Summary
माइटोकॉन्ड्रिया (2 + सीए) कैल्शियम पृथक करने के लिए उनके भीतर की झिल्ली (Δ Ψm) भर में विद्युत क्षमता का उपयोग कर सकते हैं, उन्हें 2 + साइटोसोलिक सीए आकार देने के लिए कोशिका के भीतर संकेत की इजाजत दी। हम एक साथ मापने माइटोकॉन्ड्रिया सीए 2 तेज और ΔΨ मीटर जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट रंगों और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन।
Abstract
इसके अलावा एटीपी पैदा करने में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका से, माइटोकॉन्ड्रिया भी (सीए 2) कसकर intracellular सीए 2 + एकाग्रता को विनियमित करने के लिए बफ़र्स स्थानीय कैल्शियम के रूप में काम करते हैं। ऐसा करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया सीए 2 पृथक करने के लिए उनके भीतर की झिल्ली (ΔΨ मीटर) के पार विद्युत क्षमता का उपयोग। सीए 2 की आमद माइटोकॉन्ड्रिया में साइट्रिक एसिड चक्र के तीन दर सीमित डीहाइड्रोजनेज उत्तेजित करता है, आक्सीकारक फास्फारिलीकरण (OXPHOS) परिसरों के माध्यम से इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण बढ़ रही है। इस उत्तेजना ΔΨ मीटर है, जो अस्थायी रूप से व्यस्त है के रूप में सकारात्मक कैल्शियम आयनों mitochondrial मैट्रिक्स में mitochondrial भीतरी झिल्ली को पार बनाए रखता है।
हम यहाँ एक साथ मापने माइटोकॉन्ड्रिया सीए 2 तेज और ΔΨ मीटर जीवित कोशिकाओं में confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन। कोशिकाओं permeabilizing, mitochondrial सीए द्वारा 2 + कर सकते हैं, फ्लोरोसेंट सीए 2 + सूचक Fluo 4, AM उपयोग करके मापा जा ΔΨ मीटर फ्लोरोसेंट रंजक tetramethylrhodamine का उपयोग कर, मिथाइल एस्टर, perchlorate (TMRM) की माप के साथ। इस प्रणाली का लाभ फ्लोरोसेंट रंगों के बीच बहुत कम वर्णक्रमीय ओवरलैप है कि वहाँ, mitochondrial सीए का सही माप 2 + और ΔΨ मीटर एक साथ की अनुमति है। सीए 2 aliquots के अनुक्रमिक इसके प्रयोग, mitochondrial सीए 2 तेज नजर रखी जा सकती है, और एकाग्रता, जिस पर सीए 2 लाती mitochondrial झिल्ली पारगम्यता संक्रमण और ΔΨ के नुकसान चुना गया हूँ।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया स्थानीय सीए 2 बफ़र्स 1 के रूप में अभिनय द्वारा intracellular सीए 2 + एकाग्रता को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सीए 2, विद्युत ढाल कि mitochondrial भीतरी झिल्ली (ΔΨ मीटर) 2 भर में मौजूद है के द्वारा संचालित एक प्रक्रिया के माध्यम से सीए 2 uniporter माइटोकॉन्ड्रिया में प्रवेश करती है। एक बार जब mitochondrial मैट्रिक्स के अंदर, सीए 2 साइट्रिक एसिड चक्र 3 के तीन दर सीमित डीहाइड्रोजनेज प्रेरक द्वारा आक्सीकारक फास्फारिलीकरण सक्रिय कर सकते हैं। इस उत्तेजना ΔΨ मीटर है, जो अस्थायी रूप से व्यस्त है के रूप में सकारात्मक कैल्शियम आयनों mitochondrial मैट्रिक्स में mitochondrial भीतरी झिल्ली को पार बनाए रखता है। माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर सीए 2 एकाग्रता बहुत अधिक हो जाता है, mitochondrial पारगम्यता संक्रमण, शुरू किया जा सकता ΔΨ मीटर के अपव्यय में जिसके परिणामस्वरूप, cessatioआक्सीकारक फास्फारिलीकरण के एन और रास्ते 4 संकेत कोशिका मृत्यु का प्रेरण।
महत्वपूर्ण भूमिका है कि माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर कैल्शियम के स्थानिक बफरिंग में खेलने mitochondrial कैल्शियम की सही निगरानी के लिए महत्वपूर्ण बना देता है। विभिन्न तरीकों rhodamine आधारित रंगों के उपयोग सहित mitochondrial कैल्शियम, निगरानी के लिए स्थापित किया गया है। ऐसा ही एक डाई, Rhod-2, AM, माइटोकॉन्ड्रिया को विभाजन पर काफी प्रभावी, 6 mitochondrial सीए 2 का स्तर 5 उपाय है। हालाँकि, ध्यान के रूप में कुछ ऐसे डाई liposomes के रूप में अन्य अंगों में जमा करेंगे, या सेल cytosol में रहने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। फिर भी, नीचे की ओर विश्लेषण माइटोकॉन्ड्रिया 7 से उन लोगों से इन संकेतों को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
एक और तकनीक mitochondrial कैल्शियम की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर constructs 8 का इस्तेमाल > अप। इन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच के लाभ यह है कि वे विशेष रूप से अंतर्जात एन टर्मिनल पेप्टाइड्स मानव कॉक्स सबयूनिट आठवीं के एन टर्मिनल लक्ष्यीकरण संकेत का उपयोग, उदाहरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना बनाया जा सकता है। इस प्रणाली के एक mitochondrial-लक्षित aequorin जांच जो mitochondrial कैल्शियम 9 संकेत जांच के लिए अत्यंत उपयोगी साबित हुई है उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया है। इन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच का मुख्य दोष यह है कि वे क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा कोशिकाओं में पेश किए जाने की जरूरत है (जो कुछ प्रकार की कोशिकाओं के लिए संभव नहीं है और चर परिणाम का उत्पादन कर सकते हैं) या स्थिर अभिव्यक्ति सिस्टम (जो समय लगता है) बनाने से है।
समस्याओं के ऊपर उल्लिखित नाकाम करने के लिए, हम एक साथ mitochondrial सीए 2 और ΔΨ मीटर को मापने के लिए एक नए प्रोटोकॉल विकसित किया है। इस प्रोटोकॉल एक पहले से वर्णित विधि कि permeabilized कोशिकाओं को बहिर्जात कैल्शियम कहते हैं पर आधारित हैएस = "xref"> 10। हमारी प्रोटोकॉल अन्य तरीकों पर तीन मुख्य फायदे हैं: सबसे पहले, हम Fluo 4, AM और TMRM mitochondrial सीए 2 और ΔΨ मीटर, दो रंगों बहुत ही अलग वर्णक्रम गुण है कि निगरानी के लिए उपयोग करें; दूसरी बात, कोशिकाओं permeabilized कर रहे हैं ताकि Fluo 4 संकेत ही mitochondrial सीए का पता लगाने है 2 + 2 + और सीए अन्य अंगों या सेल cytosol के लिए नहीं स्थानीय; और तीसरे, Fluo 4 के उपयोग mitochondrial सीए पता लगाने के लिए 2 +, किसी भी सेल अभिकर्मक या परिवर्तन के मुद्दों है कि यदि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच का उपयोग मौजूद नकार तेज और सरल सेल धुंधला के लिए अनुमति देता है।
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Protocol
1. कक्ष की तैयारी
- या 10 सेमी सेल संस्कृति बर्तन पर कोशिकाओं 75 सेमी बढ़ने संस्कृति मीडिया [10 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल्स मध्यम (DMEM) 5% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस के साथ पूरक में 2 बोतल )] 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में।
- कोशिकाओं फसल के लिए, आकांक्षा से मीडिया को दूर तो 5 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट बफर खारा (1x पीबीएस) से धो लें। आकांक्षा से 1x पीबीएस निकालें, तो 1.5 मिलीलीटर 0.25% जोड़ने (डब्ल्यू / वी) trypsin / 0.25% (w / v) ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते हैं। डिश ठोकर या धीरे फ्लास्क, कोशिकाओं को दूर करने के लिए तो 5 मिलीलीटर संस्कृति मीडिया में resuspend।
- एक hemocytometer पर resuspended कोशिकाओं के 12 μl जोड़कर कोशिकाओं की गणना।
- बर्तन या confocal इमेजिंग के लिए संभाग coverslips में प्लेट कोशिकाओं।
नोट: ये एक उपयुक्त प्लास्टिक या कांच के नीचे है कि उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग के लिए डिजाइन किया गया है होगा। - प्लेट कोशिकाओं इतना वें~ 80% confluency इमेजिंग के दिन पर हासिल की है। उदाहरण के लिए, लगभग 2 एक्स 10 4 143B osteosarcoma कोशिकाओं इमेजिंग से पहले एक 8 अच्छी तरह से चैम्बर स्लाइड एक दिन की एक अच्छी तरह से में चढ़ाया जा सकता है।
- 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में रात भर कोशिकाओं को सेते कोशिकाओं देते हैं और ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए।
2. TMRM और Fluo 4 इमेजिंग के लिए बफ़र
- रिकार्ड समाधान (राज्यसभा) युक्त 156 मिमी NaCl, 3 मिमी KCl, 2 मिमी MgSO 4, तैयार 1.25 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 10 मिमी डी ग्लूकोज, 2 मिमी 2 CaCl और 10 मिमी HEPES पीएच 7.35। -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर रुपये।
- तैयार Intracellular मध्यम (आईएम) युक्त 6 मिमी NaCl, 130 मिमी KCl, 7.8 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 0.4 मिमी CaCl 2, 2 मिमी EGTA, 10 मिमी HEDTA, 2 मिमी Malate, 2 मिमी ग्लूटामेट, 2 मिमी ADP और 20 मिमी HEPES पीएच 7.1। 200 Malate, ग्लूटामेट और ADP का मिमी स्टॉक समाधान, अलग से तैयार किया जा सकता है aliquoted, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। ये सेंटocks सिर्फ उपयोग करने से पहले आईएम को जोड़ा जा सकता है।
- वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से तैयार पूर्व 2 + मुक्त हांक बफर नमक समाधान (HBSS) प्राप्त किया जा सकता सीए। एथिलीन ग्लाइकोल बीआईएस (β-aminoethyl ईथर) जोड़ें एन, एन, एन ', N'-tetraacetic एसिड (EGTA) 500 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए।
- 100% मेथनॉल में 10 मिमी tetramethylrhodamine, मिथाइल एस्टर, perchlorate (TMRM) के एक शेयर समाधान तैयार है। इस शेयर से, आसुत एच 2 ओ में 2 माइक्रोन के एक काम कर शेयर
- 100% इथेनॉल में 10 मिमी Verapamil के एक शेयर समाधान तैयार है।
- एक 1 मिलीग्राम / एमएल (डब्ल्यू / वी) डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में Fluo 4 acetoxymethyl एस्टर (Fluo 4, AM) के शेयर समाधान तैयार है।
नोट: Fluo 4, AM एक कैल्शियम सूचक दर्शाती है कि बाध्यकारी सीए 2 पर प्रतिदीप्ति में वृद्धि हुई है। Fluo 4 दो क्लोरीन fluorines द्वारा प्रतिस्थापित substituents साथ, Fluo-3 के एक अनुरूप है। यह 488 एनएम पर वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति उत्तेजना और उच्च प्रतिदीप्ति संकेत के स्तर में यह परिणाम है।AM एस्टर समूह एक uncharged Fluo 4 अणु है कि कोशिका झिल्ली तर कर सकते में परिणाम है। एक बार सेल के अंदर, AM एस्टर अविशिष्ट esterases द्वारा cleaved है, Fluo 4 का एक रूप है कि आरोप लगाया कोशिका के भीतर फंस गया है, जिसके परिणामस्वरूप। - 100% इथेनॉल में 1 मिमी कार्बोनिल साइनाइड पी trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) के एक शेयर समाधान तैयार है।
- आसुत एच 2 ओ में 25 मिलीग्राम / एमएल के एक शेयर समाधान (डब्ल्यू / वी) digitonin तैयार
- DMSO में 100 सुक्ष्ममापी thapsigargin के एक शेयर समाधान तैयार है।
- आसुत एच 2 ओ में 40 मिमी कैल्शियम क्लोराइड (2 CaCl) के एक शेयर समाधान तैयार
3. TMRM और Fluo 4, एएम के साथ कोशिकाओं के धुंधला
- 20 एनएम TMRM के साथ RS धुंधला समाधान तैयार, 5 माइक्रोग्राम / एमएल (w / v) Fluo 4, AM और ऐसे Pluronic एफ 127 रुपये में के रूप में 0.005% surfactant।
नोट: इस surfactant एक nonionic polyol कि Fluo 4, एएम के solubilization की सुविधा है। नोट: 10 माइक्रोन के Verapamil भी inhibi करने के लिए जोड़ा जा सकता हैटी TMRM निर्यात प्लाज्मा झिल्ली बहुऔषध ट्रांसपोर्टर द्वारा अगर यह सेल प्रकार में व्यक्त किया जाता है का विश्लेषण किया जा रहा है। - पिपेट द्वारा कोशिकाओं से संस्कृति मीडिया निकालें और पीबीएस 1x 100 μl से धो लें।
- पिपेट द्वारा 1x पीबीएस निकालें और कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 250 μl रुपये धुंधला समाधान में कोशिकाओं को सेते हैं।
नोट: एक बार Fluo 4, AM सेल में प्रवेश करती है, AM एस्टर सेलुलर esterases द्वारा cleaved है। कमरे के तापमान पर incubating esterase गतिविधि को रोकता है, Fluo 4, AM माइटोकॉन्ड्रिया में प्रवेश करने की अनुमति देता है। - पिपेट रुपये धुंधला समाधान निकालें और अतिरिक्त Fluo 4, AM और TMRM दूर करने के लिए सीए 2 μl 100 में कोशिकाओं को धोने मुक्त HBSS।
- 25 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ आईएम इमेजिंग समाधान तैयार (डब्ल्यू / वी) digitonin, 200 एनएम TMRM और आईएम में 1 माइक्रोन thapsigargin।
नोट: digitonin की एकाग्रता mitochondrial भीतरी झिल्ली उत्पन्न नहीं होती है कि permeabilization सुनिश्चित करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस तीव्रता का आकलन करने से अनुभव से निर्धारित किया जा सकताdigitonin के विभिन्न सांद्रता में TMRM संकेत की। - पिपेट द्वारा सीए 2 मुक्त HBSS निकालें और कोशिकाओं को आईएम इमेजिंग समाधान के 300 μl जोड़ें। कोशिकाओं को छोड़ दो 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित करने के लिए। कोशिकाओं को अब 2 CaCl परिवर्धन के साथ इमेजिंग के लिए तैयार हैं।
4. सेल इमेजिंग
- डिश या आईएम इमेजिंग समाधान में कोशिकाओं के साथ संभाग coverslip एक औंधा confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर पर रखें।
- TMRM और Fluo 4 की उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए माइक्रोस्कोप लेज़रों पर सेटिंग का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, क्रमशः TMRM और Fluo 4 उत्तेजित करने के लिए 543 एनएम वह-ने और 473 एनएम आर्गन लेजर लाइनों का उपयोग करें। कोशिकाओं के लिए किसी भी तस्वीर-नुकसान को कम करने के लिए लगभग 5% की एक कम लेजर शक्ति का प्रयोग करें।
- छवियाँ हर 25 सेकंड स्कैन करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। 10 मिनट के लिए स्कैन कोशिकाओं TMRM और Fluo 4 संकेतों के लिए आधारभूत रीडिंग की स्थापना।
ध्यान दें: Fluo 4 संकेत कमजोर या आराम कर रही कैल्शियम एकाग्रता पर undetectable हो सकता हैराशन। - आईएम इमेजिंग समाधान के 300 μl में सीधे कोशिकाओं को 40 मिमी 2 CaCl शेयर समाधान के 3 μl जोड़ें (एक 1: 100 कमजोर पड़ने) और एक विंदुक के साथ धीरे मिश्रण। छवि स्कैनिंग रोकें जबकि जोड़ने और 2 CaCl मिश्रण यदि आवश्यक है।
नोट: फाइनल मुक्त सीए 2 आयन एकाग्रता [सीए 2 +] आईएम इमेजिंग समाधान में इस तरह के Maxchelator WEBMAXC के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना की जा सकती है विस्तारित ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) या chelator 11। कैसे अंतिम मुक्त सीए 2 आयन एकाग्रता की गणना करने के लिए का एक विस्तृत विवरण [सीए 2 +] नीचे धारा 6 में वर्णित है। - लगभग 4 मिनट के लिए छवि स्कैनिंग जारी, फिर 2 CaCl के अतिरिक्त हर 4 मिनट दोहराने वांछित TMRM या Fluo 4 संकेतों तक पहुँच रहे हैं, आम तौर पर लगभग 8 से 10 अतिरिक्त करने के लिए।
- 1 मिमी FCCP के 100 कमजोर पड़ने (अंतिम सी: एक विंदुक का प्रयोग, एक 1 जोड़ने10 की oncentration माइक्रोन) के सीधे कोशिकाओं को ΔΨ मीटर फैलने के लिए। एक और 5 मिनट के लिए छवि कोशिकाओं। प्रयोग अब समाप्त हो गया है।
5. छवि विश्लेषण
- एक बार इमेजिंग पूरा हो गया है, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग Fluo 4 और TMRM संकेतों की तीव्रता का निर्धारण जैव प्रारूप प्लगइन (डाउनलोड 'bioformats_package.jar' http://downloads.openmicroscopy.org/bio से साथ उदाहरण ImageJ सॉफ्टवेयर के लिए -formats / और इसे बचाने के लिए 'सी: प्रोग्राम फ़ाइलें ImageJ plugins' फ़ोल्डर)।
- इमेजिंग फ़ाइल (उदाहरण के लिए एक .oif फाइल) ImageJ में खोलें। चयन उपकरण पर क्लिक करें और ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र का चयन माइटोकॉन्ड्रिया होता है। रॉय का चयन करने के लिए प्रारंभिक TMRM संकेत का प्रयोग करें।
- ओपन 'का विश्लेषण करें> उपकरण> रॉय प्रबंधक', 'जोड़ें' तीव्रता माप के लिए चयनित किया रॉय शामिल करने के लिए क्लिक करें। एकाधिक ROIs माप के लिए एक एकल छवि पर चुना जा सकता है। सभी रॉय जब तक दोहराएँ पिछले चरणोंएस रॉय प्रबंधक को जोड़ दिया गया है।
- 'अधिक> बहु उपाय' पर क्लिक करें कि चयनित है 'सभी स्लाइस उपाय' बनाने के लिए और है कि 'प्रति स्लाइस एक पंक्ति' अचयनित है, तो क्लिक करें 'ठीक' TMRM और Fluo 4 संकेतों का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता का एक तालिका प्राप्त करने के लिए हर समय बिंदु पर प्रत्येक रॉय के लिए।
- औसत तीव्रता और TMRM और Fluo 4 संकेतों के लिए मानक विचलन की गणना करने के लिए सभी ROIs से डेटा का उपयोग करें।
6. अंतिम मुफ्त सीए 2 आयन एकाग्रता [सीए 2 +] की गणना
- मुक्त सीए 2 आयन एकाग्रता [सीए 2 +] आईएम इमेजिंग समाधान में इस तरह के Maxchelator WEBMAXC विस्तारित (के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) या chelator 11। 24 डिग्री सेल्सियस, पीएच = 7 तापमान =: उदाहरण के लिए, सेट WEBMAXC में चर के रूप में निम्नानुसार बढ़ाया।1, आयोनिक ताकत = 0.162, 0.002 EGTA = एम, HEDTA = 0.01 एम, सीए 2 = 0.0004 एम और 2 मिलीग्राम + = 0.0078 एम यह एक अंतिम मुक्त सीए 2 आयन एकाग्रता [सीए 2 +] 62 एनएम के परिणाम में । ध्यान दें कि इन कार्यक्रमों के खाते में नहीं हर चर, इस तरह के अभिकर्मक पवित्रता, माप और पीएच दृढ़ संकल्प की सटीकता के रूप में ले सकते हैं। मुक्त सीए 2 एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए सबसे सही तरीका एक calibrated सीए 2 चयनात्मक इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए है।
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Representative Results
हम 143B सेल माइटोकॉन्ड्रिया की क्षमता कैल्शियम 12 में बढ़ जाती है बफर करने पर एक लाख टन-ND5 उत्परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। यहाँ दिखाए गए उदाहरण में, नियंत्रण 143B कोशिकाओं TMRM और Fluo 4 के साथ भरी हुई थी, digitonin साथ permeabilization पहले हूँ। इमेजिंग के 5 मिनट के बाद, एक 1 के आठ अनुक्रमिक अतिरिक्त: 40 मिमी बहिर्जात 2 CaCl के 100 कमजोर पड़ने, किए गए थे अंतिम मुक्त सीए 2 आयन एकाग्रता के साथ [सीए 2 +] गणना की थी।
प्रत्येक 2 CaCl इसके बाद, TMRM संकेत mitochondrial झिल्ली क्षमता ΔΨ मीटर (चित्रा 1) dissipates सीए की आमद माइटोकॉन्ड्रिया में 2 + आयनों के रूप में कम हो जाती है। ΔΨ मीटर तो ठीक हो जाए रूप में श्वसन ΔΨ मीटर बनाए रखने के लिए बढ़ जाती है। यह प्रत्येक CaCl के बाद चार बार होता है
Mitochondrial कैल्शियम एकाग्रता (Fluo 4 संकेत) के बाद दूसरे नंबर 2 CaCl अलावा बढ़ाने के लिए शुरू होता है जब मुफ्त [सीए 2 +] मीडिया में 0.32 सुक्ष्ममापी (चित्रा 2) तक पहुँचता है। प्रत्येक बाद 2 CaCl अलावा mitochondrial कैल्शियम में एक प्रगतिशील वृद्धि का कारण बना।
ΔΨ मीटर के एक साथ माप (TMRM, लाल सिग्नल) और mitochondrial कैल्शियम की छवियाँ (Fluo 4, हरी हस्ताक्षरएनएएल) दिखाए जाते हैं (चित्रा 3)।
चित्रा 1: digitonin में mitochondrial ΔΨ मीटर का मापन TMRM का उपयोग कर 143B कोशिकाओं permeabilized। 143B कोशिकाओं digitonin साथ permeabilization पहले Fluo 4, AM और TMRM के साथ पहले से लोड किए गए थे। एक 1: 40 मिमी बहिर्जात 2 CaCl के 100 कमजोर पड़ने अनुक्रमिक aliquots में जोड़ा गया है। अंतिम मुफ्त [सीए 2 +] मीडिया में इसके अलावा एक (*) के लिए संकेत दिया है। FCCP लगभग 40 मिनट के बाद 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया है। ΔΨ मीटर लाल रंग में दिखाया गया है, TMRM संकेत के रिश्तेदार तीव्रता (आरआई) का प्रतिनिधित्व करती है। डेटा मतलब ± एसडी एन = 3. चित्रा संदर्भ 12 से अनुमति के साथ अनुकूलित है। एक बड़ा versio देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा के एन।
चित्रा 2: digitonin में mitochondrial कैल्शियम का मापन 143B Fluo 4, AM उपयोग कोशिकाओं permeabilized। 143B कोशिकाओं digitonin साथ permeabilization पहले Fluo 4, AM और TMRM के साथ पहले से लोड किए गए थे। एक 1: 40 मिमी बहिर्जात 2 CaCl के 100 कमजोर पड़ने अनुक्रमिक aliquots में जोड़ा गया है। अंतिम मुफ्त [सीए 2 +] मीडिया में इसके अलावा एक (*) के लिए संकेत दिया है। FCCP लगभग 40 मिनट के बाद 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया है। Mitochondrial कैल्शियम हरे रंग में दिखाया गया है, Fluo 4 संकेत के रिश्तेदार तीव्रता (आरआई) का प्रतिनिधित्व करती है। डेटा मतलब ± एसडी एन = 3. चित्रा संदर्भ 12 से अनुमति के साथ अनुकूलित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: mitochondrial कैल्शियम और digitonin में ΔΨ मीटर के साथ माप Fluo 4, AM और TMRM का उपयोग कर 143B कोशिकाओं permeabilized। 143B कोशिकाओं digitonin साथ permeabilization पहले Fluo 4, AM और TMRM के साथ पहले से लोड किए गए थे। एक 1: 40 मिमी बहिर्जात 2 CaCl के 100 कमजोर पड़ने अनुक्रमिक aliquots में जोड़ा गया है। अंतिम मुफ्त [सीए 2 +] मीडिया में इसके अतिरिक्त प्रत्येक के लिए संकेत दिया है। प्रतिनिधि confocal (TMRM, लाल) ΔΨ मीटर के एक साथ धुंधला और mitochondrial कैल्शियम (Fluo 4, हरा) दिखा छवियों। ध्यान दें कि Fluo 4 संकेत 0.062 सुक्ष्ममापी के आराम कर रही कैल्शियम एकाग्रता में पता लगाने के लिए मुश्किल है। सफेद पैमाने सलाखों = 10 माइक्रोन। चित्रा संदर्भ 12 से अनुमति के साथ अनुकूलित है।यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कैल्शियम मांसपेशियों के संकुचन, न्यूरोनल संकेतन और सेल प्रसार 13 सहित कई सेल प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेल कैल्शियम की सांद्रता में वृद्धि अक्सर ऊर्जा की मांग के साथ जुड़े रहे हैं, सीधे एटीपी पीढ़ी 3 बढ़ाने के लिए mitochondrial आक्सीकारक फास्फारिलीकरण प्रोत्साहित करने में सक्षम कैल्शियम के साथ। इसलिए यह जरूरी है कि हम प्रभावी रूप से mitochondrial कैल्शियम संचय नजर रखने के लिए और तुलना के लिए कैसे इस समारोह में दोनों आनुवंशिक कारणों और औषधीय एजेंटों से प्रभावित होता है में सक्षम होने की क्षमता है।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल Fluo 4, AM और TMRM के साथ एक साथ माइटोकॉन्ड्रिया कैल्शियम संचय और ΔΨ मीटर की निगरानी करने की क्षमता का वर्णन है। धुंधला प्रक्रिया के दौरान यह Fluo 4 की प्रभावशीलता का अनुकूलन करने के लिए कमरे के तापमान पर सेते कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, mitochondrial का पता लगाने में हूँकैल्शियम। कमरे के तापमान पर ऊष्मायन mitochondrial झिल्ली पार और mitochondrial मैट्रिक्स में प्रवेश के लिए uncharged Fluo 4, AM अनुमति देता है, साइटोसोलिक esterases की गतिविधि को कम कर देता है। इसके विपरीत, 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन, cytosol में esterase गतिविधि को बढ़ाती AM एस्टर बंद cleaving एक चार्ज Fluo 4 डाई कि प्रभावी ढंग से mitochondrial झिल्ली को पार करने में सक्षम नहीं होगा छोड़ दें।
एक बार सेल धुंधला प्रदर्शन किया गया है, कोशिकाओं आईएम इमेजिंग समाधान में डूब रहे हैं। यह समाधान प्रारंभिक रुपये धुंधला समाधान की तुलना में एक उच्च TMRM एकाग्रता है। अब जब कि कोशिकाओं permeabilized कर रहे हैं, TMRM नहीं रह प्लाज्मा झिल्ली भर equilibrates। इसलिए, TMRM एकाग्रता आईएम इमेजिंग समाधान में उठाया है mitochondrial भीतरी झिल्ली भर में सही संतुलन हासिल करने के लिए। यह भी आईएम इमेजिंग समाधान में thapsigargin शामिल करने के लिए इस स्तर पर महत्वपूर्ण है। ब्लॉकों जालिका (ईआर) सीए 2 thapsigargin+ ATPase, यह सुनिश्चित करना है कि Fluo 4 संकेत ईआर कैल्शियम पता लगाने नहीं है।
संशोधन और समस्या निवारण
कुछ प्रकार की कोशिकाओं को अपने प्लाज्मा झिल्ली पर बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टर (भी MDR1 या पी ग्लाइकोप्रोटीन के रूप में जाना जाता है) को व्यक्त कर सकते हैं। यह प्रोटीन कोशिका 14 से बाहर cytosol से, AM एस्टर डेरिवेटिव सहित फ्लोरोसेंट संकेतक, निर्यात करने के लिए जाना जाता है। ट्रांसपोर्टर व्यक्त किया जाता है, तो दोनों Fluo 4, AM और TMRM सेल cytosol से उप इष्टतम धुंधला में जिसके परिणामस्वरूप निर्यात किया जा सकता है। इस आशय को ब्लॉक करने के लिए, Verapamil धुंधला प्रक्रिया के दौरान बाधा Fluo 4, AM और TMRM निर्यात बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टर ब्लॉक रुपये धुंधला समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है।
कोशिकाओं permeabilizing विश्लेषण किया जा करके, Fluo 4, AM अन्य अंगों या cytosol से कोई प्रतिस्पर्धा संकेतों के साथ, mitochondrial सीए 2 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम नियमित रूप से गैर ईओण detergen का उपयोग25 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में permeabilization के लिए टी digitonin। यह एकाग्रता mitochondrial झिल्ली की कि solubilization सुनिश्चित करने के लिए नहीं होती है समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस digitonin के विभिन्न सांद्रता में TMRM संकेत की तीव्रता का आकलन करने से अनुभव से निर्धारित किया जा सकता है। अगर digitonin की एकाग्रता बहुत अधिक है, mitochondrial झिल्ली आंशिक रूप से solubilized हो जाएगा, TMRM संकेत को कम करने।
तकनीक की सीमाएं
इस प्रोटोकॉल के मुख्य लाभ में से एक यह है कि Fluo 4 का उपयोग करके, mitochondrial कैल्शियम का पता लगाने के लिए कर रहा हूँ, TMRM एक साथ ΔΨ मीटर को मापने के लिए, दो रंगों के बीच नगण्य वर्णक्रमीय ओवरलैप के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। mitochondrial कैल्शियम के लिए Fluo 4 की विशिष्टता को सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं की जांच की जा रही है की जरूरत साइटोसोलिक Fluo 4 संकेत को खत्म करने permeabilized किया जाना है। इस permeabilization इस तकनीक से एक सीमा है। जबकि आईएम इमेजिंग समाधान cloSely सेल cytosol के ईओण ताकत मेल खाता है, यह पूरी तरह से उसके घटकों के सभी नकल नहीं कर सकते। इस परिणाम को प्रभावित करता है, तो विशिष्ट साइटोसोलिक घटकों प्रायोगिक प्रणाली की जांच की जा रही है में आवश्यक हो सकता है। इसके अलावा, के रूप में कोशिकाओं permeabilized कर रहे हैं, प्रोटोकॉल नहीं रह गया 1 घंटा से अधिक प्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है।
मौजूदा / वैकल्पिक तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व
विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों mitochondrial कैल्शियम 8 आकलन करने के लिए विकसित किया गया है। इन रंगों का उपयोग करने के लिए सरल कर रहे हैं और समय की एक छोटी जगह में उपयोगी डेटा प्रदान कर सकते हैं। इन रंगों के माइटोकॉन्ड्रिया में मुख्य रूप से जमा है, कुछ भी liposomes सहित अन्य अंगों में जमा है, या सेल cytosol में रह सकते हैं। इसलिए, देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि ये अन्य संकेतों mitochondrial कैल्शियम संकेत को प्रभावित नहीं करते लिया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल, mitochondr मेंial सीए 2 thapsigargin की उपस्थिति में permeabilized कोशिकाओं में मापा जाता है। इस पद्धति का लाभ यह है कि साइटोसोलिक और ईआर कैल्शियम संकेतों का सफाया कर रहे हैं। इसके अलावा, permeabilization Fluo 4 का उपयोग करते हैं, AM mitochondrial सीए 2 पता लगाने के लिए अनुमति देता है। Fluo 4, AM जिसका अर्थ है कि mitochondrial सीए 2 और ΔΨ मीटर एक साथ इन दो रंगों का उपयोग उपाय हो सकता है, TMRM के साथ बहुत कम वर्णक्रमीय ओवरलैप है।
Mitochondrial सीए 2 भी आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से 8 का उपयोग करके मापा जा सकता है। इन पत्रकारों विशिष्ट mitochondrial सीए 2 संकेतों में जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना बनाया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच अध्ययन किया जा रहा है, कुछ मामलों में काफी समय और प्रयास ले जा सकते हैं जो कोशिकाओं में पेश किए जाने की जरूरत है। इसके विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल रंगों Fluo 4, AM और TMRM का उपयोग करता है, mitochondrial सीए को मापने के लिए तेज और आसान सेल धुंधला के लिए अनुमति देता है
भविष्य अनुप्रयोगों या निर्देश के बाद इस तकनीक के माहिर
स्थानीय कैल्शियम buffers के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया अधिनियम intracellular कैल्शियम की सांद्रता और सेल की ऊर्जा आवश्यकताओं को विनियमित करने के लिए। जब यह प्रक्रिया बाधित है, अत्यधिक mitochondrial कैल्शियम तेज mitochondrial पारगम्यता संक्रमण पैदा कर सकते हैं, ΔΨ मीटर के पतन और समर्थक apoptotic अणुओं है कि कोशिका मृत्यु प्रेरण 4 को गति प्रदान की रिहाई हो जाती है।
हम mitochondrial कैल्शियम की परीक्षा और ΔΨ मीटर के लिए अपने रिश्ते और mitochondrial पारगम्यता संक्रमण के शामिल होने के लिए एक तेजी से और सीधे आगे प्रोटोकॉल उपस्थित थे। यह जांच करने के लिए कैसे इन mitochondrial मानकों को मानव रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में रोगजनन को प्रभावित किया जा सकता है मधुमेह 15 और उम्र से संबंधित सहितअल्जाइमर और पार्किंसंस रोग के रूप में 16 neurodegeneration की स्थिति। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल की जांच करने के लिए कैसे mitochondrial कैल्शियम और ΔΨ मीटर आनुवंशिक दोष या पर्यावरण विषाक्त पदार्थों से प्रभावित हैं इस्तेमाल किया जा सकता है, और भी इन कैसे प्रभावित करता है उपचारों या दवाओं जो माइटोकॉन्ड्रिया लक्ष्य द्वारा संग्राहक जा सकता है। कि mitochondrial कैल्शियम दोनों मानव स्वास्थ्य और रोग में खेलता भविष्य प्रयोगों के इन प्रकार की भूमिका में महत्वपूर्ण नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।
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Acknowledgments
हम वित्तीय सहायता के लिए डॉ Kirstin Elgass और तकनीकी सहायता के लिए मोनाश माइक्रो इमेजिंग से डॉ सारा पंथ, और वेलकम ट्रस्ट और चिकित्सा अनुसंधान परिषद ब्रिटेन धन्यवाद। MMcK ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद भविष्य फैलोशिप योजना (FT120100459), विलियम बकलैंड फाउंडेशन, ऑस्ट्रेलियाई Mitochondrial रोग फाउंडेशन (AMDF), चिकित्सा अनुसंधान और मोनाश विश्वविद्यालय के हडसन इंस्टीट्यूट का समर्थन किया है। इस काम विक्टोरियन सरकार परिचालन बुनियादी सुविधाओं का समर्थन योजना के द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
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