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Biology

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Published: January 24, 2017 doi: 10.3791/55166

Summary

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ & psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Abstract

Abgesehen von ihrer wesentliche Rolle bei der ATP zu erzeugen, Mitochondrien wirken auch als lokale Calcium (Ca 2+) Puffer zu eng regulieren intrazelluläre Ca2 + -Konzentration. Dazu nutzen Mitochondrien das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (ΔΨ m) zu sequestrieren Ca 2+. Der Zustrom von Ca 2+ in die Mitochondrien stimuliert drei geschwindigkeitsbestimmend Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus, Erhöhung der Elektronentransfer durch die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Komplexe. Diese Stimulation unterhält ΔΨ m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird.

Wir beschreiben hier ein Verfahren zur gleichzeitigen Messung von Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen konfokalen Mikroskopie. Durch die Permeabilisierung der Zellen, Mitochondrien - Ca 2+ kannVerwendung der fluoreszierenden Ca 2+ Indikator Fluo-4, AM, gemessen werden mit der Messung der ΔΨ m den Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin Verwendung von Methylester, Perchlorat (TMRM). Der Vorteil dieses Systems ist , dass es sehr wenig spektrale Überlappung zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen, so dass eine genaue Messung der mitochondrialen Ca 2+ und ΔΨ m gleichzeitig. Verwendung der sequentiellen Zugabe von Ca 2+ Aliquots können mitochondriale Ca 2+ -Aufnahme überwacht werden, und die Konzentration , bei der Ca 2+ mitochondrialen Membranpermeabilität Übergang und den Verlust von ΔΨ induziert m bestimmt.

Introduction

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle intrazelluläre Ca2 + -Konzentration in der Regulation von 1 als lokale Ca 2+ Puffer wirken. Ca 2+ tritt in die Mitochondrien über das Ca 2+ Uniporter, ein Verfahren , mit dem elektrochemischen Gradienten angetrieben, der über den inneren Mitochondrienmembran (ΔΨ m) 2 existiert. Einmal in der mitochondrialen Matrix, Ca 2+ kann die oxidative Phosphorylierung aktivieren , indem drei geschwindigkeitsbegrenzenden stimulierenden Dehydrogenasen des Zitronensäurezyklus 3. Diese Stimulation unterhält ΔΨ m, die vorübergehend als die positiven Calciumionen überqueren die inneren Mitochondrienmembran in die mitochondriale Matrix abgeführt wird. Wenn der Ca 2+ -Konzentration in den Mitochondrien sehr hoch wird, kann mitochondrial permeability transition eingeleitet werden, was zur Dissipation von ΔΨ m, die cessation der oxidativen Phosphorylierung und die Induktion von Zelltod - Signalwege 4.

Die wichtige Rolle, die Mitochondrien in der räumlichen Pufferung von zellulären Kalzium spielen macht die genaue Überwachung der mitochondrialen Kalzium kritisch. Es wurden verschiedene Verfahren etabliert mitochondrialen Calcium zu überwachen, einschließlich der Verwendung von Rhodamin-basierte Farbstoffe. Ein solcher Farbstoff, Rhod-2, AM, ist sehr effektiv bei der Aufteilung in die Mitochondrien mitochondrialen Ca 2+ -Spiegel 5 zu messen, 6. Jedoch muss darauf verwendet werden, wie einige Farbstoff in anderen Organellen, wie Liposomen ansammelt, oder verbleiben in der Zell-Cytosol. Dennoch können Downstream - Analysen 7 diese Signale von den aus den Mitochondrien zu unterscheiden , eingesetzt werden.

Eine andere Technik zur mitochondrialen Kalzium Monitor nutzt fluoreszierende Reporterkonstrukte 8 up>. Der Vorteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie gezielt durch die Verwendung endogener N-terminalen Peptide in die Mitochondrien ziel werden, beispielsweise die N-terminale Targeting-Signal des menschlichen COX-Untereinheit VIII. Dieses System wurde verwendet , um eine mitochondriale gezielte Aequorin Sonde zu erzeugen , die extrem nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Calcium erwiesen hat Signalisierungs 9. Der Hauptnachteil dieser genetisch codierten Sonden ist, dass sie in die Zellen durch transiente Expression eingeführt werden müssen (was nicht durchführbar für bestimmte Zelltypen und unterschiedliche Ergebnisse produzieren kann) oder durch stabile Expressionssysteme zu schaffen (was zeitaufwändig).

Um die Probleme zu umgehen oben dargelegt, haben wir ein neues Protokoll zur Messung der mitochondrialen Ca2 + und ΔΨ m gleichzeitig entwickelt. Dieses Protokoll basiert auf einem vorher beschriebenen Verfahren, die permeabilisierten Zellen exogene Calcium fügts = "xref"> 10. Unser Protokoll hat drei wesentliche Vorteile gegenüber anderen Methoden: Zum einen nutzen wir Fluo-4, AM und TMRM mitochondrialen Ca 2+ zu überwachen und ΔΨ m, zwei Farbstoffe , die sehr unterschiedliche spektrale Eigenschaften aufweisen; Zweitens werden die Zellen permeabilisiert so daß der Fluo-4 - Signal nur mitochondrialen Ca 2+ und Ca 2+ nicht an andere Organellen oder Zell - Cytosol lokalisiert ist , zu erfassen; und drittens, die Verwendung von Fluo-4 zu mitochondrialen Ca 2+ erkennen ermöglicht eine schnelle und einfache Zellfärbung, negiert alle Zelle Transfektion oder Transformation Probleme, die bestehen , wenn genetisch kodierte Sonden verwendet.

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Protocol

1. Herstellung von Zellen

  1. Wachsen Zellen auf 10 cm Zellkulturschalen oder 75 cm 2 -Kolben in Kulturmedium [10 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) , ergänzt mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1 x Penicillin / Streptomycin (P / S )] bei 37 ° C / 5% CO 2.
  2. Um Zellen ernten, entfernen Medien durch Absaugen, dann waschen mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (1x PBS). Entfernen 1x PBS durch Absaugen, dann wurden 1,5 ml 0,25% addieren (w / v) Trypsin / 0,25% (w / v) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und inkubiere bei 37 ° C / 5% CO 2 für 2 min. Tippen Sie Teller oder Kolben sanft Zellen zu entfernen, dann Resuspendieren in 5 ml Kulturmedien.
  3. Zählen von Zellen durch Zugabe von 12 ul resuspendierten Zellen auf einem Hämozytometer.
  4. Platten-Zellen in Schalen oder chambered Deck für die konfokale Bildgebung.
    ANMERKUNG: Diese werden eine geeignete Kunststoff- oder Glasboden haben, der für die Verwendung mit inverse Mikroskope konzipiert wurde.
  5. Plattenzellen so thbei ~ 80% Konfluenz am Tag der Bildgebung erreicht. Beispielsweise etwa 2 x 10 & sup4 ; 143B Osteosarkomzellen können in einer Vertiefung eines 8-Well - Kammerobjektträger einen Tag vor der Abbildungs plattiert werden.
  6. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C / 5% CO 2 an Zellen ermöglichen , zu befestigen und zu erholen.

2. Puffer für TMRM und Fluo-4 Imaging

  1. Prepare Record Solution (RS) , enthaltend 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO 4, 1,25 mM KH 2 PO 4, 10 mM D-Glucose, 2 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES pH 7,35. Shop RS in Aliquots bei -20 ° C.
  2. Vorbereitung intrazelluläres Medium (IM) , enthaltend 6 mM NaCl, 130 mM KCl, 7,8 mM MgCl 2, 1 mM KH 2 PO 4, 0,4 mM CaCl 2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM Malat, 2 mM Glutamat, 2 mM ADP und 20 mM HEPES pH 7.1. 200 mM Stammlösungen von Malat, Glutamat und ADP getrennt, aliquotiert und bei -20 ° C hergestellt werden. Diese stocks kann kurz vor dem Gebrauch mit dem IM hinzugefügt werden.
  3. Ca 2+ frei können Hanks gepufferte Salzlösung (HBSS) erhalten werden von kommerziellen Anbietern vorbereiteten. Hinzufügen, Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraessigsäure (EGTA) in einer Endkonzentration von 500 uM.
  4. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Tetramethylrhodamin, Methylester, Perchlorat (TMRM) in 100% Methanol. Von diesem Lager, machen eine Arbeits Bestand von 2 uM in destilliertem H 2 O
  5. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM Verapamil in 100% Ethanol.
  6. Bereiten Sie eine 1 mg / ml (w / v) Stammlösung von Fluo-4 Acetoxymethylester (Fluo-4, AM) in Dimethylsulfoxid (DMSO).
    HINWEIS: Fluo-4, AM ist ein Kalzium - Indikator, der Fluoreszenz bei der Bindung Ca 2+ erhöht aufweist. Fluo-4 ist ein Analogon von Fluo-3, mit den beiden Chlorsubstituenten durch Fluoratome ersetzt. Dies führt zu einer erhöhten Fluoreszenzanregung bei 488 nm und eine höhere Fluoreszenzsignalpegel. DasAM Estergruppe führt zu einer ungeladenen Fluo-4-Molekül, das die Zellmembranen durchdringen kann. Einmal in der Zelle, wird der AM-Ester durch unspezifische Esterasen gespalten, was zu einer geladenen Form von Fluo-4, die in der Zelle eingeschlossen ist.
  7. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mM carbonyl Cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 100% igem Ethanol.
  8. Bereiten Sie eine Stammlösung von 25 mg / ml (w / v) Digitonin in destilliertem H 2 O
  9. Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 uM Thapsigargin in DMSO.
  10. Bereiten Sie eine Stammlösung von 40 mM Calciumchlorid (CaCl 2) in destilliertem H 2 O

3. Anfärben von Zellen mit TMRM und Fluo-4, AM

  1. Vorzubereiten RS Färbelösung mit 20 nM TMRM, 5 ug / ml (w / v) Fluo-4, AM und 0,005% Tensid, wie Pluronic F-127 in RS.
    HINWEIS: Dieses Tensid ist ein nicht-ionisches Polyol, das die Solubilisierung von Fluo-4, AM erleichtert. Anmerkung: 10 uM Verapamil können auch hinzugefügt werden, um inhibit TMRM Export durch die Plasmamembran Multidrug-Transporter wenn es in der Zelltyp exprimiert wird analysiert.
  2. Entfernen Kulturmedien von Zellen mit einer Pipette und waschen mit 100 ul 1x PBS.
  3. Entfernen 1x PBS pipettiert und inkubieren Zellen in 250 & mgr; l RS Färbelösung für 45 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Nachdem die Fluo-4, AM in die Zelle eindringt, die AM-Ester durch zelluläre Esterasen gespalten wird. Inkubieren bei Raumtemperatur hemmt Esterase-Aktivität, so dass Fluo-4, AM die Mitochondrien zu betreten.
  4. Entfernen RS Färbelösung mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen in 100 & mgr; l Ca 2+ freies HBSS Überschuss Fluo-4, AM und TMRM zu entfernen.
  5. Bereiten Sie IM Imaging-Lösung mit 25 ug / ml (w / v) Digitonin, 200 nM TMRM und 1 uM Thapsigargin in IM.
    HINWEIS: Die Konzentration von Digitonin müssen diese Permeabilisierung der mitochondrialen inneren Membran sicherzustellen angepasst werden nicht auftritt. Dies kann empirisch bestimmt werden, indem die Intensität der Beurteilungdes TMRM Signals bei verschiedenen Konzentrationen von Digitonin.
  6. Entfernen Sie die Ca 2+ freies HBSS mit einer Pipette und 300 ul IM Imaging - Lösung zu den Zellen. Lassen Zellen für 10 min bei Raumtemperatur äquilibrieren. Die Zellen sind nun bereit für die Bildgebung mit CaCl 2 Ergänzungen.

4. Cell Imaging

  1. Legen Gericht oder chambered Deckglas mit Zellen in IM Imaging-Lösung auf einem invertierten Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop.
  2. Verwendung auf dem Mikroskop-Laser-Einstellung für die Anregungs- und Emissionsspektren von TMRM und Fluo-4. Verwenden Sie zum Beispiel 543 nm He-Ne und 473 nm Argon-Laser Linien TMRM und Fluo-4 bzw. zu erregen. Verwenden Sie eine niedrige Laserleistung von ca. 5% ein beliebiges Foto-Schäden an den Zellen zu minimieren.
  3. Stellen Sie Mikroskopbilder alle 25 Sekunden zu scannen. Scan-Zellen für 10 min herzustellen Basisablesungen für die TMRM und Fluo-4-Signale.
    HINWEIS: Die Fluo-4-Signal bei ruhenden Kalzium concent schwach oder nicht nachweisbar seinVerpflegung.
  4. In 3 ul 40 mM CaCl 2 Stammlösung direkt auf die Zellen in 300 ul IM Imaging - Lösung (eine 1: 100 - Verdünnung) und vorsichtig mischen mit einer Pipette. Pause , um die Bildabtastung während das Hinzufügen und die CaCl 2 bei Bedarf mischen.
    HINWEIS: Die endgültige können freie Ca 2+ Ionenkonzentration [Ca 2+] in der IM - Imaging - Lösung mit einer Software wie Maxchelator WEBMAXC berechnet werden VERLÄNGERT ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) oder Chelator 11. Eine detaillierte Beschreibung, wie die letzte freie Ca 2+ -Ionen - Konzentration zu berechnen [Ca 2+] wird in Abschnitt 6 weiter unten beschrieben.
  5. Weiter Bildabtastung für ca. 4 min, dann wiederholen CaCl 2 Ergänzungen alle 4 min , bis die gewünschte TMRM oder Fluo-4 Signale erreicht werden, in der Regel um 8 bis 10 Ergänzungen.
  6. Mit einer Pipette, fügen Sie eine 1: 100 Verdünnung von 1 mM FCCP (endgültige cONZENTRATION von 10 & mgr; M) direkt zu den Zellen ΔΨ m abzuleiten. Bildzellen für weitere 5 min. Das Experiment ist nun abgeschlossen.

5. Bildanalyse

  1. Sobald Bildgebung abgeschlossen ist, bestimmen die Intensität der Fluo-4 und TMRM Signale Bildanalyse-Software unter Verwendung beispielsweise ImageJ Software mit dem Bio-Formats Plugin (download 'bioformats_package.jar' von http://downloads.openmicroscopy.org/bio -Formate / und speichern sie es in der "C: Program Files ImageJ plugins" Ordner).
  2. Öffnen Sie die Bilddatei (zum Beispiel eine .OIF-Datei) in ImageJ. Klicken Sie auf das Auswahlwerkzeug und wählen Sie eine Region of Interest (ROI), die Mitochondrien enthält. Verwenden Sie das anfängliche TMRM Signal den ROI zu wählen.
  3. Open 'Analysieren> Tools> ROI-Manager', klicken Sie auf "Hinzufügen", um die ausgewählte ROI zur Intensitätsmessung einzubeziehen. Multiple ROIs können auf einem einzigen Bild für die Messung ausgewählt werden. Wiederholen Sie vorherigen Schritte, bis alle ROIs wurden dem ROI-Manager hinzugefügt.
  4. Klicken Sie auf "Mehr> Multi Measure", stellen Sie sicher, dass "alle Scheiben messen" ausgewählt ist, und dass "eine Zeile pro Scheibe 'deaktiviert ist, und klicken Sie auf" OK ", eine Tabelle der mittleren Fluoreszenzintensität der TMRM und Fluo-4 Signale zu erhalten, für jeden ROI zu jedem Zeitpunkt.
  5. Verwenden von Daten aus allen ROIs die mittleren Intensitäten und Standardabweichung für die TMRM und Fluo-4 Signale zu berechnen.

6. Berechnung der letzten freien Ca 2+ Ionenkonzentration [Ca 2+]

  1. Die freie Ca 2+ Ionenkonzentration [Ca 2+] in der IM - Imaging - Lösung kann mit einer Software wie Maxchelator WEBMAXC VERLÄNGERT (bestimmt werden http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html 11) oder Chelat. Sie können beispielsweise die Variablen in WEBMAXC VERLÄNGERT wie folgt: Temperatur = 24 ° C, pH = 7.1, Stärke Ionic = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca 2+ = 0,0004 M und Mg 2+ = 0,0078 M. Dies führt zu einem Endgehalt an freiem Ca 2+ Ionenkonzentration [Ca 2+] i von 62 nM . Beachten Sie, dass diese Programme nicht berücksichtigt jede Variable annehmen kann, wie beispielsweise Reagenz Reinheit, die Genauigkeit der Messungen und die pH-Bestimmung. Die genaueste Methode für die freie Ca 2+ Konzentration bestimmen , ist eine kalibrierte Ca 2+ selektive Elektrode zu verwenden.

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Representative Results

Wir haben dieses Protokoll verwendet , um die Auswirkungen einer MT-ND5 Mutation auf die Fähigkeit der Zelle 143B Mitochondrien zu untersuchen Erhöhungen 12 Calcium zu puffern. In dem hier gezeigten Beispiel wurden Kontroll 143B Zellen beladen mit TMRM und Fluo-4, AM vor Permeabilisierung mit Digitonin. Nach 5 min der Bildgebung, acht aufeinanderfolgende Zugaben einer 1: 100 - Verdünnung von 40 mM CaCl 2 exogene hergestellt wurden, mit der letzten freien Ca 2+ Ionenkonzentration [Ca 2+] berechnet.

Nach jeder CaCl 2 hinaus nimmt die TMRM Signal als das Einströmen von Ca 2+ -Ionen in die Mitochondrien dissipiert das mitochondriale Membranpotential ΔΨ m (Abbildung 1). ΔΨ m erholt sich dann die Atmung erhöht ΔΨ m zu halten. Dies tritt viermal nach jedem CaCl + Ionen - Konzentration ein kritisches Niveau, an welchem Punkt der mitochondrialen Permeabilität Übergang auftritt und ΔΨ m verflüchtigt sich schnell. Eine kleine ΔΨ m ist evident folgende Permeabilitätsübergang, wie die Zugabe von 10 uM FCCP noch einen Zusammenbruch von ΔΨ m (Abbildung 1) induziert.

Die mitochondriale Calciumkonzentration (Fluo-4 - Signal) beginnt nach dem zweiten CaCl 2 zusätzlich zu erhöhen , wenn das freie [Ca 2+] in den Medien erreicht 0,32 uM (Abbildung 2). Jede nachfolgende CaCl 2 Zugabe verursachte eine progressive Zunahme der mitochondrialen Kalzium.

Die Bilder der gleichzeitigen Messungen von ΔΨ m (TMRM, rotes Signal) und der mitochondrialen Kalzium (Fluo-4, grün sigNAL) sind dargestellt (Abbildung 3).

Abbildung 1
Abbildung 1: Die Messung der mitochondrialen ΔΨ m in Digitonin permeabilisiert 143B Zellen TMRM verwenden. 143B-Zellen wurden mit Fluo-4 vorinstalliert, AM und TMRM vor Permeabilisierung mit Digitonin. Eine 1: 100 - Verdünnung von 40 mM CaCl 2 wurde exogenen in sequentieller Aliquots zugegeben. Der Endgehalt an freiem [Ca 2+] in den Medien für jede Addition (*) gekennzeichnet. FCCP wurde nach etwa 40 min bis zu einer Endkonzentration von 10 uM zugegeben. ΔΨ m wird in rot dargestellt, die durch die relative Intensität repräsentiert (RI) des TMRM Signals. Die Daten sind Mittelwert ± sd n = 3. Abbildung mit Genehmigung aus Lit. 12 angepasst ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere versio zu sehenn dieser Figur.

Figur 2
Figur 2: Messung der mitochondrialen Calcium in Digitonin permeabilisiert 143B Zellen unter Verwendung von Fluo-4 AM. 143B-Zellen wurden mit Fluo-4 vorinstalliert, AM und TMRM vor Permeabilisierung mit Digitonin. Eine 1: 100 - Verdünnung von 40 mM CaCl 2 wurde exogenen in sequentieller Aliquots zugegeben. Der Endgehalt an freiem [Ca 2+] in den Medien für jede Addition (*) gekennzeichnet. FCCP wurde nach etwa 40 min bis zu einer Endkonzentration von 10 uM zugegeben. Mitochondriale Calcium ist in grün dargestellt, die durch die relative Intensität dargestellt (RI) des Fluo-4-Signal. Die Daten sind Mittelwert ± sd n = 3. Abbildung mit Genehmigung aus Lit. 12 angepasst ist. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 3: Die gleichzeitige Messung der mitochondrialen Kalzium und ΔΨ m in Digitonin permeabilisiert 143B Zellen mit Fluo-4, AM und TMRM. 143B-Zellen wurden mit Fluo-4 vorinstalliert, AM und TMRM vor Permeabilisierung mit Digitonin. Eine 1: 100 - Verdünnung von 40 mM CaCl 2 wurde exogenen in sequentieller Aliquots zugegeben. Der Endgehalt an freiem [Ca 2+] in den Medien für jede zusätzlich angegeben. Representative konfokale Bilder die gleichzeitige Färbung von ΔΨ m (TMRM, rot) und mitochondriale Calcium (Fluo-4, grün) zeigt. Beachten Sie, dass die Fluo-4-Signal ist hart an der ruhenden Kalzium-Konzentration von 0,062 & mgr; M zu erkennen. Weiß Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bild wird mit Genehmigung aus Lit. 12 angepasst.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Calcium spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellprozessen, einschließlich Muskelkontraktion, neuronaler Signalgebung und Zellproliferation 13. Erhöhungen der Zelle Calciumkonzentrationen sind oft mit Energiebedarf verbunden sind , mit Kalzium können direkt mitochondriale oxidative Phosphorylierung zu stimulieren ATP Generation 3 zu erhöhen. Es ist daher wichtig, dass wir die Fähigkeit, effektiv überwachen mitochondriale Calciumakkumulation und der Lage sein, zu vergleichen, haben, wie diese Funktion sowohl von genetischen Faktoren und pharmakologische Wirkstoffe beeinträchtigt wird.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls

Dieses Protokoll beschreibt die Fähigkeit , die Mitochondrien Kalzium Anhäufung und ΔΨ m gleichzeitig mit Fluo-4, AM und TMRM zu überwachen. Während des Färbeprozesses ist es kritisch, die Zellen bei Raumtemperatur zu inkubieren, die Wirksamkeit von Fluo-4 zu optimieren, AM in mitochondrial ErfassungsKalzium. Inkubation bei Raumtemperatur reduziert die Aktivität der cytosolischen Esterasen, so dass die ungeladene Fluo-4, AM die Mitochondrienmembranen zu überqueren und die mitochondriale Matrix eingeben. Im Gegensatz dazu Inkubation bei 37 ° C verbessert die Esterase-Aktivität im Cytosol, die AM-Ester Abspalten eines geladenen Fluo-4-Farbstoff zu lassen, die nicht in der Lage sein würde, effektiv die Mitochondrienmembranen zu überqueren.

Sobald Zellfärbung durchgeführt wurde, werden die Zellen in IM Imaging-Lösung eingetaucht. Diese Lösung hat eine höhere TMRM Konzentration im Vergleich zu der anfänglichen RS Färbelösung. Nun, da die Zellen werden permeabilisiert, die TMRM kein äquilibriert länger durch die Plasmamembran. Daher wird die TMRM Konzentration in der IM Abbildungs ​​Lösung erhöht, um die korrekte Äquilibrierung über die mitochondrialen inneren Membran zu erreichen. Es ist auch in diesem Stadium kritischen Thapsigargin in der IM-Imaging-Lösung aufzunehmen. Thapsigargin blockiert die Endoplasmatischen Retikulum (ER) Ca 2+ ATPase, um sicherzustellen , dass die Fluo-4 - Signal ER Calcium nicht zu erkennen.

Technische Änderungen und Fehlersuche

Einige Zelltypen können die multidrug resistance Transporter auf ihren Plasmamembranen (auch als MDR1 oder P-Glycoprotein bekannt) exprimieren. Dieses Protein ist bekannt , Fluoreszenzindikatoren zu exportieren, einschließlich AM Esterderivate, aus dem Cytosol aus der Zelle 14. Wenn der Transporter exprimiert wird, die beide Fluo-4 AM und TMRM kann aus der Zelle Cytosol exportiert werden, was zu einer suboptimalen Färbung. Um diesen Effekt zu blockieren, kann Verapamil an die RS-Färbelösung hinzugefügt werden, um die multidrug resistance Transporter zu blockieren, Hemmung der Fluo-4, AM und TMRM Export während des Färbeprozesses.

Durch Permeabilisierung der Zellen analysiert werden, Fluo-4, können AM verwendet werden mitochondrialen Ca 2+, ohne konkurrierenden Signalen von anderen Organellen oder dem Zytosol zu detektieren. Wir verwenden routinemäßig die nicht-ionischen Detergent Digitonin zur Permeabilisierung bei einer Konzentration von 25 ug / ml. Diese Konzentration muss eventuell angepasst werden, dass die Solubilisierung der mitochondrialen Membranen sicherzustellen nicht auftritt. Dies kann empirisch bestimmt werden, indem die Intensität des TMRM Signals bei verschiedenen Konzentrationen von Digitonin beurteilen. Wenn die Konzentration von Digitonin zu hoch ist, wird die mitochondriale Membran teilweise solubilisiert werden, wodurch die TMRM Signals.

Einschränkungen der Technik

Einer der wichtigsten Vorteile dieses Protokolls besteht darin , dass durch Verwendung von Fluo-4 AM mitochondriale Calcium zu erfassen, kann TMRM gleichzeitig verwendet werden , um ΔΨ m, mit vernachlässigbarer spektrale Überlappung zwischen den beiden Farbstoffen messen. Um die Spezifität von Fluo-4 für mitochondriale Calcium gewährleisten, wobei die Zellen untersucht werden müssen, permeabilisiert die cytosolische Fluo-4-Signal zu beseitigen. Diese Permeabilisierung ist eine Einschränkung dieser Technik. Während der IM Imaging-Lösung Closely entspricht der Ionenstärke der Zellcytosol, kann sie nicht vollständig all seiner Bestandteile zu replizieren. Dies kann Auswirkungen auf die Ergebnisse, wenn bestimmte cytosolischen Komponenten in das experimentelle System wird geprüft erforderlich sind. Ferner ist, wie die Zellen permeabilisiert werden, kann das Protokoll nicht geeignet für längere Versuche größer als 1 Std.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / alternative Methoden

Verschiedene fluoreszierende Farbstoffe wurden für die Bewertung der mitochondrialen Calcium 8 entwickelt. Diese Farbstoffe sind einfach zu verwenden und Nutzdaten in kurzer Zeit bereitstellen kann. Während diese Farbstoffe hauptsächlich in den Mitochondrien ansammeln können einige sammeln sich auch in anderen Organellen, einschließlich Liposomen oder bleiben in der Zelle Cytosol. Daher muss darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass diese anderen Signale beeinflussen nicht die mitochondriale Kalzium-Signal.

In diesem Protokoll mitochondrial Ca 2+ in permeabilisierten Zellen in Gegenwart von Thapsigargin gemessen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass die cytosolischen und ER Calciumsignale eliminiert werden. Weiterhin ermöglicht Permeabilisierung die Verwendung von Fluo-4 AM zu Ca 2+ mitochondrialen detektieren. Fluo-4, AM hat sehr wenig spektrale Überlappung mit TMRM, was bedeutet , dass die mitochondriale Ca 2+ und ΔΨ m gleichzeitig diese beiden Farbstoffen messen werden können.

Mitochondriale Ca 2+ kann auch 8 unter Verwendung von genetisch kodierten fluoreszierenden Reporter gemessen werden. Diese Reporter können an die Mitochondrien ziel werden, was zu spezifischen mitochondrialen Ca 2+ Signale. Genetisch müssen kodierte Sonden in die Zellen eingeführt werden, untersucht, was in einigen Fällen viel Zeit und Mühe zu nehmen. Im Gegensatz dazu nutzt unser Protokoll die Farbstoffe Fluo-4, AM und TMRM, so dass für eine schnelle und einfache Zellfärbung mitochondrialen Ca zu messen m gleichzeitig.

Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach dieser Technik zu meistern

Mitochondria wirken als lokale Calcium Puffer intrazelluläre Calciumkonzentrationen und den Energiebedarf der Zelle zu regulieren. Wenn dieser Prozess gestört ist, kann eine übermäßige mitochondriale Calciumaufnahme mitochondrialen Permeabilitätsübergang, induzieren in dem Zusammenbruch von ΔΨ m und die Freisetzung von pro-apoptotischen Molekülen führt , die den Zelltod Induktion 4 auslösen.

Wir stellen einen schnellen und geradlinigen Protokoll für die Untersuchung der mitochondrialen Calcium und seine Beziehung zu ΔΨ m und die Induktion der mitochondrialen Permeabilitätsübergang. Dies kann dazu verwendet werden , um zu untersuchen , wie diese mitochondriale Parameter Pathogenese in einem breiten Spektrum von Krankheiten beim Menschen beeinflussen, einschließlich Diabetes 15 und altersbedingtenNeurodegeneration Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson-Krankheit 16. Ferner kann dieses Protokoll verwendet werden , um zu untersuchen , wie die mitochondriale Calcium und ΔΨ m durch genetische Defekte oder Umweltgifte betroffen sind, und auch , wie diese durch Therapien oder Arzneimitteln moduliert werden beeinflusst , die die Mitochondrien Ziel. Diese Arten von zukünftigen Experimenten können wichtige neue Einblicke in die Rolle vor, dass die mitochondriale Kalzium spielt in der menschlichen Gesundheit und Krankheit.

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Acknowledgments

Wir danken Dr. Kirstin Elgass und Dr. Sarah Credo von der Monash Micro Imaging für die technische Unterstützung und den Wellcome Trust und Medical Research Council in Großbritannien für die finanzielle Unterstützung. MMcK ist das Australian Research Council Zukunft Fellowship Scheme (FT120100459), die William Buckland-Stiftung, die australische Mitochondrial Disease Foundation (AMDF), der Hudson-Institut für Medizinische Forschung und Monash University unterstützt. Diese Arbeit wurde von der Regierung von Victoria Operational Infrastruktur Support Scheme unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 10566016
fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher 16000044
1x phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher 10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s) ThermoFisher 15140122
0.25% Trypsin/0.25% EDTA ThermoFisher 25200056
8-well chambered coverslip ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich 793566
KCl Sigma-Aldrich P9541 
MgSO4 Sigma-Aldrich 746452
KH2PO4 Sigma-Aldrich 795488
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 
CaCl2 Sigma-Aldrich 746495
HEPES Sigma-Aldrich H3375 
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670 
EGTA Sigma-Aldrich E4378 
HEDTA Sigma-Aldrich H8126 
malate Sigma-Aldrich M1000
glutamate Sigma-Aldrich G1626
ADP Sigma-Aldrich A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)  ThermoFisher 14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) ThermoFisher T668
Verapamil Sigma-Aldrich V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) ThermoFisher F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO) ThermoFisher D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
digitonin Sigma-Aldrich D141
thapsigargin Sigma-Aldrich T9033
Pluronic F-127  ThermoFisher P3000MP 
hemacytometer VWR 631-0925
10 cm cell culture dishes Corning COR430167
75 cm2 cell culture flasks Corning COR430641

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
  2. Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
  3. Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
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Cellular Biology Ausgabe 119 Mitochondrien Membranpotential Calcium Fluoreszenzfärbung lebende Zellen die konfokale Mikroskopie
Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie
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McKenzie, M., Lim, S. C., Duchen, M. R. Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e55166, doi:10.3791/55166 (2017).

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