Summary
Denne undersøgelse viser en standardiseret og valideret metode til isolering og dyrkning af primært muse endometrisk stromale og epiteliale celler, som kan anvendes i en cokultur til undersøgelse in vitro decidualisering.
Abstract
Decidualisering er en progesteron-afhængig differentiering proces med endometriske stromale celler og er en forudsætning for en vellykket embryo implantation. Selvom der er gjort mange forsøg på at afsløre de underliggende mekanismer decidualisering forbliver nøjagtige signalering mellem epithelcellerne, der er i kontakt med embryoner og de underliggende stromaceller dårligt forstået. Derfor studerede decidualisering på en måde, der tager både epitel- og stromaceller i betragtning kunne forbedre vores viden om de molekylære detaljer decidualisering. Til dette formål in vivo modeller af kunstig decidualisering er fysiologisk de mest relevante; dog manipulation af intercellulære kommunikation er begrænset. Øjeblikket, in vitro kulturer af endometriske stromale celler bliver brugt til at undersøge modulering af decidualisering af flere signalmolekyler. Konventionelt humane eller muse endometriske stromale celler erBrugt. Imidlertid er tilgængeligheden af humane prøver meget ofte begrænset. Endvidere er anvendelsen af murine væv ledsaget med sort i fremgangsmåden til dyrkning. Denne undersøgelse præsenterer en valideret og standardiseret metode til at opnå ren Endometrie epitelcelle (EØF) og stromacelle- (ESC) kulturer ved hjælp af voksne intakte mus behandlet med østrogen i tre på hinanden følgende dage. Protokollen er optimeret til at forbedre udbyttet, levedygtighed, og renhed af cellerne og blev yderligere udvidet med henblik på at studere decidualisering i en cokultur af EØF og ESC. Denne model kan være egnet til at udnytte betydningen af begge celletyper i decidualisering og at vurdere bidraget af betydelige signalmolekyler udskilt af EØF eller ESC under intercellulær kommunikation.
Introduction
Den menneskelige endometrium er den indvendige foring af livmoderen og undergår månedlige cyklusser af nedbrydning og reparation som en forberedelse til mulige graviditeter. Den består af et enkelt lag af epitelceller, der beklæder livmoderen lumen og den underliggende stroma, der varierer i tykkelse ifølge udsving i æggestokkene hormoner østrogen og progesteron. Under lutealfasen, vil postovulatory progesteron bølge inducerer differentiering af endometriske stromale celler i større, runde moderhindeceller, en proces kaldet decidualisering 1, 2. I humant, dette fænomen forekommer spontant at danne predecidua, men bliver mere udtalt ved embryo implantation. En funktionel konsekvens af decidualisering er, at livmoderen forbigående bliver modtagelige for embryo implantation. Dette interval er mærket som "vindue for implantation«. I den tidlige periode af embryo implantation, den decidualized endometrial stromaceller omgiver implantere embryo vil tilvejebringe en barriere for at forhindre passage af skadelige stoffer til embryo 3. Under graviditet, vil denne decidua tilvejebringe næringsstoffer til det udviklende foster før placentation har fundet sted, og vil senere danne maternelle del af moderkagen 4.
Etiske og praktiske overvejelser begrænser udformningen af humane undersøgelser for at undersøge processen med decidualisering og har bedt brugen af dyremodeller. At være medlem af den hemochorial placentation gruppen, vil endometriet af gnavere også gennemgå decidualisering før placentation 5. Hos gnavere imidlertid indledningen af decidualisering proces afhænger af tilstedeværelsen af blastocyster i uterine lumen, hvilket indikerer, at en ekstra stimulus er nødvendig for at udløse decidua responser 6. Dette indebærer en indviklet kommunikation mellem the endometriske epitelceller, der har direkte kontakt med blastocyst, og de underliggende stromaceller. Ikke desto mindre kan decidualisering kunstigt induceret ved hjælp stimuli som mekanisk ridser eller instillation af olie i en hormonalt primet livmoder. Selvom in vivo undersøgelser med anvendelse af kunstige decidualisering modeller har givet os mulighed for at forbedre vores indsigt i den komplekse signalering processen med decidualisering, mekanistiske fordybelse, f.eks undersøgelse af den uundværlige kommunikation mellem epitel og stromaceller, er begrænsede. Derfor kan in vitro decidualisering undersøgelser bruges til at manipulere vigtige veje og studere grundlæggende processer. Til dette formål kan primære endometriske stromale cellekulturer oprettes fra human eller gnaver endometriet. Anvender gnavere samtykker anvendelse af genetisk modificerede dyr for at undersøge rollen af et specifikt protein af interesse under decidualisering processen. Imidlertid umodne, prepuberty mus anvendes ofte for at undgå komplikationer af østrale cyklus, mens i andre tilfælde uteri indsamles fra alle faser af østrale cyklus, hvilket resulterer i en uensartethed i kulturerne. Desuden er processen med decidualisering blevet undersøgt i forskellige protokoller, f.eks, ved (i) supplering hormoner (østrogen, progesteron eller cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP)) til dyrkningsmediet, eller ved (ii) isolering af moderhindeceller fra mus ved dag 4,5 af (pseudo) graviditet, hvor efterspørgslen yderligere behov for plug kontrol og vasektomerede hanner. Disse begrænsninger påvise nødvendigheden af en standardiseret metode til at studere in vitro decidualisering. I denne undersøgelse til en fysiologisk model undersøge in vitro decidualisering startende fra voksne, vil ikke (pseudo) drægtige mus præsenteres. Ved denne fremgangsmåde vil daglig injektion af 17β-østradiol (E2) inducerer proliferation af endometriale celler, hvilket resulterer i et forøget udbytte af homogen og pure cellepopulationer. Endvidere er anvendelsen af et co-dyrkning system tillader studiet af epitel-stromale krydstale og evnen til at manipulere processen med decidualisering på forskellige niveauer.
Protocol
AlexaFluor
Alle dyreforsøg til denne undersøgelse blev godkendt af den etiske bedømmelsesudvalg af KU Leuven (Belgien) (Projekt P174 / 2013). Mus blev huset under standardbetingelser, med ad libitum adgang til fødevarer pellets og postevand, og holdes under kontrollerede forhold (23 ± 1,5 ° C, relativ fugtighed 40 - 60%, 12/12 lys / mørke cyklus).
1. Mus
- Brug kommercielt tilgængelige musestamme (dvs. C57BI / 6, kvindelige 8 - 12 uger gamle). Typisk 4 - vil 5 mus give en passende mængde celler til yderligere forsøg.
- Injicere intakte mus subkutant med 100 pi af 17β-østradiol (E2) opløsning (100 ng / 100 pi) i 3 på hinanden følgende d før isoleringen for at standardisere fasen af østrale cyklus af dyrene og til at inducere proliferation af endometrial celler. Behovet for at kontrollere cyklen fase af musene før du starter protokollen er undgåelige beårsagen til 3 d 'estradiol behandling.
2. Præparater
- Lav en opløsning af 100 ng / 100 pi E2 i jordnøddeolie. For injektioner af fem mus (som beskrevet i 1.2), er en mængde på 1,5 ml nødvendigt.
- Opløs 1 mg E2 i 1 ml ethanol til at have en stamopløsning af 1 mg / ml.
- Fortynd denne stamopløsning 1: 1000 i jordnøddeolie.
- Gør 500 ml Hanks balancerede saltopløsning (HBBS) 1x suppleret med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (herefter benævnt HBSS +).
- Gør 500 ml filtreret Mouse Endometrial Stromal Cell (Mesc) medium til dyrkning Mesc: Dulbeccos modificerede Eagle Medium / Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12) med phenolrødt, L-glutamin og 4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre syre, N - (2-hydroxyethyl) piperazin-N '- (2-ethansulfonsyre) (HEPES) indeholdende 10% FBS, 0,5 ug / ml amphotericin B, og 100 ug / ml gentamicin (further benævnt Mesc medium).
- Gør 500 ml filtreret 2% Mesc medium til dyrkning Mesc under decidualisering: DMEM / F12 med phenolrødt, L-glutamin og HEPES indeholdende 2% FBS, 0,5 ug / ml amphotericin B, og 100 ug / ml gentamicin.
- Forbered 500 ml filtreret Mouse Endometrial epitelcelle (MEEC) medium: DMEM indeholdende 10% FBS, 0,5 ug / ml amphotericin B, 100 ug / ml gentamicin, 25% MCDB-105-medium, og 5 ug / ml insulin (yderligere omtalt som MEEC medium).
- Forbered Poly-L-lysin (PLL) belagte dækglas til Mesc kultur.
- Opløs 25 mg PLL i 250 ml destilleret vand. Opløsningen filtreres under anvendelse af et 0,22 um filter.
- Tilføj sterile dækglas i en 12-brønds plade. Der tilsættes 300 pi af opløst PLL på dækglassene.
- Fjern opløsningen efter 30 minutters inkubation. Pladerne kan opbevares ved 4 ° C indtil yderligere brug (op til 1 - 2 måneder).
- Forbered en 10 mg / ml stamopløsning of kollagenase type IA og gemme portioner af 300 uL ved -20 ° C. Filtrer før brug.
3. Præparater Nødvendig 24 timer før Isolation
- Forbered kollagen belagt dækglas for MEEC kultur.
- Forbered en 0,02 M eddikesyre i destilleret vand (1 ml pr dækglas).
- Tilføj 150 pi kollagen i 12 ml 0,02 M eddikesyre til opnåelse af en slutkoncentration på 50 ug / ml.
- Tilføj sterile dækglas i en 12-brønds plade.
- Tilsæt 1 ml af kollagen løsning (se 3.1.2).
- Inkuber O / N (minimum 12 timer) ved 37 ° C.
Under isolering: - Fjern kollagenopløsningen off dækglassene ved sugning og lad det lufttørre i et sterilt miljø (i den laminare strømning).
- Vask dækglassene to gange med phosphatbufret saltvand (PBS).
- Der fremstilles en 2,5% pancreatin opløsning ved at tilsætte 0,25 g pancreatin i en 15 ml kanonisk rør indeholdende 10 mlHBSS +. Ryst (200 rpm) opløsningen ved 37 ° C i 1 time for at forøge opløseligheden. Opbevares ved 4 ° C.
4. Isolering og Kultur af Mouse Endometrie epithelceller (MEEC) og Mouse Endometrie stromacellers (Mesc)
- Tilsættes 25 mg trypsin i et 15 ml rør indeholdende 2,5% pancreatin opløsning (se 3.2) for at ende op med en endelig opløsning indeholdende 0,25% trypsin (herefter benævnt Mesc fordøjelse mix).
- Isolering af uteri
- Tjek cyklus fase af dyrene med en vaginal smear undersøgelse.
- Begrænse dyret og skylle skeden forsigtigt med 50 uL PBS 3 - 5 gange.
- Saml den endelige flush på en glasplade.
- Undersøg materialet under et lyst felt mikroskopet med en 10X eller 20X mål.
- Brug kun mus, som er i brunst fase. Denne fase er kendetegnet ved tilstedeværelsen af forhornede epitelceller i den vaginale udskylning (figur 1
- Afliv dyrene ved hjælp af en passende metode, såsom cervikal dislokation eller CO2-induceret narkose.
- Spray slagtekroppene med 70% ethanol for at generere et sterilt miljø.
- Brug sterile kirurgiske værktøjer, åbne maven og skubbe tarmene til side for at visualisere begge uterine horn.
- Grab børhornet på det mest distale ende under æggelederen. Dissekere livmoderhornene fra æggelederen og fjern adipøse og bindevæv. Klip horn ved den distale ende over livmoderen og læg den i en 35 mm petriskål med 3 ml HBSS +.
- Gentag dette trin for de andre horn og for de andre dyr, indtil alle livmoderhornene indsamles.
- Rengør uterine horn (i HBSS +) yderligere under en Stereoskopet og fjerne alle resterende fedt eller bindevæv.
- Skær livmoderhornene åbne på langs for at eksponere uterine lumen og erstatte the horn i en ny petriskål med frisk HBSS +.
- Overfør alle livmoderhornene til 15 ml rør, der indeholder pancreatin og trypsin.
- Inkuber horisontalt i 60 minutter ved 4 ° C på en orbitalryster (50 rpm).
- Inkuber horisontalt i 45 minutter ved 23 ° C (RT), uden at ryste.
- Inkuber horisontalt i 15 min ved 37 ° C (vandbad), uden at ryste.
- I mellemtiden gøre Mesc fordøjelse mix ved opløsning 300 pi af 1 mg / ml collagenase stamopløsning i 2,7 ml 0,05% trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning.
BEMÆRK: Fra nu af, udføres yderligere isoleringstrin i et sterilt miljø under en laminar strømning.
- Tjek cyklus fase af dyrene med en vaginal smear undersøgelse.
- Mus Endometrie epitelcelle (MEEC) Kultur
- Efter 2 timers inkubation hældes forsigtigt væk supernatantopløsningen.
- Overfør uteri i en petriskål indeholdende koldt MEEC medium og inkuberes i 5 min for at inaktivere trypsinaktivitet.
- Overfør uteri til et 15 ml rør indeholdende 3 ml kold HBSS +.
- Vortex i 10 s at frigive epitel ark.
- Skyl uteri i en ren petriskål med 3 ml HBSS +.
- Gentag trin 4.3.2 - 4.3.4 til opnåelse af i alt tre suspensioner indeholdende epitelbaner.
- Overfør uteri til Mesc fordøjelse blandes og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C under omrystning (200 rpm) (gå til trin 4.4 for yderligere isolation af Mesc).
- Inddrive de epitelbaner ved pipettering de tre cellesuspensioner forsigtigt på en 100 um nylonnet for at fjerne vævsrester.
- Centrifugeres indsamlede cellesuspension ved 500 xg i 5 min.
- Pellet resuspenderes i 12 ml MEEC medium og bland godt.
- Settle løsningen i 5 min for at adskille resterende Mesc hjælp af tyngdekraften sedimentering.
- Fjern forsigtigt de øverste 2 ml ved hjælp af en 5 ml pipette.
- Centrifugeres cellen suspension ved 500 xg i 5 min.
- Resuspender i MEEC medium ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Plate cellerne på collagen-coatede dækglas i den ønskede densitet til yderligere forsøg (figur 2A).
- Inkuber cellerne ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i minimum 12 timer.
BEMÆRK: immunfarvning eller funktionelle eksperimenter som fluorescerende calcium imaging, anbefales det til pladen cellerne direkte på dækglassene, mens anbefales podning i en 6-brønds plade, når der ønskes RNA eller protein isolation. Isolering af muse endometriske stromale celler er opdelt i to runder som renheden af cellerne efter kun én spaltning kan være utilstrækkelig. Livmoderne fordøjet to gange for en optimal celle rekreation og renhed. I begge runder de tekniske indgreb er identiske. Celler indsamlet fra begge runder kan opbevares i yderligere eksperimenter, som ønsket af forskeren.
- Mus Endometrie Stromal Cell (Mesc) Kultur: 1. Runde
- Før starten af den første fordøjelse runde, forberede en anden fordøjelse blanding ved opløsning 300 pi af 1 mg / ml collagenase stamopløsning i 2,7 ml 0,05% trypsin-EDTA-opløsning. Denne blanding er nødvendig i trin 4.4.8.
- Forbered tre små petriskåle med kold (4 ° C) HBSS + og 3 x 15 ml rør med 3 ml Mesc medium (rør X1, X2 og X3).
- Efter 30 minutters inkubation, ryste uteri-holdige trypsinopløsning forsigtigt i 10 s. Mesc celler vil løsne sig fra livmodervæv og vil forblive i trypsin opløsning.
- Overfør uteri til den første petriskål indeholdende 3 ml kold (4 ° C) HBSS + og skylles godt.
- Tilsættes 3 ml Mesc medium til røret oprindeligt indeholdt livmoderhornene (rør i trin 4.4.3) til at inhibere trypsin-aktivitet.
- Overfør uteri fra petriskålen med kold (4 ° C) HBSS + til rør X1 indeholdende 3 ml Mesc medium og rystes forsigtigt i 10 s. Gentag trin 4.4.4 (overførsel til en petriskål med kold (4 ° C) HBSS +) og 4.4.6 (overførsel til rør X2 og X3) to gange.
BEMÆRK: Endelig vil denne protokol resultere i 4 cellesuspensioner: et rør indeholdende trypsin-opløsning og 3 rør med Mesc medium indeholdende Mesc (rør X1, X2 og X3). - Overfør uteri i den nye Mesc fordøjelse, som beskrevet i trin 4.4.1 og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, lodret.
- Indsamle stromacellerne ved at passere de fire cellesuspensioner gennem en 40 um nylon mesh. Skyl masken med yderligere 5 ml af Mesc.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 500 xg i 7 min.
- Pellet resuspenderes i Mesc og plade på PLL-belagte dækglas for yderligere forsøg med den ønskede tæthed.
- Inkuber i mindst 4 - 6 h eller O / N ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Mus Endometrie stromacelle (Mesc) Kultur: 2. Runde <ol>
- Forbered tre små petriskåle med kold (4 ° C) HBSS + og 3 x 15 ml rør med 3 ml Mesc medium (Tubes Y1, Y2 og Y3).
- Gentag trin 4.4.3 - 4.4.7.
- Overfør den sidste celle væske med uteri til en 40 um nylon mesh.
- Indsamle stromacellerne ved at føre indholdet af røret Y1, Y2 og Y3 gennem nylonnet. Skyl masken med yderligere 5 ml af Mesc.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 500 xg i 7 min.
- Pellet resuspenderes i Mesc medium og plade på PLL-overtrukne dækglas til yderligere eksperimenter (figur 2B).
- Inkuber i mindst 4 - 6 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
BEMÆRK: immunfarvning eller funktionelle eksperimenter som fluorescerende calcium imaging, anbefales det til pladen cellerne på dækglas, mens podning i en 6-brønds plade anbefales, når der ønskes RNA eller protein isolation.
5. Vimentin/ Cytokeratin Dobbelt Farvning for Validering af Pure MEEC og Mesc kulturer
- Frø cellerne på dækglas.
- Vask 3 x 5 min med PBS indeholdende calcium og magnesium på en orbitalryster (50 rpm).
- Fikseres cellerne med 4% paraformaldehyd (PFA) (ADVARSEL!) I 10 minutter, ikke på rysteapparat.
- Vask 3 x med PBS uden calcium og magnesium på rysteapparat (50 rpm).
- Permeabilisere cellerne med 0,2% Triton X-100 i 10 minutter på et rysteapparat (50 rpm).
- Vask 3 x med PBS på en ryster.
- Blok med 5% gedeserum (GS) i PBS i 2 timer på en ryster (50 rpm)
- Cellerne inkuberes med monoklonalt kanin-anti-humant vimentin (1: 500) og monoklonalt muse-anti-humant pancytokeratin (1: 1.000) ved 4 ° C på en ryster (50 rpm). Antistoffer fortyndes i PBS med 0,5% GS.
- Vask 3 x med PBS på en ryster (50 rpm).
- Cellerne inkuberes med sekundære antistoffer (1: 1.000 i 0,5% GS) Alexa Fluor 488-konjugeret anti-kanin IgG og Alexa Fluor 488-conjugated anti-muse-IgG på en ryster.
- Vask 3 x med PBS på en ryster.
- Mount glider med vandigt monteringsmedium indeholdende DAPI og tør O / N.
- Forsegl dias med neglelak og holde på 4 ° C til videre brug (figur 2a, b).
6. In vitro decidualisering i en cokultur System
BEMÆRK: Der kræves Fire til fem dyr at etablere en cokultur system på en plade med 24 brønde. Fortsæt med følgende protokol i et sterilt miljø, helst under en laminar strømning kabinet.
- Forbered cellekultur skær under centrifugeringen og / eller inkubationstrin af epitelcelle isolering (som beskrevet i 4.3) i en yderligere 24-brønds plade.
- Tilsæt 200 - 400 pi Mesc medium til den ønskede mængde af brønde i 24-brønds plade.
- Placer indsatser i de fyldte 24-brønde med steril pincet.
- Resuspender MEEC pellet(Trin 4.3.14) i MEEC medium og dividere over indsatser (arbejdsvolumen: 150 - 300 uL per indsats). Dyrke cellerne ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Seed stromacellerne i en anden 24-brønds plade (kompatibel med cellekultur indsætter) efter den anden runde af stromal celle isolation (trin 4.5.6). Brug en arbejdsvolumen på 400 pi cellesuspension pr brønd.
- Tillad stromacellerne at binde i minimum 4 - 6 timer ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Overfør cellekultur skær dækket med epitelceller fra den første plade med 24 brønde i den anden plade med 24 brønde dækket af stromaceller. Brug steriliserede pincet eller røre indsatser kun på deres hængende fod.
- Dyrke cellerne ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator i en periode af 3 - 5 d, indtil de epiteliale celler danner et monolag og stromacellerne opnå 80 - 90% sammenflydning. Derudover bruge transepitelialt elektrisk modstand (TEER)at overvåge epitel monolag ved anvendelse af en Volt / Ohm epitel meter som beskrevet af Grant et al. 7. Værdier på 800-1.000 / brønd var tilstrækkelige til at overveje epitelial monolag sammenflydende.
- Udskift om nødvendigt mediet hver 2 - 3 i d hjælp af glas pipetter eller fine pipettespidser. Start med erstatning af mediet af stromacellerne (podet ved bunden), før udskiftning af mediet i indsatserne. Det anbefales at anvende forvarmet celledyrkningsmedium ved 37 ° C.
- Forbered decidualisering medium til at fremkalde in vitro decidualisering før du starter eksperimentet. Brug en arbejdsvolumen på 400 pi pr brønd af stromaceller.
- Forbered følgende stamopløsninger og gemme portioner ved -20 ° C.
- Forbered 250 pM medroxyprogesteron 17-acetat (MPA) i ethanol.
- Forbered 100 mM stamopløsning 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-cAMP i ultrarent vand.
- Gøre decidua medium indeholdende 1 uM MPA og 0,5 mM cAMP i Mesc medium indeholdende 2% FBS.
- Forbered følgende stamopløsninger og gemme portioner ved -20 ° C.
- Fjern forsigtigt mediet fra brøndene og tilsæt decidua medium på stromacellerne. Hvis der er behov en kontrol tilstand, skal du bruge Mesc medium, der indeholder 2% FBS.
- Fjern mediet fra cellekulturen skær og tilsæt 300 pi MEEC medium på cellerne.
- Inkubér cellerne i 5 d i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO2.
- Efter den femte dag, vurdere omfanget af decidualisering i stromale celler ved RT-qPCR (se nedenfor).
- Godkend levedygtighed epiteliale celler ved anvendelse af Resazurin-baserede levedygtighed reagens.
- Forbered en 1:10 opløsning af levedygtighed reagens i MEEC medium.
- Overfør cellekultur indsatserne i en ny 24-brønds plade.
- Tilføj 150 - 300 pi levedygtigheden reagens - MEEC opløsning på cellerne.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 imindst 4 - 5 h eller natten over og vurdere cellelevedygtighed ved at observere en farveændring (blå til lilla / pink).
BEMÆRK: decidualisering kan også vurderes ved hjælp af en mus prolactin-specifik ELISA, som foretrækkes af forskeren.
7.Validation af decidualisering ved QRT-PCR
BEMÆRK: validering af decidualisering ved QRT-PCR, anbefales det at udføre alle test-forhold i to eksemplarer for at modtage en tilstrækkelig mængde af celler til RNA-analyse.
Kvantitativ RT-PCR udføres som tidligere beskrevet i De Clercq et al. 8.
Kort om:
- Isoler det totale RNA under anvendelse af et kommercielt RNA-isolering kit.
- Vurdere mængden og kvaliteten af RNA ved hjælp af kommercielle metoder i henhold til producentens protokol, hhv.
- Syntetisere cDNA ifølge producentens protokol starter fra 1 ug totalt RNA.
- Brug et kommercielt kit ifølge producentens protokol til at udføre QRT-PCR-reaktionen.
- Kør alle prøver i tre eksemplarer.
- Gøre brug af det kommercielle TaqMan Master Mix og specifikke TaqMan prober for de ønskede housekeeping-gener og prolactin (prl8a2) for at udføre reaktionen.
Representative Results
Generel oversigt i protokol
Figur 1A viser en generel oversigt over protokollen. En daglig injektion af E2 (100 ng) i tre på hinanden følgende dage blev anvendt til at synkronisere dyrene og standardisere fasen af østrus cyklus. Den østrale cyklus kan vurderes ved vaginale udskylninger og er opdelt i proøstrus, østrus, diøstrus, og metestrus fase. Cyklussen fase kan defineres ud fra forholdet mellem afskallede celler i udskylning, som underkastes hormonale ændringer. Stigende niveauer af østrogen vil gøre dyrene udvikle sig til østrus fase. Denne fase kan let detekteres ved tilstedeværelsen af udelukkende forhornede epitelceller, og fraværet af leukocytter (figur 1B). På dag 4 er uteri af dyr, der er i brunst fase indsamles og MEEC og Mesc er isolerede (Figur 1C). decidualisering cen induceres ved tilsætning af 0,5 mM cAMP og 1 uM MPA til 2% FBS-medium under en inkubationsperiode på 5 d.
Kvalitetskontrol af MEEC og Mesc kulturer
Renheden af de primære cellekulturer kan vurderes ved forskellen i vimentin og cytokeratin udtryk. Vimentin er en mellemliggende filament, som udtrykkes i mesenchymale celler, og derfor i de endometriske stromale celler. Cytokeratin er et mellemprodukt filament fundet i cytoskelettet af epitelvæv. Figur 2A viser mRNA-ekspression niveau af vimentin og cytokeratin i MEEC og Mesc bedømmes under anvendelse QRT-PCR. Vimentin niveauer er høje i Mesc og lav i MEEC (2.2x højere, p <0,001), mens cytokeratin niveauer er høje i MEEC og lav i Mesc (36x højere, p <0,001). En vimentin / cytokeratin dobbelt farvning blev udført, og indikerede, at stromale celler udtrykker vimentin hvorimod epithelial celler udtrykker cytokeratin (figur 2B, C). Fraværet af primært antistof blev anvendt som en negativ kontrol for immunfarvning (figur 2D, E). Disse immunologiske farvninger viser, at både endometriske cellekulturer (MEEC og Mesc) har en renhed på op til 90%.
Decidualisering i MEEC / Mesc Cokulturer
Efter isolering blev muse endometriske og stromaceller podes i et co-kultursystem at efterligne den endometriske miljø. Celler blev dyrket indtil epitelcellerne dannede et monolag i celledyrkningsinsert (TEER-værdier på 800 - 1.000 / brønd), og stromacellerne nået en sub-sammenflydende tilstand. Decidualisering blev induceret i stromacellerne med anvendelse af 0,5 mM cAMP og 1 uM MPA. Efter fem dages inkubation blev prolactin mRNA-niveauer vurderes i de stromale celler ved QRT-PCR som en indikation for decidualization (figur 3A). Prolaktinniveauer højt udtrykt i celler udsat for hormonerne og nondetectable i celler inkuberet med kontrolmediet (p <0,01).
Da epitelceller er svære at visualisere inde i cellekultur skær blev en levedygtighed assay udføres umiddelbart efter fem dages inkubationstid (figur 3B). En blanding af normalt vækstmedium og en levedygtighed reagens blev tilsat til brøndene og inkuberet i en periode på minimal 8 - 12 timer. Farveskiftet fra blå til lys rosa indikerede tilstedeværelsen af levedygtige epithelceller. Bemærk, at farveskiftet kun vil forekomme, når levedygtige celler til stede.
Figur 1: Generel oversigt af protokollen. (A) Ordning af isolation protokol starter med trehinanden følgende dage med østrogen injektioner. På dag 3, bør de nødvendige forberedelser være forberedt. På dag 4 er østrus fase evalueres (angivet med stjerne) ved at udføre en vaginal udskylning. Mesc og MEEC isoleres ved hjælp af forskellige fordøjelse trin. På dag 6 eller når cellerne er sammenflydende, decidualisering kan induceres i co-dyrkningssystemet ved tilsætning cAMP og MPA til mediet og en inkubationsperiode på fem dage (dag 6 - 11). (B) repræsentativt billede af østrus fase er karakteriseret ved tilstedeværelsen af forhornede epitelceller i den vaginale udskylning (forstørrelse 10X). (C) Repræsentant billede af Mesc og MEEC (forstørrelse 20X, skala bar: 100 pm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Validering af decidualisering via RT-PCR. (A) mRNA-niveauer af prolaktin ekspression i stromaceller at evaluere decidualisering. RNA-niveauer blev relativt kvantificeret til det geometriske gennemsnit af housekeeping-gener PGK1 og TBP. Den gange ændring i celler dyrket i kontrol- eller decidua medium er vist som middelværdi ± SEM. (B) Illustrative billeder af stromaceller før (øverst) og efter (nederst) decidualisering stimulus. Indsatsen til højre illustrerer en forstørrelse af en decidualized stromal celle. Decidualisering er kendetegnet ved tilstedeværelsen af flerkernede celler, indikeret ved sorte pile. (C) Repræsentative billeder af vurderingen af epitelial cellelevedygtighed i indsatsen efter assayet. Billeder blev taget umiddelbart efter indgivelsen af levedygtigheden reagens (Prestoblue) (0 h) og following morgen (ON). **: P <0,01 med Mann-Whitney U test. ON: overnight. Scale bar: 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Decidualisering er progesteron-afhængige differentiering af endometriske stromale celler i runde secernerer moderhindeceller. I humant, denne proces sker spontant under den luteale fase af menstruationscyklen og indledes i stromacellerne omgiver vaskulære celler til dannelse af predecidua. Men hos gnavere, tilstedeværelsen af en blastocyst er bydende nødvendigt at inducere decidualisering. Den omstændighed, at decidualisering kun forekommer efter kontakt med de endometriske epitelceller indebærer, at vigtige faktorer udskilles af epitelceller til at inducere decidualisering i det underliggende stroma. Selvom bør anerkendes denne forskel i indledningen af decidualisering proces, det faktum, at menneskets decidualisering bliver mere robust ved embryo implantation tyder på, at lignende mekanismer kan være involveret. In vitro-cellekulturer anvendes ofte til at undersøge virkningen af specifikke molekyler under processen med decidualisering.Ikke desto mindre er tilgængeligheden og mængden af humant væv, der kan indsamles ofte begrænset og ledsaget af variationer, f.eks cyklus fase, antal graviditeter og tilstedeværelse af gynækologiske sygdomme som endometriose eller adenomyose. Mange af disse problemer kan undgås ved anvendelse af murine væv, der er let tilgængelig og cyklus fase uafhængig. En anden stor fordel ved at anvende murine væv er mulighed for at benytte genetisk modificerede gnavere og muligheden for at opsætte et stort antal forsøg. I øjeblikket har mange forskellige isolation protokoller blevet beskrevet i litteraturen med høj variation i dyrenes alder og den periode i brunst fase på tidspunktet for brug.
Denne undersøgelse præsenterer en ny fremgangsmåde til primære endometriske co-kulturer af stromale og epiteliale celler, hvori fordel blev taget af en standardiseret østrale cyklus ved en daglig injektion af østrogen forudgående isolation. Endvidere østrogen er known at inducere proliferation i epitel og stromaceller som yderligere forøger udbyttet pr isolation. Den i dette dokument isolation protokol blev baseret på Grant et al. 7 imidlertid yderligere optimering trin blev inkluderet for at forøge udbyttet, renhed og levedygtighed forskellige cellekulturer. Først HBSS blev altid suppleret med antibiotika for at undgå forurening af den primære kultur. Under isoleringen af MEEC blev en temperatur tilpasning gjort (15 minutter ved 37 ° C) for at øge høst af epitelcellerne i første fordøjelse. Dernæst blev et yderligere trin inkluderes for at temperere enzymatisk aktivitet efter trypsin-fordøjelse ved tilsætning medium indeholdende FBS at inhibere dets aktivitet. Endvidere blev MEECs ledt gennem et filter af, at maskerne var større end hvad der er almindeligt beskrevet (100 um), da de ofte kommer i klynger og cellelag. Endvidere forurening med stromaceller blev reduceret ved at udføre en addovergangsprocedurer trin, hvor MEECs og MESCs blev adskilt baseret på tyngdekraften sedimentering. Endelig blev MEECs podet på collagen-coatede dækglas at øge vedhæftning af celler til dækglas, da det blev klart, at tilknytning til ikke-coatede eller PLL-coatede dækglas var utilstrækkelig. Under isoleringen af MESCs blev collagenase (1 mg / ml) suppleret at forbedre fordøjelsen. Desuden blev denne fordøjelse trin udført i to eksemplarer for at undgå forurening af de resterende MEECs. Alle disse yderligere trin resulterede i rene og levedygtige kulturer af homogene cellepopulationer.
Renheden af cellepopulationen blev evalueret med immunofarvning og QRT-PCR under anvendelse af vimentin som stromal markør og cytokeratin som epithelial markør. Det er klart, blev en modsat ekspressionsmønster af vimentin og cytokeratin observeret i MEEC og Mesc. Dog kan det bemærkes, at den relative mRNA-ekspression af vimentin og cytokeratin er ens i de MEEC kulturer. Similar resultater offentliggøres af andre forskergrupper, hvor epitelceller i kultur erhverve vimentin udtryk 9. Vigtigere er forskellen i proteinekspression mellem vimentin og cytokeratin som blev observeret i de immunologiske farvninger af de forskellige cellepopulationer. Dobbelt immunfarvning viste, at EECS var positive for cytokeratin og ESC var positive for vimentin. Brugen af disse markører i immunfarvning er en etableret metode og standardmæssigt anvendes til at indikere celletyper 10.
Selv om en masse forskning er blevet udført på decidualisering af Mesc, forbliver det muligt, at tilstedeværelsen af epitelceller i denne model kan ændre resultaterne af decidualisering. For det første er det blevet vist, at hvis MEEC vokse til et monolag i nærværelse af Mesc-konditioneret medium eller i et co-kultur indstilling, monolaget har en forbedret epitelcelle transepithelial elektrisk modstand (TEER), som følge af faktorer, der udskilles af Mesc 7. Desuden Pierro et al. 11 dokumenteret, at epitelproliferation, påvirket af 17β-estradiol, kan være medieret af faktorer der udskilles fra stromacellerne, og alternativt kan epitelceller frigive faktorer, der modulerer stromal decidualisering 12, 13. Samlet set er det klart, at epitelial-stromale co-kultur miljø giver en mere fysiologisk situation, der giver mulighed for parakrin interaktion og kommunikation. Fremgangsmåden til dyrkning af to forskellige celletyper under anvendelse af et insert co-dyrkningssystem blev beskrevet tidligere 14, 15 og er tilpasset til anvendelse af murine primære celler. Ved påvisning af prolactin mRNA niveauer som en udlæsning for decidualisering, den beskrevne teknik har en meget reproducerbar udlæsning for decidualisering rådighed og tillades derved studiet af epitel-stromale forhold under decidualisering. Parakrine signaler medieret fra MEEC kan ændre omfanget af decidualisering i stromacellerne. Desuden model giver mulighed for specifik modulation af epitelial side uden direkte at påvirke stromale celler. Derfor er denne co-kultur af MEEC og Mesc tilbyder en perfekt værktøj til at vurdere effekten af hormoner, cytokiner, etc. på epitelceller med et udlæsning på stromal decidualisering. En anden fordel ved denne co-kultursystem er at det giver forskere at undersøge involveringen af et specifikt protein i decidualisering-processen i enten epitel- eller stromale rum ved hjælp af celler isoleret fra transgene dyr. Endvidere vil denne teknik være meget nyttigt at undersøge blastocyst adhæsion at evaluere, om parakrine faktorer der udskilles af epitelceller i nærvær af en blastocyst er tilstrækkelige til at inducere decidualisering af den underliggende stromaleceller. Et vigtigt skridt i trofoblasten invasion korreleret til ekstracellulær matrix-nedbrydning, som medieres ved indvirkning af proteolytiske enzymer. Den foreslåede teknik kan anvendes som en in vitro model til at undersøge krydstale blandt blastocyst, epitelcellerne og den understøttende stroma.
Men i øjeblikket kun lidt om oprindelsen af de epitelceller, som kan være såvel luminale som glandulær. Derfor er yderligere karakterisering af den genetiske og molekylære profil epitelcellerne påkrævet. Desuden er den beskrevne fremgangsmåde begrænset i den tilgængelige viden om polarisationen af epitelcellerne. I øjeblikket blev polarisationen af epitelceller ikke taget i betragtning. Imidlertid er forskelle i ekspression af membranproteiner er beskrevet i apikale og basale membraner. Uhensigtsmæssig polarisering af epitel lag kunne have en indvirkning på den parakrin samspil mellem epithelial og stromaceller. Men fremgangsmåder opnå polariserede epitelceller er blevet beskrevet og kan indgå i den beskrevne teknik 15, 16.
Alt i alt er den beskrevne protokol foreslår en teknik til at kunne etablere primære cellekulturer af muse endometrial epitel- og stromaceller. Denne teknik resulterer i rene cellekulturer som bekræftet ved QRT-PCR og immunfarvning af vimentin og cytokeratin. I sidste ende blev en epitelial og stromal co-kultur indført, der giver mulighed for undersøgelse af parakrine signaler medieret af enten MEEC og / eller Mesc i decidualisering processen.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Grundforskningsfonden-Flandern (FWO G.0856.13N) og forskningsrådet for KU Leuven (OT / 13/113). KDC er finansieret af FWO Belgien. AH er finansieret af OT / 13/113. Vi vil gerne takke Cell Imaging Core facilitet i KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) til brug for den konfokal mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant | Greiner Bio-one | 662610 | Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/ |
| Nunc Cell culture treated 24 well plates | Thermo Scientific | 142475 | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475 |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma Aldrich | B7880 | Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma Aldrich | M1629 | Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE |
| Arachis oil | Supermarket | Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Thermo Scientific | A13261 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 |
| HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175-046 | Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 |
| 17-β Estradiol | Sigma Aldrich | E8875 | Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en®ion=BE |
| Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized | Merck Millipore | SCGPU05RE | http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063 |
| DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES | Gibco | 11330-032 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057 |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | Gibco | 10500-056 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064 |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018 |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750-037 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Sigma Aldrich | D5921 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE |
| MCDB-105 | Sigma Aldrich | M6395 | Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I1882 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE |
| Coverslips, glass, 18 mm Ø | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 1001/18 | http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE |
| Collagenase type IA from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C2674 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-094 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | T7409 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352340 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
| Cell strainer, 100 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352360 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 |
| Acetic acid (glacial) 100% | Merck Millipore | 1.00063 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063 |
| Collagen I | Corning | 354236 | From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29# |
| Pancreatin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | P3292 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE |
| 35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | BD Falcon | 353001 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630 |
| Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent | VWR Chemicals | 20821296 | https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP |
| monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3) | Cell Signalling Tech | #5741 | Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 |
| monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin | Sigma Aldrich | C2562 | Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en®ion=BE |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix | 19943 | http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11034 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;; |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 594 | Thermo Scientific | A-11032 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;; |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html |
| DPBS, with calcium and magnesium | Gibco | 14040174 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 |
References
- Cummings, A. M., Yochim, J. M. Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone. J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).
- Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
- Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).
- Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).
- Power, M. L., Schulkin, J. The evolution of the human placenta. , Johns Hopkins University Press. (2012).
- Finn, C. A. The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse. J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).
- Grant, K. S., Wira, C. R. Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture. Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).
- De Clercq, K., et al. Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle. Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).
- Pieper, F. R., et al. Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells. Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Pierro, E., et al. Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium. Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).
- Kim, M. R., et al. Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells. Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).
- Chen, J. C., et al. Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production. Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. J Vis Exp. (113), (2016).
- Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model. Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).
- Park, D. W., et al. A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion. Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).
