Summary
本研究では、in vitro脱落膜で勉強するために共培養システムで使用することができ、一次マウス子宮内膜間質および上皮細胞の単離および培養のための標準化および検証方法を提示します。
Abstract
脱落膜化は、子宮内膜間質細胞のプロゲステロン依存分化のプロセスであり、成功した胚移植のための前提条件です。多くの努力が脱落膜化の基礎となるメカニズムを明らかにするために行われてきたが、胚に接触している上皮細胞とその下にある間質細胞との間の正確なシグナリングは、十分に理解残ります。したがって、脱落膜の分子の詳細については、私たちの知識を向上させることができ、アカウントに上皮および間質細胞の両方を取る方法で脱落膜化を研究。この目的のために、人工的な脱落膜化のインビボモデルは、生理学的に最も関連しています。しかしながら、細胞間コミュニケーションの操作が制限されます。現在、子宮内膜間質細胞のインビトロ培養物を、いくつかのシグナル伝達分子によって脱落膜化の調節を調査するために使用されています。従来、ヒトまたはマウスの子宮内膜間質細胞であります中古。しかし、ヒトサンプルの利用可能性は非常に頻繁に限られています。さらに、マウスの組織の使用は、培養方法における様々な伴います。この研究は、純粋な子宮内膜上皮細胞（EEC）と3日間連続してエストロゲンで処置した大人無傷のマウスを使用して、間質細胞（ESC）の文化を取得するために検証され、標準化された方法を提供します。プロトコルは、細胞の収量、生存性、および純度を改善するために最適化され、さらにEECとESCの共培養中に脱落膜化を研究するために拡張されました。このモデルは、脱落膜の両方の細胞型の重要性を利用すると間の通信中にEECまたはESCによって分泌される重要なシグナル伝達分子の寄与を評価するために適切であり得ます。
Introduction
ヒト子宮内膜は、子宮の内側のライニングであり、可能な妊娠のための準備として、故障や修理の毎月のサイクルを受けます。これは、子宮内腔の内側を覆う上皮細胞の単層および卵巣ホルモンのエストロゲンとプロゲステロンの変動に応じて厚さが変化し、基礎となる間質で構成されています。黄体期の間、排卵後のプロゲステロンサージが大きく、丸い脱落膜細胞に脱落膜化1、2と呼ばれるプロセスを子宮内膜間質細胞の分化を誘導します。ヒトでは、この現象はpredeciduaを形成するために自然に起こるが、胚移植時に、より顕著になります。脱落膜化の機能的結果は、子宮は一過性胚移植の受容になることです。この間隔は、「移植の窓」としてラベル付けされています。胚移植の早期期間中、脱落膜化電子移植胚を取り囲むndometrial間質細胞は、胚3に有害な物質の通過を防止するためのバリアを提供します。胎盤形成が行われた、と後に胎盤4の母体の一部を形成する前に、妊娠中、この脱落膜は、発達中の胎児のための栄養素を提供します。
倫理的かつ実用的な考慮事項は、脱落膜化のプロセスを調査するために人間の研究の設計を制限し、動物モデルの使用を促してきました。 hemochorial胎盤グループの一員として、げっ歯類の子宮内膜はまた、胎盤5の前に脱落膜化を受けることになります。げっ歯類では、しかしながら、脱落膜化プロセスの開始は、余分な刺激が脱落膜反応6をトリガするために必要であることを示し、子宮腔における胚盤胞の存在に依存します。これは、番目の間の複雑な通信を意味します電子胚盤胞との直接接触を持っている子宮内膜上皮細胞、および基礎となる間質細胞。それにもかかわらず、脱落膜化は、人為的に機械的なスクラッチやホルモンプライミングされた子宮内のオイルの点滴などの刺激を用いて誘導することができます。人工脱落膜化モデルを用いたin vivo研究は、私たちが脱落膜化の複雑なシグナル伝達過程で私たちの洞察力を向上させているが、機構的で詳細な研究、 例えば、上皮細胞と間質細胞間の不可欠なコミュニケーションの調査は、限られています。したがって、 インビトロの脱落膜化の研究は、重要な経路を操作し、基本的なプロセスを研究するために使用することができます。この目的を達成するために、主要な子宮内膜間質細胞培養物は、ヒトまたは齧歯類子宮内膜から設定することができます。げっ歯類を採用する脱落膜化工程中の関心の特定のタンパク質の役割を調べるために遺伝子改変動物の使用を納得します。しかし、未熟、prepuberTYマウスは、しばしば他の場合には子宮は培養における不均一が生じる発情周期の全ての段階から収集され、一方、発情周期の合併症を回避するために使用されます。また、脱落膜化のプロセスは、培養培地への、または、マウスからの脱落膜細胞の（ii）の単離によって（I）補充ホルモン（エストロゲン、プロゲステロンまたは環状アデノシン一リン酸（cAMP））により、例えば 、異なるプロトコルで研究されていますプラグチェックや精管切除した男性のための追加の必要性を要求する（擬似）妊娠、一日4.5。これらの制限は、 インビトロ脱落膜で勉強する標準化された方法の必要性を実証します。本研究では、生理学的モデルは、大人から始まるin vitroでの脱落膜化を調べるために、非（擬似）妊娠マウスが表示されます。この方法では、17βエストラジオール（E2）の毎日の注射は、均質とpの増加収率で得られ、子宮内膜細胞の増殖を誘導しますURE細胞集団。さらに、共培養システムの使用は、上皮 - 間質性クロストークの研究と異なるレベルで脱落膜化のプロセスを操作する能力を可能にします。
Protocol
AlexaFluor
この研究のための動物実験はすべてKUルーベン（ベルギー）（プロジェクトP174 / 2013）の倫理審査委員会によって承認されました。マウスは、食物ペレットへの随意アクセスを、標準条件下で飼育し、水道水、かつ制御された条件（23±1.5℃、相対湿度40から60パーセント、12月12日の明/暗サイクル）の下で維持しました。
1.マウス
- 市販のマウス系統（ - 12週齢すなわち C57BL / 6、女性8）を使用します。典型的には4 - 5匹のマウスをさらなる実験のための細胞の適切な量が得られます。
- 動物の発情周期の位相を標準化すると子宮内膜の増殖を誘導するために、分離する前に3回連続日間17βエストラジオール（E2）溶液（100 ngの/ 100μL）100μLで皮下そのままマウスを注入細胞。プロトコルを開始する前に、マウスのサイクル段階をチェックする必要性が回避可能です3 D 'エストラジオール治療の原因。
2.準備
- 落花生油中に100ng / 100μLE2の溶液を作ります。 5匹のマウス（1.2に記載されるように）の注射のために、1.5 mLの量が必要です。
- 1mg / mlのストック溶液を有するように1 mLのエタノール中に1mgのE2を溶かします。
- この原液1を希釈：1,000落花生油中。
- 100 U / mLペニシリンおよび100μg/ mLのストレプトマイシン（さらにHBSS +とも呼ばれる）を補完ハンクス液（HBBS）1倍の500ミリリットルを加えます。
- 培養MESCへのフィルタリングマウス子宮内膜間質細胞の500ミリリットルを加えます（MESC）培地：フェノールレッド、L-グルタミン及び4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンとのダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物のF12（DMEM / F12）酸、N - （2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-N ' - （2-エタンスルホン酸）（HEPES）、10％FBS、0.5 / mlのアムホテリシンB、および100μg/ mLのゲンタマイシンを含有する（FUrther）はMESC媒体と呼ばれます。
- 脱落膜中に文化MESCへのフィルタリング2％のMESC培地の500ミリリットルを作る：フェノールレッド、L-グルタミンおよび2％FBS、0.5μgの/ mLのアムホテリシンBを含むHEPES、および100μg/ mLのゲンタマイシンを含むDMEM / F12。
- さらに呼ばFBS 10％を含むDMEM、0.5μgの/ mLのアンホテリシンB、100μg/ mLのゲンタマイシン、25％MCDB-105培地、および5μg/ mLインスリン（：フィルタリングマウス子宮内膜上皮細胞の500ミリリットル（MEEC）培地を準備します）MEEC媒体として。
- MESC培養用ポリ-L-リジン（PLL）コーティングされたカバースリップを準備します。
- 蒸留水250mLにPLL 25mgを溶解させます。 0.22μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。
- 12ウェルプレート中の滅菌カバースリップを追加します。カバーガラス上で溶解したPLLの300μLを追加します。
- インキュベーションの30分後に溶液を除去。 （ - 2ヶ月まで1）プレートを4℃でさらに使用するまでに保存することができます。
- 10mg / mLストック溶液Oを準備-20℃でのfのコラゲナーゼタイプIAおよび300μLの店舗アリコート。使用前にフィルタします。
24時間単離する前に必要な3.準備
- MEEC培養用のコラーゲンコートしたカバースリップを準備します。
- 蒸留水に0.02 M酢酸溶液（カバースリップあたり1 ml）を準備します。
- 50μg/ mLの最終濃度を得るために、0.02 M酢酸の12 mLの150μLのコラーゲンを追加します。
- 12ウェルプレート中の滅菌カバースリップを追加します。
- （3.1.2を参照）コラーゲン溶液1mLを加えます。
- 37℃でO / N（最低12時間）インキュベートします。
分離時： - （クリーンベンチ内で）無菌環境下で吸引によってカバースリップオフコラーゲン溶液を除去し、空気乾燥してみましょう。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回カバースリップを洗浄します。
- 10 mLを含む15 mLの標準的な管0.25グラムのパンクレアチンを添加することにより、2.5％のパンクレアチン溶液を調製HBSS +。溶解性を増加させるために1時間（200 rpm）で37℃で溶液を振ります。 4℃で保存。
マウスの子宮内膜上皮細胞（MEEC）とマウスの子宮内膜間質細胞（MESC）の4単離および培養
- 0.25％トリプシン（さらにMESC消化ミックスと呼ばれる）を含む最終的な解決策を終了する（3.2参照）2.5％パンクレアチン溶液を含む15 mLチューブにトリプシン25mgを追加します。
- 子宮の単離
- 膣スメア検査で動物の周期相を確認してください。
- 動物を拘束し、50μLのPBSで穏やかに3膣をフラッシュ - 5回。
- スライドガラス上の最終的なフラッシュを収集します。
- 10倍または20倍対物レンズを使用して明視野顕微鏡下で材料を調べます。
- 唯一の発情期にあるマウスを使用します。この段階は、膣洗浄（ 図1中の角化上皮細胞の存在によって特徴付けられます
- このような頸椎脱臼またはCO 2誘発昏睡などの適切な方法を用いて、動物を安楽死させます。
- 無菌環境を生成するために、70％エタノールで死体をスプレーしてください。
- 無菌手術ツールを使用して、腹部を開き、両方の子宮角を可視化するために確保腸を押してください。
- 卵管の下の最も遠位端で子宮角をつかみます。卵管から子宮角を解剖し、脂肪および結合組織を除去します。子宮体以上の遠位端にホーンを切り出し、HBSS + 3mlで35ミリメートルペトリ皿に入れてください。
- すべての子宮角が収集されるまで、他のホーン用や他の動物のために、この手順を繰り返します。
- さらに、ステレオスコープの下で（HBSS +中）子宮角をきれいにし、すべての残留脂肪や結合組織を除去します。
- 子宮内腔を露出させ、目を置き換えるために、長手方向に開いた子宮角をカット新鮮なHBSS +で新しいペトリ皿の電子ホーン。
- パンクレアチン及びトリプシンを含む15 mLのチューブに、すべての子宮角を転送します。
- オービタルシェーカー（50回転）に4℃で60分間水平にインキュベートします。
- 振盪せずに、23℃（RT）で45分間水平にインキュベートします。
- 振盪せずに37℃（水浴）で15分間水平にインキュベートします。
- 一方、0.05％トリプシンエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の溶液2.7 mL中の1mg / mLのコラゲナーゼ株式の300μLを溶解させることによりMESC消化ミックスを作ります。
注：今すぐ上から、さらに単離段階はクリーンベンチの下で無菌環境で行われています。
- 膣スメア検査で動物の周期相を確認してください。
- マウスの子宮内膜上皮細胞（MEEC）文化
- インキュベーションの2時間後、慎重に上澄み液を離れて注ぎます。
- トリプシンを不活性化するために、コールドMEEC培地を含むペトリ皿に子宮に移し、5分間インキュベートアクティビティ。
- 冷HBSS +の3 mLを含む15 mLチューブに子宮を転送します。
- 上皮シートを解放するために10秒間ボルテックス。
- 3 mLのHBSS +できれいなペトリ皿に子宮をすすぎます。
- 繰り返しステップ4.3.2 - 4.3.4は、上皮シートを含む3つの懸濁液の合計を取得します。
- MESC消化ミックスに子宮を移し、（200rpm）し振とうしながら37℃で30分間インキュベート（MESCのさらなる分離のために4.4に進みます）。
- 組織破片を除去するために、100μmのナイロンメッシュ上に静かに3つの細胞懸濁液をピペットで上皮シートを回復します。
- 5分間500×gで回収し、細胞懸濁液を遠心。
- MEEC培地12 mL中にペレットを再懸濁し、よく混ぜます。
- 重力沈降を使用して残りMESCを分離するために5分間溶液を沈降。
- 5 mLのピペットを使用して慎重に上位2ミリリットルを削除します。
- 細胞サスペンシオを遠心nは5分間、500×gで。
- 優しく上下にピペッティングすることによりMEEC培地中で再懸濁します。
- さらなる実験（ 図2a）のための所望の密度でコラーゲン被覆カバースリップ上の細胞をプレート。
- 最低12時間、5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。
注：RNAまたはタンパク質の単離が望まれる場合に、6ウェルプレートに播種が推奨されている間、免疫染色や蛍光カルシウムイメージングなどの機能の実験のために、それは、カバースリップ上で直接細胞をプレーすることをお勧めします。マウス子宮内膜間質細胞の分離が不十分であることができる唯一の消化後に細胞の純度のような2回に分割されています。子宮は、最適な細胞回復および純度を二回消化されています。両方のラウンドでは技術的な介入は同一です。研究者が望むように、両方のラウンドから回収した細胞を、さらなる実験のために維持することができます。
- マウスの子宮内膜のStrOMAL細胞（MESC）文化：第1ラウンド
- ラウンド最初の消化を開始する前に、2.7mLの0.05％トリプシン-EDTA溶液中の1mg / mLのコラゲナーゼ株式の300μLを溶解することにより、第2の消化ミックスを準備します。このミックスはステップ4.4.8で必要とされます。
- 冷たい（4°C）のHBSS +とMESC培地3mlで3×15 mLチューブ（チューブX1、X2およびX3）と三つの小さなペトリ皿を準備します。
- インキュベーションの30分後、10秒間穏やかに子宮を含有するトリプシン溶液を振ります。 MESC細胞が子宮組織から離脱し、トリプシン溶液中に残ります。
- 冷たい（4°C）のHBSS + 3 mLを含む最初のペトリ皿に子宮を移し、よくすすいでください。
- トリプシン活性を阻害するために当初は（ステップ4.4.3でチューブ）子宮角を含むチューブにMESC培地の3ミリリットルを追加します。
- HBSS + MESC培地の3ミリリットルを含むチューブX1に冷たい（4℃）でペトリ皿から子宮を移し、10秒間軽く振ります。 繰り返し二回4.4.4（冷（4℃）HBSS +でペトリ皿への転送）および4.4.6（チューブX2とX3への転送）を繰り返します。
注：最後に、このプロトコルは、4細胞懸濁液になります：1管がトリプシン溶液とMESCを含むMESC培地で3つの管（チューブのX1、X2およびX3）を含みます。 - ステップ4.4.1で説明したように、新しいMESC消化で子宮を転送し、垂直方向に、37℃で30分間インキュベートします。
- 40μmのナイロンメッシュを通して4つの細胞懸濁液を渡すことで、間質細胞を収集します。 MESCの追加5mLでメッシュをすすぎます。
- 7分間500×gで細胞懸濁液を遠心します。
- 所望の密度とのさらなる実験のためにPLLコートしたカバーガラス上MESCとプレートにペレットを再懸濁。
- 5％CO 2インキュベーター中、37℃で6時間またはO / N - 4の最小インキュベートします。
- マウスの子宮内膜間質細胞（MESC）文化：第2ラウンド <オール>
- 冷たい（4°C）のHBSS +とMESC培地3mlで3×15 mLチューブ（チューブY1、Y2およびY3）と三つの小さなペトリ皿を準備します。
- 4.4.7 - を繰り返して、4.4.3を繰り返します。
- 40μmのナイロンメッシュに子宮と一緒に最後の細胞懸濁液を転送します。
- ナイロンメッシュを通してチューブY1、Y2及びY3のコンテンツを渡すことで、間質細胞を収集します。 MESCの追加5mLでメッシュをすすぎます。
- 7分間500×gで細胞懸濁液を遠心します。
- さらなる実験（ 図2b）のためのPLLでコーティングされたカバースリップ上MESC媒体とプレートでペレットを再懸濁。
- 5％CO 2、37℃で6時間- 4の最小インキュベートします。
注：RNAまたはタンパク質の単離が望まれる場合に推奨される6ウェルプレートに播種しながら、免疫染色や蛍光カルシウムイメージングなどの機能の実験のために、それは、カバースリップ上の細胞をプレーすることをお勧めします。
5.ビメンチンピュアMEECとMESC文化の検証のための/サイトケラチン二重染色
- カバースリップ上の細胞をシード。
- PBSは、オービタルシェーカー（50回転）にカルシウムとマグネシウムを含有する3×5分間洗浄します。
- ないシェーカー上で、10分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）（ 注意！）で細胞を固定してください。
- シェーカー（50回転）にカルシウムとマグネシウムを含まないPBSで3回洗浄します。
- シェーカー（50 RPM）で10分間、0.2％トリトンX-100で細胞を透過性。
- シェーカー上でPBSで3回洗浄します。
- シェーカー上で2時間（50 RPM）をPBS中5％ヤギ血清（GS）を有するブロック
- シェーカー（50回転）に4℃で（：1：500）およびモノクローナルマウス抗ヒトパンサイトケラチン（千1）モノクローナルウサギ抗ヒトビメンチンで細胞をインキュベートします。抗体は、0.5％GSでPBSで希釈します。
- シェーカー上でPBSで洗浄3回（50回転）。
- 二次抗体を用いて細胞をインキュベート（1：1,000を0.5％GSで）アレクサフルオロ488結合抗ウサギIgGおよびAlexaフルーア488 conjuシェーカー上で抗マウスIgGをゲーティング。
- シェーカー上でPBSで3回洗浄します。
- マウントは、DAPI、ドライO / Nを含有する水性マウンティング培地で摺動します。
- マニキュアでスライドを密封し、さらなる使用のために4℃に保つ（ 図2a、b）に 。
共培養システムにおけるインビトロ脱落膜化6.
注：4〜5匹の動物を、24ウェルプレートで共培養システムを確立するために必要とされます。好ましくはクリーンベンチの下で、無菌環境で、以下のプロトコルを続行します。
- 調製した細胞培養物は、付加的な24ウェルプレートにおいて（4.3を参照）、上皮細胞単離の遠心分離および/またはインキュベーション工程の間に挿入します。
- 24ウェルプレート中のウェルの所望の量にMESC媒体の400μL - 200を追加します。
- 滅菌ピンセットを用いて、プレフィルド24ウェルに挿入を置きます。
- MEECペレットを再懸濁インサートの上MEEC中・デバイド（ステップ4.3.14）（作業容量：150 - インサートあたり300μL）。文化、5％CO 2インキュベーター内で37℃で細胞。
- 間質細胞の単離（ステップ4.5.6）の第二ラウンドの後に（細胞培養インサートと互換性の）別の24ウェルプレート中の間質細胞をシード。ウェルあたり400μLの細胞懸濁液の作業容量を使用します。
- 5％CO 2インキュベーター中で37℃で6時間-間質細胞は、最小4のためにアタッチすることができます。
- 間質細胞で覆われた第二の24ウェルプレートに最初の24ウェルプレートからの上皮細胞で覆われた細胞培養インサートを移します。滅菌ピンセットを使用するかだけその吊りふもとにインサートをタッチします。
- 培養3の期間、5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞- 5 D上皮細胞は単層を形成し、間質細胞は、80を達成するまで、 - 90％のコンフルエンシーに。さらに、経上皮電気抵抗（TEER）を使用グラントらによって記載されるようにボルト/オーム上皮メーターを用いて、上皮単層を監視します。 7。 800〜/ウェルの値は、上皮単層コンフルエントを検討するのに十分でした。
- ガラスピペットまたはファインピペットチップを使用して3日 - 必要に応じて、すべての2培地を交換してください。インサート媒体を交換する前に、（下で播種）間質細胞の培地を交換して起動します。これを37℃に予熱した細胞培養培地を使用することをお勧めします。
- 実験を開始する前に、 試験管脱落膜に誘導するために脱落膜化媒体を準備します。間質細胞のウェルあたり400μLの作業容量を使用してください。
- -20℃で、以下のストック溶液とストアのアリコートを準備します。
- エタノール中に250μMのメドロキシプロゲステロン17-アセテート（MPA）を準備します。
- 100mMのストック溶液8ブロモアデノシン3 '、5'-超純水でキャンプを準備します。
- 1μMのMPAおよび2％FBSを含むMESC培地中の0.5mMのcAMPを含む脱落膜の媒体を作ります。
- -20℃で、以下のストック溶液とストアのアリコートを準備します。
- ゆっくりウェルから培地を除去し、間質細胞上に脱落膜培地を追加します。制御条件が必要な場合は、2％のFBSを含有するMESC媒体を用います。
- 細胞培養インサートから培地を除去し、細胞上にMEEC媒体の300μLを追加します。
- 5％のCO 2で37℃のインキュベーターで5日間細胞をインキュベートします。
- 五日後、RT-qPCRにより間質細胞における脱落膜化の程度を評価（下記参照）。
- レサズリンベースの生存能力の試薬を用いて、上皮細胞の生存性を検証します。
- MEEC培地中で生存可能性試薬の1:10溶液を調製します。
- 新しい24ウェルプレートに細胞培養インサートを転送します。
- 細胞上にMEECソリューション - 生存性試薬の300μL - 150を追加します。
- で5％CO 2中37℃でインキュベート少なくとも4から5時間または一晩（パープル/ピンク青）カラーシフトを観察することによって、細胞の生存率を評価します。
注：研究者によって好ましいと脱落膜化はまた、マウスプロラクチン特異的ELISAを用いて評価することができます。
定量RT-PCRによる脱落膜化の7.Validation
注：定量RT-PCRによる脱落膜化の検証のためには、RNA分析のために細胞の十分な量を受け取るために二重にすべてのテスト条件を実行することをお勧めします。
デClercq らに以前に記載されているように、定量的RT-PCRが行われます。 8。
簡単に説明します：
- 商業RNA単離キットを用いて全RNAを単離します。
- それぞれ、製造業者のプロトコルに従って、商業用の方法を用いてRNAの量と質を評価します。
- 1μgの全RNAから出発し、製造業者のプロトコルに従って、cDNAを合成。
- QRT-PCR反応を行うために、製造業者のプロトコルに従って市販のキットを使用します。
- 三連ですべてのサンプルを実行します。
- 反応を実施することが望まハウスキーピング遺伝子とプロラクチン（prl8a2）用の市販のTaqManマスターミックスおよび特定のTaqManプローブを使用してください。
Representative Results
議定書の一般的な概要
図1Aは、プロトコルの一般的な概要を示しています。 3日間連続E2（100 NG）の毎日の注射は、動物を同期し、発情周期の位相を標準化するために使用されました。発情周期は、膣洗浄液によって評価することができ、発情前期、発情、発情間期、および発情後期段階に分割されています。サイクル段階は、ホルモンの変化に供される洗浄液中落屑細胞の割合に応じて指定することができます。エストロゲンのレベルを増加させると、動物が発情期に進化いたします。この相は、容易に排他的に角化上皮細胞の存在及び白血球の非存在下（ 図1B）によって検出することができます。 4日目に、発情期にある動物の子宮を回収し、MEECとMESCは（ 図1C）分離されています。脱落膜化C5日間のインキュベーション期間中、2％FBS培地に0.5mMのcAMPおよび1μMMPAを添加することによって誘導されます。
MEECとMESC文化の品質管理
初代細胞培養物の純度は、ビメンチンおよびサイトケラチンの発現の差によって評価することができます。ビメンチンは、したがって、子宮内膜間質細胞は、間葉系細胞で発現される中間フィラメントです。サイトケラチンは、上皮組織の細胞骨格に見られる中間径フィラメントです。 図2Aは MEECとMESCにおけるビメンチンとサイトケラチンのmRNA発現レベルは、定量RT-PCRを用いて評価を示しています。ビメンチンのレベルはMEECにMESCが高く、低い（高い2.2倍、P <0.001）、サイトケラチンレベルはMESCにMEECが高く、低いながら（36倍高く、P <0.001）。ビメンチン/サイトケラチン二重染色を行い、間質細胞はEPIT一方ビメンチンを発現することが示されましたhelial細胞はサイトケラチン（ 図2B、C）を発現します 。一次抗体の非存在は、免疫染色（ 図2D、E）の陰性対照として使用しました。これらの免疫組織学的染色は、両方の子宮内膜細胞培養（MEECとMESC）は最大90％の純度を有することを示します。
MEEC / MESC共培養における脱落膜化
単離後、マウスの子宮内膜間質細胞は、子宮内膜の環境を模倣するために共培養系に播種しました。上皮細胞は、細胞培養インサート（800のTEER値 - 1,000 /ウェル）で単層を形成されるまで細胞を培養し、間質細胞がサブコンフルエント状態に達しました。脱落膜化は、0.5mMのcAMPおよび1μMMPAのアプリケーションとの間質細胞において誘導しました。インキュベーションの5日後、プロラクチンmRNAレベルはdecidための指標として定量RT-PCRにより、間質細胞において評価しました。ualization（ 図3A）。プロラクチンレベルは非常に対照培地（P <0.01）を用いてインキュベートした細胞におけるホルモンおよび検出不可能に供する細胞で発現させました。
上皮細胞は、細胞培養インサートの内部視覚化するのが困難であるため、生存率アッセイは、5日間のインキュベーション期間（ 図3B）の直後に実施しました。通常の増殖培地および生存度試薬の混合物をウェルに添加し、最小8の期間インキュベートした - 12時間。鮮やかなピンク色の青から色ずれが生存上皮細胞の存在を示しました。生存細胞が存在するときに色ずれがのみ発生することに注意してください。
図1：プロトコルの総括。 （A）単離プロトコールのスキームが3で始まりますエストロゲン注射の連続した日。 3日目に、必要な準備を準備する必要があります。 4日目に、発情期は、膣洗浄を行うことにより、（星で示されている）を評価します。 MESCとMEECは異なる消化の手順を用いて単離されています。細胞がコンフルエントである場合に6日目に、または、脱落膜化培地と5日間のインキュベーション期間（ - 11日目6）にcAMPおよびMPAを添加することによって、共培養系に誘導することができます。 （B）膣洗浄液中角化上皮細胞の存在を特徴と発情期の代表的な画像（倍率10×）。 （C）MESCとMEEC（倍率20倍、スケールバー：100μm）での代表的な画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：RT-PCRによる脱落膜化の検証。間質細胞におけるプロラクチンの発現（A）mRNAレベルは、脱落膜化を評価します。 RNAレベルは比較的ハウスキーピング遺伝子PGK1及びTBPの幾何平均に定量化しました。制御または脱落膜培地で培養した細胞の変化倍率は平均±SEMとして示されています。 （B）（上）及び後（下部）脱落膜化刺激前間質細胞の例示的な絵。右側のインサートが脱落膜化間質細胞の倍率を示しています。脱落膜化を黒矢印で示されている多核細胞の存在によって特徴付けられます。 （C）アッセイ後のインサートにおける上皮細胞生存率の評価の代表的な画像。写真は生存性試薬の投与（Prestoblue）（0時間）とfの直後に撮影されましたollowingの朝（ON）。 **：p <0.01、マンホイットニーU検定です。 ON：一晩。スケールバー：100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
脱落膜化は脱落膜細胞を分泌ラウンドに子宮内膜間質細胞のプロゲステロン依存分化です。ヒトでは、このプロセスは、月経周期の黄体期の間に自然に発生し、predeciduaを形成する血管細胞を取り囲む間質細胞で開始されます。しかし、げっ歯類では、胚盤胞の存在が脱落膜化を誘導することが不可欠です。脱落膜化のみ子宮内膜上皮細胞との接触後に生じるということは重要な要因は、基礎となる間質に脱落膜化を誘導するために上皮細胞によって分泌されることを意味します。脱落膜化プロセスの開始におけるこの差は認められるべきであるが、ヒト脱落膜が胚移植時よりロバストになるという事実は、同様のメカニズムが関与している可能性を示唆しています。 インビトロでの細胞培養は、しばしば脱落膜化のプロセス中に特定の分子の効果を研究するために使用されます。それにもかかわらず、回収することができる可用性およびヒト組織の量は、多くの場合、限定されるものではなく、 例えばバリエーション、周期相、妊娠回数および子宮内膜症や腺筋症などの婦人科疾患の存在を伴っています。これらの問題の多くは、容易にアクセスおよびサイクルフェーズは独立しているマウスの組織を使用することによって防止することができます。マウス組織を使用する別の強力な利点は、遺伝的に修飾されたげっ歯類を使用する機会実験多数の設定の可能性です。現時点では、多くの異なるアイソレーションプロトコルが使用する瞬間に、動物の年齢および発情期中期間に高い変動と文献に記載されています。
この研究は、利点は、分離前のエストロゲンの毎日の注射によって標準化された発情周期を撮影した間質および上皮細胞の初代子宮内膜共培養するための新しい方法を提示しています。さらに、エストロゲンは、kはさらに単離当たり収量を増大させる、上皮および間質細胞において増殖を誘導することがノウン。このホワイトペーパーで説明する単離プロトコールは、グラントらに基づいていました。 図7に示すように 、しかし、さらなる最適化のステップは、異なる細胞培養物の収量、純度および生存率を増加させることが含まれていました。まず、HBSSは常に一次培養物の汚染を避けるために抗生物質を補充しました。 MEECの単離の間、温度適応が最初に消化中の上皮細胞の収穫を増加させる（37℃、15分）を行いました。次に、追加のステップは、その活性を阻害するためにFBSを含有する培地を添加することによってトリプシン消化後に酵素活性を和らげるために含めました。さらに、MEECsメッシュは、一般的に、彼らは、しばしばクラスタ、細胞シートに来るように（100ミクロン）に記載されているものよりも大きかったそれらのフィルターに通しました。また、間質細胞による汚染は、addを実行することにより減少しましたMEECsとされたmESCは、重力沈降に基づいて分離されたitionalステップ。それがコーティングされていないか、PLLでコーティングされたガラスカバースリップへの取り付けが不十分であることが明らかとなった最後に、MEECsは、カバーガラスへの細胞の付着を高めるために、コラーゲンでコーティングされたカバースリップ上に播種しました。たmESCの単離の間、コラゲナーゼ（1mg / ml）を、消化を改善するために添加しました。さらに、この消化ステップは、残りMEECsの汚染を避けるために、二重に行きました。すべてのこれらの追加の工程は、均質な細胞集団の純粋な、生存培養物が得られました。
細胞集団の純度は、上皮マーカーとして間質マーカー及びサイトケラチンとしてビメンチンを使用して免疫染色し、定量RT-PCRで評価しました。明らかに、ビメンチンとサイトケラチンの反対の発現パターンはMEECとMESCで観察されました。しかし、ビメンチンおよびサイトケラチンの相対的mRNA発現はMEEC培養物において類似していることに気づいたことができます。 Similarの結果は、培養中の上皮細胞はビメンチン発現9を獲得した他の研究グループによって公開されています。より重要なビメンチンおよびサイトケラチンの間のタンパク質発現の差は、異なる細胞集団の免疫組織染色で観察された通りです。二重免疫染色は、EECSはサイトケラチン陽性であったとESCはビメンチン陽性であったことを示しました。免疫染色におけるこれらのマーカーの使用は、確立された方法であり、標準的な細胞型10を示すために使用されます。
多くの研究は、MESCの脱落膜化で実行されているが、それは、このモデルにおける上皮細胞の存在は、脱落膜化の結果を変化させることが可能なままです。第一に、MEECはMESC馴化培地の存在下で、または共培養設定で単層に成長する場合、単分子層は、（改良された上皮細胞の経上皮電気抵抗を有することが示されていますTEER）、MESC 7によって分泌される因子に起因します。また、ピエロら。 図11は、17βエストラジオールの影響を受け、上皮増殖は、間質細胞から分泌される因子によって媒介される可能性があるという証拠を提供し、あるいは、上皮細胞は、間質脱落膜12,13を調節する因子を放出することができます。全体として、上皮 - 間質共培養環境はパラクリン相互作用および通信を可能にする多くの生理学的状況を提供することは明らかです。インサート共培養系を使用して、2つの異なる細胞型を培養する方法は、14、15先に説明したおよびマウス初代細胞を使用するように適合させました。脱落膜のための読み出しなどのプロラクチンmRNAレベルの検出により、記載された技術が利用可能であり、許可脱落膜のための非常に再現読み出しを持っていますそれによって脱落膜中の上皮 - 間質関係の研究です。 MEECから媒介パラクリン信号は、間質細胞に脱落膜化の程度を変更することがあります。また、モデルは、直接、間質細胞に影響を与えることなく、上皮側の特定の変調を可能にします。したがって、MEECとMESCのこの共培養は、間質脱落膜上の読み出しと上皮細胞上などホルモン、サイトカイン、の効果を評価するための最適なツールを提供しています。この共培養系の別の利点は、研究者らは、トランスジェニック動物から単離された細胞を使用することにより、上皮または間質区画のいずれかにおける脱落膜化工程における特定のタンパク質の関与を調査することを可能にすることです。さらに、この技術は、胚盤胞の存在下で上皮細胞によって分泌されるパラクリン因子は、基礎となる間質の脱落膜化を誘導するのに十分であるかどうかを評価するために、胚盤胞の接着性を調査するために非常に有用であろう細胞。栄養膜浸潤の重要なステップは、タンパク質分解酵素の作用によって媒介される細胞外マトリックスの分解に相関していました。提案された技術は、胚盤胞、上皮細胞および支持基質間のクロストークを調査するためのインビトロモデルとして適用することができます。
しかし、現時点ではほとんどの腺としてだけでなく、管腔することができます上皮細胞の起源について知られています。したがって、上皮細胞の遺伝的および分子プロファイルのさらなる特性が要求されます。また、記載された方法は、上皮細胞の分極に関する利用可能な知識が限られています。現時点では、上皮細胞の分極を考慮していませんでした。しかし、膜タンパク質の発現の差は、頂端および基底膜に記載されています。上皮層の不適切な分極がepitheli間のパラクリン相互作用に影響を与える可能性がありますアルと間質細胞。しかし、分極した上皮細胞を得るための方法が記載されていると記載された技術15、16に含めることができます。
要するに、記載されたプロトコルは、正常マウスの子宮内膜上皮細胞と間質細胞の初代細胞培養を確立するための技術が提案されています。定量RT-PCRによって確認し、ビメンチンおよびサイトケラチンの免疫染色この技術は、純粋な細胞培養物をもたらします。最終的には、上皮および間質共培養は、脱落膜化工程でMEECおよび/またはMESCのいずれかによって媒介されるパラクリン信号の調査を可能に導入されました。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、研究財団・フランダース（FWO G.0856.13N）とKUルーベン（OT / 113分の13）の研究評議会からの助成金によってサポートされていました。 KDCはFWOベルギーによって運営されています。 AHはOT / 113分の13によって運営されています。我々は、共焦点顕微鏡を使用するためKUルーベン（http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm）の細胞イメージングの中核施設に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant | Greiner Bio-one | 662610 | Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/ |
| Nunc Cell culture treated 24 well plates | Thermo Scientific | 142475 | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475 |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma Aldrich | B7880 | Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma Aldrich | M1629 | Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE |
| Arachis oil | Supermarket | Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Thermo Scientific | A13261 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 |
| HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175-046 | Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 |
| 17-β Estradiol | Sigma Aldrich | E8875 | Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en®ion=BE |
| Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized | Merck Millipore | SCGPU05RE | http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063 |
| DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES | Gibco | 11330-032 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057 |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | Gibco | 10500-056 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064 |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018 |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-037 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Sigma Aldrich | D5921 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE |
| MCDB-105 | Sigma Aldrich | M6395 | Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I1882 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE |
| Coverslips, glass, 18 mm Ø | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 1001/18 | http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE |
| Collagenase type IA from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C2674 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-094 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | T7409 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352340 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
| Cell strainer, 100 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352360 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 |
| Acetic acid (glacial) 100% | Merck Millipore | 1.00063 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063 |
| Collagen I | Corning | 354236 | From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29# |
| Pancreatin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | P3292 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE |
| 35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | BD Falcon | 353001 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630 |
| Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent | VWR Chemicals | 20821296 | https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP |
| monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3) | Cell Signalling Tech | #5741 | Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 |
| monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin | Sigma Aldrich | C2562 | Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en®ion=BE |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix | 19943 | http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11034 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;; |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 594 | Thermo Scientific | A-11032 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;; |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html |
| DPBS, with calcium and magnesium | Gibco | 14040174 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 |
References
- Cummings, A. M., Yochim, J. M. Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone. J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).
- Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
- Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).
- Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).
- Power, M. L., Schulkin, J. The evolution of the human placenta. , Johns Hopkins University Press. (2012).
- Finn, C. A. The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse. J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).
- Grant, K. S., Wira, C. R. Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture. Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).
- De Clercq, K., et al. Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle. Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).
- Pieper, F. R., et al. Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells. Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Pierro, E., et al. Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium. Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).
- Kim, M. R., et al. Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells. Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).
- Chen, J. C., et al. Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production. Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. J Vis Exp. (113), (2016).
- Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model. Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).
- Park, D. W., et al. A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion. Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).
