Denne undersøgelse viser en standardiseret og valideret metode til isolering og dyrkning af primært muse endometrisk stromale og epiteliale celler, som kan anvendes i en cokultur til undersøgelse in vitro decidualisering.
Decidualisering er en progesteron-afhængig differentiering proces med endometriske stromale celler og er en forudsætning for en vellykket embryo implantation. Selvom der er gjort mange forsøg på at afsløre de underliggende mekanismer decidualisering forbliver nøjagtige signalering mellem epithelcellerne, der er i kontakt med embryoner og de underliggende stromaceller dårligt forstået. Derfor studerede decidualisering på en måde, der tager både epitel- og stromaceller i betragtning kunne forbedre vores viden om de molekylære detaljer decidualisering. Til dette formål in vivo modeller af kunstig decidualisering er fysiologisk de mest relevante; dog manipulation af intercellulære kommunikation er begrænset. Øjeblikket, in vitro kulturer af endometriske stromale celler bliver brugt til at undersøge modulering af decidualisering af flere signalmolekyler. Konventionelt humane eller muse endometriske stromale celler erBrugt. Imidlertid er tilgængeligheden af humane prøver meget ofte begrænset. Endvidere er anvendelsen af murine væv ledsaget med sort i fremgangsmåden til dyrkning. Denne undersøgelse præsenterer en valideret og standardiseret metode til at opnå ren Endometrie epitelcelle (EØF) og stromacelle- (ESC) kulturer ved hjælp af voksne intakte mus behandlet med østrogen i tre på hinanden følgende dage. Protokollen er optimeret til at forbedre udbyttet, levedygtighed, og renhed af cellerne og blev yderligere udvidet med henblik på at studere decidualisering i en cokultur af EØF og ESC. Denne model kan være egnet til at udnytte betydningen af begge celletyper i decidualisering og at vurdere bidraget af betydelige signalmolekyler udskilt af EØF eller ESC under intercellulær kommunikation.
Den menneskelige endometrium er den indvendige foring af livmoderen og undergår månedlige cyklusser af nedbrydning og reparation som en forberedelse til mulige graviditeter. Den består af et enkelt lag af epitelceller, der beklæder livmoderen lumen og den underliggende stroma, der varierer i tykkelse ifølge udsving i æggestokkene hormoner østrogen og progesteron. Under lutealfasen, vil postovulatory progesteron bølge inducerer differentiering af endometriske stromale celler i større, runde moderhindeceller, en proces kaldet decidualisering 1, 2. I humant, dette fænomen forekommer spontant at danne predecidua, men bliver mere udtalt ved embryo implantation. En funktionel konsekvens af decidualisering er, at livmoderen forbigående bliver modtagelige for embryo implantation. Dette interval er mærket som "vindue for implantation«. I den tidlige periode af embryo implantation, den decidualized endometrial stromaceller omgiver implantere embryo vil tilvejebringe en barriere for at forhindre passage af skadelige stoffer til embryo 3. Under graviditet, vil denne decidua tilvejebringe næringsstoffer til det udviklende foster før placentation har fundet sted, og vil senere danne maternelle del af moderkagen 4.
Etiske og praktiske overvejelser begrænser udformningen af humane undersøgelser for at undersøge processen med decidualisering og har bedt brugen af dyremodeller. At være medlem af den hemochorial placentation gruppen, vil endometriet af gnavere også gennemgå decidualisering før placentation 5. Hos gnavere imidlertid indledningen af decidualisering proces afhænger af tilstedeværelsen af blastocyster i uterine lumen, hvilket indikerer, at en ekstra stimulus er nødvendig for at udløse decidua responser 6. Dette indebærer en indviklet kommunikation mellem the endometriske epitelceller, der har direkte kontakt med blastocyst, og de underliggende stromaceller. Ikke desto mindre kan decidualisering kunstigt induceret ved hjælp stimuli som mekanisk ridser eller instillation af olie i en hormonalt primet livmoder. Selvom in vivo undersøgelser med anvendelse af kunstige decidualisering modeller har givet os mulighed for at forbedre vores indsigt i den komplekse signalering processen med decidualisering, mekanistiske fordybelse, f.eks undersøgelse af den uundværlige kommunikation mellem epitel og stromaceller, er begrænsede. Derfor kan in vitro decidualisering undersøgelser bruges til at manipulere vigtige veje og studere grundlæggende processer. Til dette formål kan primære endometriske stromale cellekulturer oprettes fra human eller gnaver endometriet. Anvender gnavere samtykker anvendelse af genetisk modificerede dyr for at undersøge rollen af et specifikt protein af interesse under decidualisering processen. Imidlertid umodne, prepuberty mus anvendes ofte for at undgå komplikationer af østrale cyklus, mens i andre tilfælde uteri indsamles fra alle faser af østrale cyklus, hvilket resulterer i en uensartethed i kulturerne. Desuden er processen med decidualisering blevet undersøgt i forskellige protokoller, f.eks, ved (i) supplering hormoner (østrogen, progesteron eller cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP)) til dyrkningsmediet, eller ved (ii) isolering af moderhindeceller fra mus ved dag 4,5 af (pseudo) graviditet, hvor efterspørgslen yderligere behov for plug kontrol og vasektomerede hanner. Disse begrænsninger påvise nødvendigheden af en standardiseret metode til at studere in vitro decidualisering. I denne undersøgelse til en fysiologisk model undersøge in vitro decidualisering startende fra voksne, vil ikke (pseudo) drægtige mus præsenteres. Ved denne fremgangsmåde vil daglig injektion af 17β-østradiol (E2) inducerer proliferation af endometriale celler, hvilket resulterer i et forøget udbytte af homogen og pure cellepopulationer. Endvidere er anvendelsen af et co-dyrkning system tillader studiet af epitel-stromale krydstale og evnen til at manipulere processen med decidualisering på forskellige niveauer.
Decidualisering er progesteron-afhængige differentiering af endometriske stromale celler i runde secernerer moderhindeceller. I humant, denne proces sker spontant under den luteale fase af menstruationscyklen og indledes i stromacellerne omgiver vaskulære celler til dannelse af predecidua. Men hos gnavere, tilstedeværelsen af en blastocyst er bydende nødvendigt at inducere decidualisering. Den omstændighed, at decidualisering kun forekommer efter kontakt med de endometriske epitelceller indebærer, at vigtige faktorer udskilles af epitelceller til at inducere decidualisering i det underliggende stroma. Selvom bør anerkendes denne forskel i indledningen af decidualisering proces, det faktum, at menneskets decidualisering bliver mere robust ved embryo implantation tyder på, at lignende mekanismer kan være involveret. In vitro-cellekulturer anvendes ofte til at undersøge virkningen af specifikke molekyler under processen med decidualisering.Ikke desto mindre er tilgængeligheden og mængden af humant væv, der kan indsamles ofte begrænset og ledsaget af variationer, f.eks cyklus fase, antal graviditeter og tilstedeværelse af gynækologiske sygdomme som endometriose eller adenomyose. Mange af disse problemer kan undgås ved anvendelse af murine væv, der er let tilgængelig og cyklus fase uafhængig. En anden stor fordel ved at anvende murine væv er mulighed for at benytte genetisk modificerede gnavere og muligheden for at opsætte et stort antal forsøg. I øjeblikket har mange forskellige isolation protokoller blevet beskrevet i litteraturen med høj variation i dyrenes alder og den periode i brunst fase på tidspunktet for brug.
Denne undersøgelse præsenterer en ny fremgangsmåde til primære endometriske co-kulturer af stromale og epiteliale celler, hvori fordel blev taget af en standardiseret østrale cyklus ved en daglig injektion af østrogen forudgående isolation. Endvidere østrogen er known at inducere proliferation i epitel og stromaceller som yderligere forøger udbyttet pr isolation. Den i dette dokument isolation protokol blev baseret på Grant et al. 7 imidlertid yderligere optimering trin blev inkluderet for at forøge udbyttet, renhed og levedygtighed forskellige cellekulturer. Først HBSS blev altid suppleret med antibiotika for at undgå forurening af den primære kultur. Under isoleringen af MEEC blev en temperatur tilpasning gjort (15 minutter ved 37 ° C) for at øge høst af epitelcellerne i første fordøjelse. Dernæst blev et yderligere trin inkluderes for at temperere enzymatisk aktivitet efter trypsin-fordøjelse ved tilsætning medium indeholdende FBS at inhibere dets aktivitet. Endvidere blev MEECs ledt gennem et filter af, at maskerne var større end hvad der er almindeligt beskrevet (100 um), da de ofte kommer i klynger og cellelag. Endvidere forurening med stromaceller blev reduceret ved at udføre en addovergangsprocedurer trin, hvor MEECs og MESCs blev adskilt baseret på tyngdekraften sedimentering. Endelig blev MEECs podet på collagen-coatede dækglas at øge vedhæftning af celler til dækglas, da det blev klart, at tilknytning til ikke-coatede eller PLL-coatede dækglas var utilstrækkelig. Under isoleringen af MESCs blev collagenase (1 mg / ml) suppleret at forbedre fordøjelsen. Desuden blev denne fordøjelse trin udført i to eksemplarer for at undgå forurening af de resterende MEECs. Alle disse yderligere trin resulterede i rene og levedygtige kulturer af homogene cellepopulationer.
Renheden af cellepopulationen blev evalueret med immunofarvning og QRT-PCR under anvendelse af vimentin som stromal markør og cytokeratin som epithelial markør. Det er klart, blev en modsat ekspressionsmønster af vimentin og cytokeratin observeret i MEEC og Mesc. Dog kan det bemærkes, at den relative mRNA-ekspression af vimentin og cytokeratin er ens i de MEEC kulturer. Similar resultater offentliggøres af andre forskergrupper, hvor epitelceller i kultur erhverve vimentin udtryk 9. Vigtigere er forskellen i proteinekspression mellem vimentin og cytokeratin som blev observeret i de immunologiske farvninger af de forskellige cellepopulationer. Dobbelt immunfarvning viste, at EECS var positive for cytokeratin og ESC var positive for vimentin. Brugen af disse markører i immunfarvning er en etableret metode og standardmæssigt anvendes til at indikere celletyper 10.
Selv om en masse forskning er blevet udført på decidualisering af Mesc, forbliver det muligt, at tilstedeværelsen af epitelceller i denne model kan ændre resultaterne af decidualisering. For det første er det blevet vist, at hvis MEEC vokse til et monolag i nærværelse af Mesc-konditioneret medium eller i et co-kultur indstilling, monolaget har en forbedret epitelcelle transepithelial elektrisk modstand (TEER), som følge af faktorer, der udskilles af Mesc 7. Desuden Pierro et al. 11 dokumenteret, at epitelproliferation, påvirket af 17β-estradiol, kan være medieret af faktorer der udskilles fra stromacellerne, og alternativt kan epitelceller frigive faktorer, der modulerer stromal decidualisering 12, 13. Samlet set er det klart, at epitelial-stromale co-kultur miljø giver en mere fysiologisk situation, der giver mulighed for parakrin interaktion og kommunikation. Fremgangsmåden til dyrkning af to forskellige celletyper under anvendelse af et insert co-dyrkningssystem blev beskrevet tidligere 14, 15 og er tilpasset til anvendelse af murine primære celler. Ved påvisning af prolactin mRNA niveauer som en udlæsning for decidualisering, den beskrevne teknik har en meget reproducerbar udlæsning for decidualisering rådighed og tillades derved studiet af epitel-stromale forhold under decidualisering. Parakrine signaler medieret fra MEEC kan ændre omfanget af decidualisering i stromacellerne. Desuden model giver mulighed for specifik modulation af epitelial side uden direkte at påvirke stromale celler. Derfor er denne co-kultur af MEEC og Mesc tilbyder en perfekt værktøj til at vurdere effekten af hormoner, cytokiner, etc. på epitelceller med et udlæsning på stromal decidualisering. En anden fordel ved denne co-kultursystem er at det giver forskere at undersøge involveringen af et specifikt protein i decidualisering-processen i enten epitel- eller stromale rum ved hjælp af celler isoleret fra transgene dyr. Endvidere vil denne teknik være meget nyttigt at undersøge blastocyst adhæsion at evaluere, om parakrine faktorer der udskilles af epitelceller i nærvær af en blastocyst er tilstrækkelige til at inducere decidualisering af den underliggende stromaleceller. Et vigtigt skridt i trofoblasten invasion korreleret til ekstracellulær matrix-nedbrydning, som medieres ved indvirkning af proteolytiske enzymer. Den foreslåede teknik kan anvendes som en in vitro model til at undersøge krydstale blandt blastocyst, epitelcellerne og den understøttende stroma.
Men i øjeblikket kun lidt om oprindelsen af de epitelceller, som kan være såvel luminale som glandulær. Derfor er yderligere karakterisering af den genetiske og molekylære profil epitelcellerne påkrævet. Desuden er den beskrevne fremgangsmåde begrænset i den tilgængelige viden om polarisationen af epitelcellerne. I øjeblikket blev polarisationen af epitelceller ikke taget i betragtning. Imidlertid er forskelle i ekspression af membranproteiner er beskrevet i apikale og basale membraner. Uhensigtsmæssig polarisering af epitel lag kunne have en indvirkning på den parakrin samspil mellem epithelial og stromaceller. Men fremgangsmåder opnå polariserede epitelceller er blevet beskrevet og kan indgå i den beskrevne teknik 15, 16.
Alt i alt er den beskrevne protokol foreslår en teknik til at kunne etablere primære cellekulturer af muse endometrial epitel- og stromaceller. Denne teknik resulterer i rene cellekulturer som bekræftet ved QRT-PCR og immunfarvning af vimentin og cytokeratin. I sidste ende blev en epitelial og stromal co-kultur indført, der giver mulighed for undersøgelse af parakrine signaler medieret af enten MEEC og / eller Mesc i decidualisering processen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Grundforskningsfonden-Flandern (FWO G.0856.13N) og forskningsrådet for KU Leuven (OT / 13/113). KDC er finansieret af FWO Belgien. AH er finansieret af OT / 13/113. Vi vil gerne takke Cell Imaging Core facilitet i KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) til brug for den konfokal mikroskop.
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant | Greiner Bio-one | 662610 | Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0110_0110_0090_0030/13408/ |
Nunc Cell culture treated 24 well plates | Thermo Scientific | 142475 | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475 |
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma Aldrich | B7880 | Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE |
Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma Aldrich | M1629 | Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE |
Arachis oil | Supermarket | Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used |
|
PrestoBlue cell viability reagent | Thermo Scientific | A13261 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 |
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175-046 | Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 |
17-β Estradiol | Sigma Aldrich | E8875 | Prepare a stock solution of 1mg/ml in EtOH before diluting in arachis oil (1:1000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en®ion=BE |
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized | Merck Millipore | SCGPU05RE | http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063 |
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES | Gibco | 11330-032 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057 |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | Gibco | 10500-056 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064 |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018 |
Gentamicin (50mg/ml) | Gibco | 15750-037 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Sigma Aldrich | D5921 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE |
MCDB-105 | Sigma Aldrich | M6395 | Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE |
Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I1882 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE |
Coverslips, glass, 18 mm Ø | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 1001/18 | http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937&tx_rmproducts_pi1[p]=3504&tx_rmproducts_pi1[v]=20088&cHash=abd12065683fe74b00eaa5e562824d06 |
Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE |
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C2674 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-094 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | T7409 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 |
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352340 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352360 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 |
Acetic acid (glacial) 100% | Merck Millipore | 1.00063 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063 |
Collagen I | Corning | 354236 | From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&productid=354236%28Lifesciences%29# |
Pancreatin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | P3292 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE |
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | BD Falcon | 353001 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630 |
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent | VWR Chemicals | 20821296 | https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP |
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3) | Cell Signalling Tech | #5741 | use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 |
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin | Sigma Aldrich | C2562 | use 1/1000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en®ion=BE |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix | 19943 | http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid=Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIwBEiQAI8rq879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k8P8HAQ |
Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11034 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&resultPage=1&resultsPerPage=15&autocomplete=&searchMode=keyword&productTypeSelect=antibody&targetTypeSelect=antibody_secondary&species=ltechall&keyword=488#filters=genericsort2:%22Capra%20hircus%22;;generic6:^%22Oryctolagus%20cuniculus%22$;;conjugates:^%22Alexa%20Fluor®%20488%22$;; |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594 | Thermo Scientific | A-11032 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&resultPage=1&resultsPerPage=15&autocomplete=&priorSearchTerms=&searchMode=keyword&productTypeSelect=antibody&targetTypeSelect=antibody_secondary&species=ltechall&keyword=594#filters=genericsort2:%22Capra%20hircus%22;;generic6:^%22Mus%20musculus%22$;; |
VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html |
DPBS, with calcium and magnesium | Gibco | 14040174 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 |