calcificación, observando la ventana de la cámara en cada punto para ver si están presentes bandas Kikuchi. Si los patrones están presentes y concuerda con ninguna de las fases seleccionadas de la base de datos, automáticamente se indexarán.

7. Preparación de muestras TEM Usando FIB-SEM

  1. Por pulverización catódica capa la muestra SEM preparados con platino o material similar para crear una capa conductora.
    1. Colocar las muestras previamente fijados, deshidratadas y montadas en la carcasa del dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica y encender la cámara para comenzar el bombeo de la cámara hacia abajo.
    2. Una vez que el vacío de la cámara lee 40 m Torr o menos, gire el interruptor de gas encendido y aumentar el flujo de gas de argón para alcanzar una presión de cámara de 200 mTorr. Ajuste el flujo de gas para conseguir una presión de la cámara final de 80 mTorr.
    3. Coloque el interruptor de voltaje en el voltaje y aumentar para llegar a una corriente de 15 mA. Ajuste el temporizador y el escudo durante un tiempo prolongado (~ 10 min) para crear una capa gruesa (~ 60 nm) que protege la superficie de la muestra de daño por irradiación de iones. Regular la tensión para mantener una corriente estable de 15 mA.
    4. Una vez finalizado, apague el dispositivo de recubrimiento para liberar el vacío y extraiga la muestra.
  2. Atornillar la base del preparado, por pulverización catódica muestra revestida sobre el poste del tornillo M4 del soporte de muestras del instrumento. Apriete hasta que la mano apretada, afloje la tuerca de bloqueo, y luego girar el palo soporte de muestras para cambiar la altura del conjunto. Utilice el indicador de altura láser y ajustar la altura para estar dentro de 1 mm (0,04 pulgadas = como se muestra en vídeo) de la norma supplied con el instrumento.
  3. Cierre todas las válvulas de armas de fuego en el FIB-SEM, y luego dejar que entre aire en la cámara de descompresión etapa eucéntrica. Una vez que la presión ha igualado con el medio ambiente, regleta de cierre abierta al aire y fijar el soporte de la muestra en las puntas de la varilla de cambio. Gire el mando en el extremo de la varilla de cambio a la posición de "bloqueo". Cierre la bolsa de aire y evacuar la cámara de la esclusa de aire.
  4. Una vez que la bolsa de aire etapa eucéntrica ha sido evacuado y la presión coincide con la de la cámara de FIB-SEM, abra la válvula de compuerta e inserte la muestra empujando la varilla de cambio. Deslice la varilla de cambio hasta el fondo para colocar el soporte de la muestra en la etapa instrumento eucéntrica, a continuación, gire la varilla de cambio a la posición de "desbloqueo". Deslice la varilla de cambio a salir y cerrar la válvula de compuerta.
  5. Mover la etapa de posicionar la muestra en la columna del haz de iones. Abrir las válvulas de compuerta y adquirir una imagen en directo de electrones secundarios de iones inducida de la FIB. Usar bajo aumento y unaexploración de trama rápido para minimizar el daño de iones. Restablecer el foco del haz de observación normal y elevar la altura Z de la etapa hasta que la muestra está en el foco. En este punto, la muestra está en la posición de punto de cruce donde vigas tanto el iones y electrones se enfocan en el mismo lugar.
  6. El uso de la imagen de electrones secundarios de la SEM, localizar el área de interés en la muestra, utilizando la rueda de desplazamiento para mover la muestra alrededor. Las áreas de interés son zonas ricas en Ca determinados como previamente por EDS mapeo. Girar la etapa si es necesario para obtener las características de interés en línea con el marco de la ventana.
  7. En la interfaz de ventana de la FIB, la captura de un panorama general de la muestra con una ampliación de 1.000X con un zoom digital adicional 2X y dibujar una plantilla de deposición ~ 8 m x 2 m por encima del área de interés. El tamaño de ampliación de la caja de depósito se puede ajustar para adaptarse a las características de diferentes tamaños. Establecer las condiciones de pulverización catódica para depositar carbono usando un 40 kV, 0,09 haz nA, utilizando un tiempo de permanencia de 0,5 microsegundos para 5 min.
  8. Después de la deposición de carbono, modificar las condiciones de deposición para depositar tungsteno utilizando un kV 40, 0,7 haz nA, y depósito por 5 min para generar un tapón de tungsteno m ~ 2-3.
  9. Capturar una instantánea FIB mediante el rayo de observación y utilizar la herramienta microsampling por pulverización catódica para dibujar un patrón de cuatro cuadros alrededor de la tapa de tungsteno. Establecer las cajas superior e inferior en alrededor de 15 micras x 8 micras; el derecho de la casilla 10 micras x 5 m, y la izquierda, caja de 6 micras x 5 m, o lo suficientemente grande como para rodear el área de interés.
    1. Modificar las condiciones de fabricación para cortar utilizando un kV 40, 19 de haz nA, y un tiempo de permanencia de 50 mS, y 3-4 fotogramas de escaneo para cada caja. Entonces fabricar el patrón. Después de la fabricación, el área de interés, con capas protectoras C y W, se asemejará a una isla, con todo el material adyacente eliminado en la parte superior, inferior y los lados derechos.
  10. Incline la etapa 58 ° para poner el sample superficie normal a la columna de electrón y en un ángulo pronunciado a la columna de iones. Busque la parte trasera de la muestra "isla" por medio de la FIB y la captura de una instantánea en 1.000X aumentos y zoom digital 2-4X.
  11. Dibujar un patrón de pulverización catódica ~ 15 m x 2 m por encima del fondo de la parte trasera de la muestra "isla" en el final de donde es visible. Fabrique la caja usando un haz 4 nA durante 3 minutos, o hasta que el haz ha cortado a través de la parte inferior de la muestra de "isla".
  12. Incline la etapa eucéntrica -58 ° desde la posición actual (a cero). Inserte la sonda microsampling tungsteno haciendo clic en "Sonda En" en la interfaz de la FIB. Seleccione "MS" en el panel de control de fase y utilizar la rueda de desplazamiento para mover la sonda sobre la parte superior de la muestra.
  13. Adquirir una transmisión en vivo de la FIB con un aumento de 1 kx y la posición de la sonda de manera que la punta quede sobre el lado derecho de la tapa de tungsteno de la micromuestra. Mientras se observa un vivoSE imagen de la SEM, utilice el botón de control Z del panel etapa para disminuir la sonda hasta que toque la tapa de tungsteno. Se emitirá una señal sonora una vez que se ha hecho contacto.
  14. Capturar una instantánea utilizando la FIB usando un 40 kV, 0,01 nA haz, con un aumento de zoom digital 2X y 1.000X. Utilice la herramienta de deposición para dibujar un cuadro x 2 m 2 m sobre la punta de la sonda donde se ha puesto en contacto el tapón de tungsteno de la microcelda.
    1. Establecer las condiciones para depositar tungsteno utilizando un kV 40, 0,09 haz nA, durante 2 min y un tiempo de permanencia de 0,5 mu s. Entonces fabricar el patrón.
  15. Dibuje un patrón de pulverización catódica ~ 2 m x 5 m por encima del extremo izquierdo de la micromuestra "brazo" (donde todavía está conectado a la mayor parte de la muestra). Fabricar el patrón de uso de un 40 kV, 0,7 nA viga, durante 2 minutos, o hasta que el pitido indica que la micromuestra se ha desprendido de la muestra a granel.
  16. Utilice el mando de control Z para elevar la sonda con micromuestra adjunta hastase aclara la muestra a granel, entonces retraer la sonda. Enviar la etapa eucéntrica ya sea a la posición de Intercambio de casas o.
  17. Coloque una rejilla de cobre de media en un soporte lateral de entrada y cargue el soporte en la cámara de la etapa de purga entrada lateral. Evacuar la cámara e instale el soporte de entrada lateral. Ajuste el titular en la situación FIB.
  18. Presione cara en el panel de control de fase y utilizar la rueda de desplazamiento para llevar el medio de la red a la vista en el monitor FIB. Mover para limpiar el área de la mitad de la red y utilice el mando de Z a llevar la superficie en el foco.
  19. Presione sonda para insertar la sonda, pulse la EM en el panel de control de fase, y utilizar el mando trackball y Z para colocar el micromuestra sobre la mitad de rejilla. Bajar la sonda hasta que los contactos Microsample la rejilla.
  20. Capturar una imagen de la FIB en 1.000X aumento (zoom 2X). Utilice la herramienta de deposición y dibujar un patrón ~ 10 m x 3 m sobre el lado inferior de la micromuestra. Depósito de tungsteno con un 40 kV, 0,7 nA viga, utilizando una temporización tiempo de 0,5 microsegundos para 3 min.
  21. Utilice la herramienta de pulverización catódica y dibujar un pequeño patrón de 1 m x 3 m sobre la punta de la sonda. Fabricar el patrón de uso de un 40 kV, 0,7 nA haz en un tiempo de permanencia de 3 ms para cortar la sonda lejos de la micromuestra. Retraer la sonda una vez libre.
  22. Capturar una imagen de la FIB con un aumento de 5.000x y dibujar dos patrones de pulverización 7 m x 4 m en la parte superior e inferior de la microcelda, dejando un espacio de 1 m ~ entre las cajas. Centre los patrones de manera que no corte los lados izquierdo y derecho de la micromuestra. Fabrique ambos patrones utilizando un kV 40, 4 de haz nA, y un tiempo de permanencia de 3 mu s, por 2 min, el establecimiento de la dirección de la trama hacia el centro de la micromuestra.
  23. Capturar otra imagen con el rayo de observación FIB en 5.000x. Cambiar el tamaño de las cajas de pulverización anteriores a ~ 6,5 m x 1 m, se acercan entre sí para dejar un espacio de ~ 0,5 micras, y fabricar usando un 40 kV, 0,7 haz nA.
  24. Incline la etapa de entrada lateral de 0,5 ° y gorratura otra imagen FIB. Cambiar el tamaño de las cajas de pulverización catódica a 6 micras de ancho. Coloque el patrón superior sobre el lado superior de la micromuestra y fabricar usando un 40 kV, 0,7 haz nA. Incline -0.5 ° y repita con el patrón de pulverización catódica inferior y el lado inferior de la microcelda.
  25. disminuir aún más el ancho del patrón de ~ 0,5 micras. Incline 0,5 ° y pulverización catódica el lado superior de la micromuestra usando un 40 kV, 0,09 haz nA. Repita con el lado inferior a -0.5 ° de inclinación.
  26. Incline la etapa 2.2 ° y adquirir una imagen de la FIB en 10.000 veces. Cambiar el tamaño de los patrones de pulverización catódica a 5 micras de ancho y cambiar las condiciones de haz a 5 kV, 0,03 nA. Coloque el patrón superior sobre el lado superior de la microcelda, justo hasta el borde superior, y fabricar. Incline -2.2 ° y repita con el lado inferior y el patrón de fondo.
  27. Repita los pasos 5 kV de fresado hasta la microcelda de electrones se convierte en transparente (~ 100 nm de espesor). Una vez terminado, gunvalves cerrar y retirar titular de la entrada lateral.

8. Obtaining seleccionada área con patrón de difracción en un TEM

  1. Para preparar el instrumento para el análisis, tanto llenar frascos Dewar con nitrógeno líquido y se fijó el voltaje de aceleración 300 kV.
  2. Después de la preparación de la muestra utilizando el FIB, quitar el soporte de entrada lateral de la FIB-SEM y ajustar la posición del pasador de tal manera que la longitud soporte coincide con la del 300 kV TEM. Rotar la punta del soporte en la posición correcta observación, una vez más, comparándolo con el titular de TEM estándar para asegurar la orientación correcta de la muestra.
    1. Como alternativa, retire la mitad de la red con laminillas adjunta del titular FIB-SEM y el lugar en el soporte TEM estándar.
  3. Cargar el soporte de la muestra en la cámara de intercambio de la TEM y evacuar la cámara. Asegúrese de que la válvula de la pistola se haya cerrado cada vez que deja entrar aire en la cámara de intercambio. Una vez que la cámara de intercambio ha bombeado hacia abajo, una alarma audible. Gire el soporte de la muestra hacia la derecha y permitir que la vacuum para tirar del soporte de la muestra en la primera posición de parada.
  4. Deje que el instrumento de vacío para recuperar, a continuación, abra la válvula de la pistola. Restablecer el enfoque y el zoom a una ampliación de aproximadamente 10.000 veces.
  5. Utilice los mandos de alineación para cambiar el haz del centro de la pantalla de fósforo. Contrato y expandir el haz y compruebe que el movimiento de la barra es concéntrico. Ajustar para obtener el astigmatismo condensador según sea necesario.
  6. Girar el soporte de la muestra en sentido antihorario y permitir que el vacío para tirar el soporte completamente en la columna. Utilice el movimiento perillas etapa para navegar y localizar la muestra.
  7. Aumentar la ampliación en la muestra y ajustar la altura Z hasta que la muestra está en el foco. Utilice los oculares ópticos según sea necesario.
  8. Inserte la cámara y retire la pantalla de fósforo. Ampliar el haz según sea necesario para evitar oversaturating la cámara. Ajustar los parámetros de enfoque y de la cámara, a continuación, iniciar la adquisición de capturar una imagen.
  9. Para adquirir un patrón de difracción, el primer centro de lacaracterística de interés. Retire la apertura del objetivo e inserte la apertura de difracción.
  10. Cambie al modo de lente de difracción pulsando el botón DIFF en el panel de control y utilice el mando de control DIFF para reducir el tamaño del haz.
  11. Inserte el supresor de si es necesario para evitar que el centro del patrón de difracción de la quema de la pantalla de la cámara o de fósforo. Iniciar la adquisición de la cámara para capturar una imagen del patrón.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Las siguientes son algunas observaciones del proceso de calcificación durante la metamorfosis de la tubeworm. Figura 1 muestra que los valores de pH cerca de la región de cuello es mayor que la de otros tejidos después de la metamorfosis. Figura 2i muestra una tubeworm con una distribución homogénea de Ca, lo que sugiere no hay grandes eventos de calcificación han comenzado; La figura muestra una 2ii tubeworm que se ha calcificado por un período más largo, lo que sugiere la calcificación ha ido más allá del punto de interés de tiempo; La figura muestra una 2iii tubeworm con la etapa de la calcificación de interés, que fue seleccionado para su posterior análisis para comprender el tejido responsable de la mineralización. La Figura 3 muestra los valores de pH más altos se correlacionan con las señales de iones de Ca superiores tanto de tinción de calceína y mapeo SEM-EDX. A partir de estas observaciones, el tejido de la fase de desarrollo de interés fue examinado en un higher resolución utilizando una técnica más localizada, SEM-EBSD. Tras el descubrimiento de la fase mineral, la Figura 4 muestra la aplicación de haz iónico concentrado para levantar el material de interés para TEM y análisis de difracción de área seleccionada para confirmar la cristalinidad del mineral.

Figura 1
Figura 1: mapeo de pH intracelular del tubeworm (de Chan et al 2015.). A los 71 h después del tratamiento IBMX, un tubeworm, elegans Hydroides, lo que representa una tasa más lenta de la metamorfosis demuestra una gran heterogeneidad en la distribución de pH intracelular. DIC imagen (arriba a la izquierda) y pseudocolorized imágenes compuestas generadas a partir de los valores de gris a 640 nm dividida por valores de gris a 580 nm (arriba a la derecha) se muestran. Los valores de gris calculados a partir de la proporción 640/580 nm es proporcional al pH intracelular. el perfiles de los valores de gris de las imágenes compuestas, fueron convertidos en valores de pH intracelular sobre la distancia a lo largo del eje del cuerpo longitudinales de la tubeworm (panel inferior). La relación entre el pH intracelular y la relación 640/580 nm de emisión fue establecido por la calibración in vitro (y = 0.30x - 1,47; R2 = 0,934; y, valor de gris; x, pH intracelular). Las regiones con pH intracelular por encima de pH 8,5 (en rojo) son correspondientes a las regiones donde se encontraron estructuras calcificadas. Barras de escala = 100 m; c, cuello; b, lóbulos branquiales; hormiga, anteior; posterior, posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Identificación de la etapa de la vida de interés utilizando SEM-EDS.
Gusanos de tubo en diferentespunto de metamorfosis tiempo fueron seleccionados para capturar la etapa de recién calcificante para su posterior análisis (i) Un día 1 post-metamórficas tubeworm muestra una distribución homogénea de la señal de Ca (ii) Un día más rápido crecimiento tubeworm 2 post-metamórficas muestra un corto anillo de la señal de Ca (iii) Un día más lento crecimiento de 2 puestos metamórfica tubeworm muestra los puntos de señal de Ca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Caracterización de las señales de Ca mediante microscopía en vivo (de Chan et al 2015.). (I-IV), SEM-EDS (v-vii) y SEM-EBSD (viii-x). La distribución de los iones de calcio como señal correlacionada con calceína a las 31 h y 53 h después de la metamorfosis de los elegans Hydroides. Las imágenes DIC (panel de la izquierda, 3i y iii) ytque calceína señal (panel izquierdo, 2ii y iv) se muestran. Microscopía electrónica correlativa en el día elegans Hydroides 2 post-metamórficas detecta manchas de estructuras calcificadas, como se muestra la imagen SEM de una tensión inferior (5 kV) en (panel central, 3v). mapeo análisis SEM-EDS, realizado a 20 kV, muestra una distribución heterogénea de calcio (panel central, 3vi, Ca; en amarillo). Los contenidos de Ca se presentan como números de la superposición de una mayor detalle de la superficie de baja tensión (5 kV) imagen de la tubeworm, el Ca contenidos (mol% en peso, puntos decimales están alineados para mostrar la ubicación del punto de análisis) obtenido a partir de la cuantificación punto ( con SEM-EDS a 20 kV) (panel central; 3vii). Las regiones con un contenido de Ca superior a 15% en moles en peso es probable que sean estructuras calcificadas. El análisis SEM-EBSD de las regiones ricas en calcio se illuastrated en el panel derecho de 2viii-x. Las regiones ricas en calcio (caja blanca) que puede encontrar en los resultados SEM-EDS se analizaron adicionalmente con EBSD (panel de la derecha; 3VIII) (ii) El círculo (panel de la derecha;3iX) indica el sitio de análisis EBSD; un patrón Kikuchi (panel de la derecha; 2x) sugiere que el sitio es aragonítico desde la interfaz de software / EBSD microanálisis EDS. c, cuello; b, lóbulos branquiales; hormiga, anterior; posterior, posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Caracterización de la estructura cristalina usando FIB-TEM (de Chan et al 2015.). (I) La región que exhibe un patrón de Kikuchi de EBSD se cortó para preparar una muestra TEM, (ii) el material circundante eliminado extirpado por un haz de iones enfocado técnica (FIB) (vista superior), (iii) el material se levantó usando una sonda de tungsteno (vista lateral), (iv) la muestra con un espesor final de ~ 200 nm, que se obtuvo a un voltaje menor. área de un círculo en (v) erananalizadas para la presencia de patrón de difracción de área seleccionada en un TEM (vi), que muestra un patrón de un solo cristal de aragonita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

formación de imágenes ópticas en vivo es un método útil para la observación de acontecimientos celulares en un organismo multicelular. Aquí, los indicadores de pH y de iones de calcio interno se utilizaron para medir el flujo de iones en los sitios de mineralización. En estas regiones, se requiere el bombeo de iones activo para elevar el pH y la concentración de Ca2 + para permitir la calcificación 2, 3. Cuando la aplicación de las moléculas fluorescentes para estudiar un organismo, que es crítico para asegurar que la concentración utilizada tiene una toxicidad insignificante y permite que el organismo para llevar a cabo de una forma fisiológicamente relevante. Una concentración más baja tinción sería menos tóxico y por lo general está unida a un mayor tiempo de tinción 10. Es importante mantener una baja densidad de larvas durante el tiempo de incubación, minimizando la falta de oxígeno y la acumulación de residuos en el período de la tinción.

Antes de continuar con los métodos FIB / TEM, lo que implica una localizadaregión de interés, es crucial para la detección a través de la etapa de la vida y el tejido de interés utilizando métodos de resolución más baja como SEM-EDS y SEM-EBSD. La observación de la muestra en el modo de retrodispersión permite la visualización de la composición elemental relativa donde más ligero contraste se correlaciona con mayor peso atómico 11. Por lo tanto, las imágenes SEM-BSE también proporcionan una estimación de la ubicación de los elementos más pesados ​​como los iones de calcio y de osmio glóbulos lipídicos manchados. análisis SEM-EDS permite mapeo más específico de iones de calcio en las muestras. Sin embargo, no confirma la presencia de CaCO 3 cristalina. SEM-EBSD permite la detección de estructuras cristalinas, aunque los métodos convencionales requieren EBSD una superficie pulida 12. Este estudio demuestra cómo SEM-EBSD en una muestra sin pulir puede proporcionar información útil. Una corriente de haz de 20 kV permite una mayor profundidad de análisis en la superficie de la muestra. Por lo tanto, EBSD es un método deseable detectarla presencia de biomineral, especialmente en muestras biológicas pequeñas, intactos como larvas marinas. Aunque las muestras sin pulir darían a cabo falsos negativos cuando los minerales no se enfrentan al detector a unos 70 °, ver un patrón Kikuchi se considera que es una evidencia inequívoca de una fase mineral en la región de interés 13.

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) permite la caracterización estructural de una gama más amplia de materiales 14. El haz iónico concentrado (FIB) permite la extracción específica del sitio y la preparación de una muestra con dimensiones típicas para el análisis de TEM 15. Por lo tanto, la técnica FIB / TEM es un método adecuado para analizar biomateriales recién depositados en un área localizada. Combinados instrumentos FIB-SEM también permiten sin daños la observación de una muestra mediante el uso de una columna integrada por haz de electrones. recubrimiento por pulverización catódica de tungsteno de la muestra aumenta la conductividad y límites ion implantation y la irradiación daño de la muestra 16. El uso de un haz de iones enfocado finamente con un bajo tiempo de permanencia permite la molienda de materiales orgánicos. Dentro de la FIB-SEM, una característica particular de interés se puede extraer de una muestra a granel y diluido de electrones transparencia para el análisis de TEM 17. Debido a la alta energía del haz de iones, los materiales cristalinos pueden volverse amorfa. Esto puede ocurrir cuando la preparación de una lámina delgada para el análisis de TEM y se puede mitigar utilizando un haz de iones de baja voltaje de aceleración para eliminar la capa amorfa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hexamethyldisilazane  Electron Microscopy Sciences 16700(EM)
Osmium Tetroxide 2% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 19192
IBMX 3-Isobutyl-1-methylxanthine ThermoFisher Scientific PHZ1124
Nigericin, Free Acid ThermoFisher Scientific N7143-5MG
35 mm diameter dish, hole size 27 mm, Glass No.0, Non-coat ThermoFisher Scientific D110400
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate ThermoFisher Scientific C-1271
BDH Potassium Chloride, ACS Grade VWR BDH0258-500G
Paraformaldehyde
reagent grade, crystalline		 Sigma P6148
1 M Hydrochloric Acid for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 083-01095
0.05 M Sodium Hydroxide Solution for Volumetric Analysis Wako Pure Chemical Industries, Ltd 199-02185
Calcein Sigma C0875
FASW Iwaki Co. Ltd. Rei-sea Marine
Mixed Cellulose Ester Membranes; 47 mm dia, 0.45 µm ADVANTEC A045A047A
ethanol Wako Pure Chemical Industries, Ltd 051-00476
Artificial seawater for buffers by SOP06 of DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf
Sodium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 191-01665
Potassium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 163-03545
Magnesium Chloride Hexahydrate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 135-00165
Calcium Chloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd 039-00475
Sodium Sulfate Wako Pure Chemical Industries, Ltd 197-03345
Hydrochloric Acid Wako Pure Chemical Industries, Ltd 089-08415
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (tris) Wako Pure Chemical Industries, Ltd 207-06275
2-aminopyridine Wako Pure Chemical Industries, Ltd 011-02775
Orion 5-star Plus pH meter Thermo Scientific
PrpHecT ROSS Micro Combination pH Electrode 8220BNWP Thermo Scientific
Axiovision, Version 4.6, Axio Observer Z1 Zeiss
ImageJ NIH, Bethesda, MD, USA
HRTEM H500 Hitachi
SU6600 VPSEM Hitachi
NB5000 Focused Ion and Electron Beam (FIB-SEM) system Hitachi 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aizenberg, J., et al. Skeleton of Euplectella sp.: structural hierarchy from the nanoscale to the macroscale. Science. 309 (5732), 275-278 (2005).
  2. de Nooijer, L. J., Toyofuku, T., Oguri, K., Nomaki, H., Kitazato, H. Intracellular pH distribution in foraminifera determined by the fluorescent probe HPTS. Limnol Oceanogr Methods. 6 (11), 610-618 (2008).
  3. de Nooijer, L. J., Langer, G., Nehrke, G., Bijma, J. Physiological controls on seawater uptake and calcification in the benthic foraminifer Ammonia tepida. Biogeosciences. 6 (11), 2669-2675 (2009).
  4. Smith, A. M., Riedi, M. A., Winter, D. J. Temperate reefs in a changing ocean: skeletal carbonate mineralogy of serpulids. Mar Biol. 160 (9), 1-14 (2013).
  5. Carpizo-Ituarte, E., Hadfield, M. Stimulation of metamorphosis in the polychaete Hydroides elegans Haswell (Serpulidae). Biol. Bull. 194 (1), 14 (1998).
  6. Bryan, P. J., Kreider, J. L., Qian, P. Y. Settlement of the serpulid polychaete Hydroides elegans (Haswell) on the arborescent bryozoan Bugula neritina (L.): evidence of a chemically mediated relationship. J Exp Mar Biol Ecol. 220, 171-190 (1998).
  7. Chan, V. B. S., et al. Evidence of compositional and ultrastructural shifts during the development of calcareous tubes in the biofouling tubeworm, Hydroides elegans. J. Struct. Biol. 189 (3), 230-237 (2015).
  8. DOE. Handbook of methods for the analysis of the various parameters of the carbon dioxide system in sea water. Version 2. Dickson, A. G., Goyet, C. , ORNL/CDIAC-74 (1994).
  9. Chan, V. B. S., et al. Direct deposition of crystalline aragonite in the controlled biomineralization of the calcareous tubeworm. Front Mar Sci. 2, 97 (2015).
  10. Bond, J., Varley, J. Use of flow cytometry and SNARF to calibrate and measure intracellular pH in NS0 cells. Cytometry A. 64, 43-50 (2005).
  11. Lloyd, G. E. Atomic number and crystallographic contrast images with the SEM: a review of backscattered electron techniques. Mineral Mag. 51, 3-19 (1987).
  12. Perez-Huerta, A., Dauphin, Y., Cuif, J. P., Cusack, M. High resolution electron backscatter diffraction (EBSD) data from calcite biominerals in recent gastropod shells. Micron. 42 (3), 246-251 (2011).
  13. Bandli, B. R., Gunter, M. E. Electron backscatter diffraction from unpolished particulate specimens: examples of particle identification and application to inhalable mineral particulate identification. Am. Mineral. 97, 1269-1273 (2012).
  14. Hayat, M. A. Principles and techniques of electron microscopy: biological applications. , Cambridge University Press. (2000).
  15. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chem Geo. 261, 217-229 (2009).
  16. Volkert, C. A., Minor, A. M. Focused ion beam microscopy and micromachining. MRS Bull. 32, 389-399 (2007).
  17. Kudo, M., et al. Microtexture of larval shell of oyster, Crassostrea nippona: A FIB-TEM study. J. Struct. Biol. 169 (1), 1-5 (2009).

Tags

Microbiología No. 120 la medición del pH Ratiometric EDS EBSD Focused Ion Beam (FIB) TEM microscopía electrónica ciencias de la vida (general)
Caracterización de la calcificación Eventos en vivo mediante técnicas ópticas y microscopía electrónica en un Gusano Tubícola Marina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, V. B. S., Toyofuku, T.,… More

Chan, V. B. S., Toyofuku, T., Wetzel, G., Saraf, L., Thiyagarajan, V., Mount, A. S. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. J. Vis. Exp. (120), e55164, doi:10.3791/55164 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter