Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für Published: March 2, 2017 doi: 10.3791/55168

DOI

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Katrien De Clercq*¹, Aurélie Hennes*¹, Joris Vriens¹

¹Department of Development and Regeneration, Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)

* These authors contributed equally

Summary

Diese Studie stellt eine standardisierte und validierte Methode zur Isolierung und Kultur der primären Maus endometrial Stroma und Epithelzellen, die in einer Co - Kultur - System verwendet werden kann , in vitro decidualization zu studieren.

Abstract

Decidualization ist ein Progesteron-abhängige Differenzierung von Endometrium-Stromazellen und ist eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Implantation des Embryos. Obwohl viele Anstrengungen, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Dezidualisierung zu offenbaren, die genaue Signalisierung zwischen den Epithelzellen, die in Kontakt mit dem Embryo und den darunter liegenden Stromazellen bleibt schlecht verstanden vorgenommen wurden. Deshalb studieren decidualization in einer Weise, die sowohl die epithelialen und Stromazellen berücksichtigt, könnte unser Wissen über die molekularen Details der decidualization verbessern. Zu diesem Zweck wird in vivo Modellen von künstlichen Dezidualisierung sind physiologisch das relevanteste; jedoch Manipulation von interzellulären Kommunikation begrenzt. Derzeit werden in vitro Kulturen von endometrial stromal Zellen verwendet wird , um die Modulation der Dezidualisierung von mehreren Signalmoleküle zu untersuchen. Herkömmlicherweise von Mensch oder Maus Endometrium Stromazellen sindbenutzt. Jedoch ist die Verfügbarkeit von humanen Proben sehr oft begrenzt. Weiterhin wird die Verwendung von Mausgeweben mit Abart in dem Verfahren der Züchtung begleitet. Diese Studie stellt eine validierte und standardisierte Methode Kulturen reine Endometrial Epithelzellen (EWG) und Stroma-Zellen (ESC) mit Östrogen für drei aufeinander folgenden Tagen mit adulten behandelten intakten Mäusen zu erhalten. Das Protokoll ist optimiert, um die Ausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit der Zellen zu verbessern und wurde zu studieren, um decidualization in einer Co-Kultur von EWG und ESC weiter ausgebaut. Dieses Modell kann geeignet sein, die Bedeutung der beiden Zelltypen in decidualization zu nutzen und den Beitrag von signifikanten Signalmoleküle durch EWG oder ESC während der interzellulären Kommunikation abgesondert zu bewerten.

Introduction

Der menschliche Endometrium ist die innere Auskleidung der Gebärmutter und erfährt monatlichen Zyklen von Abbau und Reparatur als Vorbereitung auf mögliche Schwangerschaften. Es besteht aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen Auskleidung der Uteruslumen und das darunter liegende Stroma, die entsprechend den Schwankungen der ovariellen Hormone Östrogen und Progesteron in der Dicke variiert. Während der Lutealphase wird die postovulatorischen Progesteron surge Differenzierung von Endometrium Stromazellen in größere, runde Deciduazellen induzieren, einen Prozess namens decidualization ^{1, 2.} In menschlichen tritt dieses Phänomen spontan die predecidua zu bilden, jedoch wird ausgeprägter bei die Einnistung des Embryos. Eine funktionelle Konsequenz decidualization ist, dass die Gebärmutter wird vorübergehend empfänglich für die Einnistung des Embryos. Dieses Intervall wird als "Implantationsfenster" bezeichnet. Während der Frühzeit der Einnistung des Embryos, die decidualized endometrial Stromazellen des Implantierens Embryo umgebenden wird eine Barriere liefern den Durchtritt von schädlichen Substanzen zum Embryo ³ zu verhindern. Während der Schwangerschaft, wird diese decidua Nährstoffe für den sich entwickelnden Fötus vor placentation stattgefunden hat, und die mütterliche Teil der Plazenta ⁴ später bilden.

Ethischen und praktischen Erwägungen begrenzen die Gestaltung von Humanstudien, den Prozess der Dezidualisierung zu untersuchen und haben die Verwendung von Tiermodellen aufgefordert. Als Mitglied der hemochorial placentation Gruppe, wird die Gebärmutterschleimhaut von Nagetieren durchlaufen auch decidualization vor placentation ^5. Bei Nagetieren, jedoch hängt die Initiierung der Dezidualisierung Prozesses auf das Vorhandensein von Blastozysten in das Uteruslumen anzeigt, dass eine zusätzliche Anregung erforderlich ist , die ⁶ dezidualen Reaktionen auszulösen. Dies bedeutet eine komplizierte Kommunikation zwischen the endometrial Epithelzellen, die den direkten Kontakt mit der Blastozyste aufweisen und die zugrunde liegenden Stromazellen. Dennoch kann decidualization künstlich Reize als mechanisches Kratzen oder dem Einträufeln von Öl in einem hormonell vorbereiteten Uterus induziert werden. Obwohl in - vivo - Studien künstliche decidualization Modelle mit uns erlaubt haben , unsere Erkenntnisse in der komplexen Signalprozess decidualization, mechanistische in eingehende Studien zu verbessern, zB Untersuchung der unentbehrliche Kommunikation zwischen den Zellen epithelialen und stromalen, sind begrenzt. Daher kann in vitro decidualization Studien verwendet werden , um wichtige Wege zu manipulieren und grundlegende Prozesse studieren. Zu diesem Zweck können primäre endometrial Stroma-Zellkulturen aus menschlichen oder Nagetier Gebärmutterschleimhaut aufgebaut werden. Der Einsatz Nagetiere stimmt die Verwendung von gentechnisch veränderten Tieren, die Rolle eines speziellen Proteins von Interesse während der decidualization Prozess zu untersuchen. Allerdings, unreif, prepuberty-Mäuse werden oft verwendet, um Komplikationen des Östrus-Zyklus zu vermeiden, während in anderen Fällen uteri von allen Phasen des Östrus-Zyklus gesammelt werden, die in den Kulturen in einer Heterogenität führt. Darüber hinaus hat der Prozess der Dezidualisierung in verschiedenen Protokollen untersucht worden, beispielsweise durch (i) zur Ergänzung Hormone (Östrogen, Progesteron oder zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP)) zu dem Kulturmedium oder durch (ii) Isolierung von Deciduazellen von Mäusen Tag 4.5 von (Pseudo-) Schwangerschaft, die für Stecker Prüfung und vasektomierten Männchen zusätzlicher Bedarf verlangen. Diese Einschränkungen zeigen die Notwendigkeit einer standardisierten Methode in vitro Dezidualisierung zu studieren. In dieser Studie wurde ein physiologisches Modell aus adulten, nicht (pseudo) trächtige Mäuse beginnend in vitro decidualization zu untersuchen , werden vorgestellt. Bei diesem Verfahren wird tägliche Injektion von 17β-Östradiol (E2) die Proliferation von endometrialen Zellen induzieren, was zu einer erhöhten Ausbeute an homogenen und pure Zellpopulationen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung einer Co-Kultur-System, das Studium der epithelial-stromale Übersprechens und der Fähigkeit, den Prozess der Dezidualisierung auf verschiedenen Ebenen zu manipulieren.

Protocol

AlexaFluor

Alle Tierversuche für diese Studie wurden von der Ethikkommission der KU Leuven (Belgien) (Projekt P174 / 2013) genehmigt. Die Mäuse wurden unter Standardbedingungen untergebracht ist , mit ad libitum Zugang zu Futter - Pellets und Leitungswasser und hielt unter kontrollierten Bedingungen (23 ± 1,5 ° C, relative Luftfeuchtigkeit 40 - 60%, 12/12 Hell / Dunkel - Zyklus).

1. Mäuse

1. Verwenden Sie handelsübliche Mausstamm (dh C57Bl / 6, weiblich 8 bis 12 Wochen alt). Typischerweise 4 bis 5 Mäusen werden eine geeignete Menge an Zellen für weitere Experimente ergeben.
2. Injizieren intakten Mäusen subkutan mit 100 & mgr; l des 17β-Östradiol (E2) Lösung (100 ng / 100 & mgr; l) für 3 aufeinanderfolgende d vor der Isolation, um die Phase des Östrus-Zyklus der Tiere zu standardisieren und die Proliferation des Endometriums zu induzieren Zellen. Die Notwendigkeit für die Zyklusphase der Mäuse überprüft, bevor das Protokoll beginnt, ist vermeidbarUrsache für die 3 d 'Östradiolbehandlung.

2. Vorbereitungen

1. Machen Sie eine Lösung von 100 ng / 100 & mgr; l E2 in Erdnußöl. Für die Injektionen von fünf Mäusen (wie in 1.2 beschrieben), eine Menge von 1,5 ml benötigt.
   1. Man löst 1 mg E2 in 1 mL Ethanol eine Stammlösung von 1 mg haben / mL.
   2. Verdünnen dieser Stammlösung 1: 1000 in Arachisöl.
2. Machen 500 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBBS) 1x ergänzt mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (weiter bezeichnet als HBSS +).
3. Machen 500 ml gefiltertes Maus Endometrial Stromal Cell (MESC) Medium zur Kultur MESC: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium / Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12) mit Phenolrot, L-Glutamin und 4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure Säure, N - (2-hydroxyethyl) Piperazin- N '- (2-ethansulfonsäure) (HEPES) , enthaltend 10% FBS, 0,5 ug / ml Amphotericin B und 100 & mgr; g / mL Gentamicin (fueitere bezeichnet als MESC Medium).
4. Machen 500 ml gefiltertes 2% MESC Medium zur Kultur MESC während Dezidualisierung: DMEM / F12 mit Phenolrot, L-Glutamin und HEPES, enthaltend 2% FBS, 0,5 ug / ml Amphotericin B und 100 & mgr; g / mL Gentamicin.
5. Bereiten 500 ml gefiltertes Maus Endometrial Epithelial Zelle (MEEC) Medium: DMEM mit 10% FBS, 0,5 ug / ml Amphotericin B, 100 ug / ml Gentamicin, 25% MCDB-105-Medium, und 5 ug / ml Insulin (weiter bezeichnet als MEEC Medium).
6. Bereiten Poly-L-lysin (PLL) beschichtete Deckgläser für MESC Kultur.
   1. Man löst 25 mg des PLL in 250 ml destilliertem Wasser. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 um-Filter.
   2. In sterilen Deckgläschen in einer 12-Well-Platte. In 300 & mgr; l gelösten PLL auf den Deckgläsern.
   3. Entfernen Sie die Lösung nach 30 Minuten Inkubation. Die Platten können bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden (bis zu 1 bis 2 Monate).
7. Bereiten Sie eine 10 mg / ml Stammlösung of Kollagenase Typ IA und speichern Aliquots von 300 & mgr; l bei -20 ° C. Filter vor dem Gebrauch.

3. Vorbereitung Erforderliche 24 h vor der Isolation

1. Bereiten Sie Kollagen beschichtete Deckgläser für MEEC Kultur.
   1. Bereiten Sie eine 0,02 M Essigsäurelösung in destilliertem Wasser (1 ml pro Deckglas).
   2. Zugabe von 150 & mgr; l-Kollagen in 12 ml 0,02 M Essigsäure in einer Endkonzentration von 50 ug / ml zu erhalten.
   3. In sterilen Deckgläschen in einer 12-Well-Platte.
   4. 1 ml der Kollagenlösung (siehe 3.1.2).
   5. Inkubieren O / N (mindestens 12 h) bei 37 ° C.
      Bei der Isolierung:
   6. Entfernen Sie die Kollagenlösung aus den Deckgläsern durch Absaugen und lassen Sie es an der Luft trocknen in einer sterilen Umgebung (in der Laminar-Flow-Gehäuse).
   7. Waschen Sie die Deckgläser zweimal mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
2. Vorbereiten eines 2,5% Pankreatin-Lösung durch Zugabe von 0,25 g Pankreatin in einem 15 ml Röhrchen mit canonical 10 mlHBSS +. Schütteln (200 rpm) wurde die Lösung bei 37 ° C für 1 h, die Löslichkeit zu erhöhen. Lagerung bei 4 ° C.

4. Isolierung und Kultur von Maus Endometrial Epithelial Cells (MEEC) und Maus Endometrial Stromazellen (MESC)

1. In 25 mg Trypsin in einem 15 ml-Röhrchen mit 2,5% Pankreatin-Lösung (siehe 3.2) mit einer endgültigen Lösung, um am Ende mit 0,25% Trypsin (weiter bezeichnet als MESC Verdauung mix).
2. Isolierung von Uteri
   1. Überprüfen Sie die Zyklusphase der Tiere mit einem Scheidenabstrich Prüfung.
      1. Begrenze die Tier und spülen Sie die Vagina vorsichtig mit 50 & mgr; l PBS 3-5 mal.
      2. Sammeln Sie die letzte Flush auf einem Glasträger.
      3. Untersuchen Sie das Material unter einem Hellfeld-Mikroskop ein 10X oder 20X Ziel verwenden.
      4. Verwenden Sie nur Mäuse, die in der Brunst Phase sind. Diese Stufe wird durch die Anwesenheit von verhornten Epithelzellen in der vaginalen Lavage (Abbildung 1 , dadurch gekennzeichnet
   2. Euthanize die Tiere eine geeignete Methode wie Genickbruch oder CO ₂ -induzierte Narkose verwendet wird .
   3. Sprühen der Karkassen mit 70% Ethanol, um eine sterile Umgebung zu erzeugen.
   4. Mit einer sterilen chirurgischen Werkzeugen, öffnen Sie den Bauch und den Darm zur Seite schieben beide Uterushörner zu visualisieren.
   5. Besorgen Sie sich die Uterushorn am meisten distalen Ende unter den Eileiter. Präparieren Sie die Gebärmutterhörner von Eileiter und entfernen Fett- und Bindegewebe. Schneiden Sie das Horn am distalen Ende über dem Uteruskörper heraus und legen Sie sie in einer 35 mm Petrischale mit 3 ml HBSS +.
      1. Wiederholen Sie diesen Schritt für das andere Horn und für die anderen Tiere, bis alle Gebärmutterhörner gesammelt werden.
   6. Reinigen Sie das Uterushorn (in HBSS +) weiter unter einem Stereoskop und entfernen Sie alle Rest Fettgewebe oder Bindegewebe.
   7. Schneiden Sie die Gebärmutterhörner offen längs der Uteruslumen zu entlarven und ersetzen the Horn in einem neuen Petrischale mit frischem HBSS +.
   8. Übertragen Sie alle Gebärmutterhörner an den 15 ml-Röhrchen mit Pankreatin und Trypsin.
   9. Inkubieren horizontal für 60 min bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler (50 rpm).
   10. Inkubieren horizontal für 45 min bei 23 ° C (RT), ohne Schütteln.
   11. Inkubieren horizontal für 15 min bei 37 ° C (Wasserbad), ohne Schütteln.
   12. machen den MESC Verdauung Mix mittlerweile von 300 & mgr; l der 1 mg / ml Kollagenase Lager in 2,7 ml 0,05% Trypsin-(EDTA) -Lösung gelöst wird.
       HINWEIS: Von nun an weitere Isolierungsschritte werden in einer sterilen Umgebung unter einer Laminar-Flow-Box durchgeführt.
3. Maus Endometrial Epithelzellen (MEEC) Kultur
   1. Nach 2 Stunden Inkubation, abgießen den Überstand vorsichtig Lösung.
   2. Übertragen Sie die Uteri in eine Petrischale kalt MEEC Medium enthält, und Inkubation für 5 min, um Trypsin zu inaktivierenAktivität.
   3. Übertragen die Uteri in ein 15 ml Röhrchen mit 3 ml kaltem HBSS +.
   4. Vortex für 10 s, die epithelialen Blätter zu lösen.
   5. Spülen Sie die Uteri in einer sauberen Petrischale mit 3 ml HBSS +.
   6. Wiederholen Sie Schritt 4.3.2 - 4.3.4 insgesamt drei Suspensionen, die Epithelschichten zu erhalten.
   7. Übertragen Sie die Uteri auf den MESC Verdauung Mischung und Inkubation bei 37 ° C für 30 min unter Schütteln (200 rpm) (go 4.4 für die weitere Isolierung von MESC zu Schritt).
   8. Recover die Epithellagen durch Pipettieren der drei Zellsuspensionen sanft auf einem 100 & mgr; m Nylon-Mesh-Gewebe, um Schmutz zu entfernen.
   9. Zentrifugieren Sie die gesammelte Zellsuspension bei 500 g für 5 min.
   10. Das Pellet in 12 ml MEEC Medium und gut mischen.
   11. Vereinbaren Sie die Lösung für 5 Minuten, um verbleibende MESC mit Schwerkraftsedimentation zu trennen.
   12. Entfernen Sie vorsichtig die oberen 2 ml durch eine 5 ml Pipette.
   13. Zentrifugieren Sie die Zelle suspension bei 500 xg für 5 min.
   14. Resuspendieren in MEEC Medium durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten.
   15. Platte die Zellen auf Kollagen-beschichtete Deckgläser in die gewünschte Dichte für weitere Experimente (Abbildung 2a).
   16. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ Inkubator für mindestens 12 h.
       HINWEIS: Für die Immunfärbung oder funktionelle Experimente wie fluoreszierende Kalzium-Imaging, ist es ratsam, die Zellen direkt auf die Deckgläser an der Platte, während sie in einer 6-Well-Platte Impfen wird empfohlen, wenn RNA oder Proteinisolierung erwünscht ist. Isolation of endometrial stromal Zellen der Maus wird nach kann unzureichend sein, nur eine Verdauung als die Reinheit der Zellen in zwei Runden unterteilt. Die Uteri werden zweimal für eine optimale Zellrückgewinnung und Reinheit verdaut. In beiden Runden sind die technischen Eingriffe identisch. Zellen aus beiden Durchgängen gesammelt kann für weitere Versuche aufbewahrt werden, wie durch den Forscher gewünscht.
4. Maus Endometrial Stromal Zelle (MESC) Kultur: ^1. Runde
   1. Vor dem Start der ersten Runde der Verdauung, bereiten eine zweite Verdauung Mischung durch Auflösen von 300 & mgr; l der 1 mg / ml Kollagenase Lager in 2,7 ml 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung. Diese Mischung wird in dem Schritt 4.4.8 benötigt.
   2. Bereiten drei kleine Petrischalen mit kaltem (4 ° C) HBSS + 3 x 15 ml-Röhrchen mit 3 ml MESC Medium (tube X1, X2 und X3).
   3. Nach 30 Minuten Inkubation, schütteln Sie die Uteri haltigen Trypsinlösung sanft für 10 s. MESC Zellen werden aus der Gebärmuttergewebe abzulösen und werden in der Trypsin-Lösung bleiben.
   4. Übertragen Sie die Uteri auf die erste Petrischale mit 3 ml kaltem (4 ° C) HBSS + und gut ausspülen.
   5. 3 ml MESC Medium zum Rohr ursprünglich die Uterushörner (tube in Schritt 4.4.3), die Trypsin-Aktivität zu inhibieren.
   6. Übertragen Sie die Uteri aus der Petrischale mit kaltem (4 ° C) HBSS + zu Rohr X1, das 3 ml MESC Medium und leicht schütteln für 10 s. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.4 (Übertragung in eine Petrischale mit kaltem (4 ° C) HBSS +) und 4.4.6 (Übertragung auf Rohr X2 und X3) zweimal.
      HINWEIS: Schließlich ist dieses Protokoll wird in 4 Zellsuspensionen ergeben: eine Röhre, die Trypsin-Lösung und 3 Röhrchen mit MESC Medium, das MESC (Rohre X1, X2 und X3) enthält.
   7. Übertragen uteri in der neuen MESC Verdauung, wie in 4.4.1 beschriebenen Schritt und Inkubation für 30 min bei 37 ° C, in vertikaler Richtung.
   8. Sammeln Sie die Stromazellen durch die vier Zellsuspensionen durch ein 40 & mgr; m Nylon-Mesh vorbei. Spülen Sie das Gitter mit zusätzlichen 5 ml MESC.
   9. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 g für 7 min.
   10. Das Pellet in MESC und Platte auf PLL-beschichtete Deckgläser für weitere Experimente mit der gewünschten Dichte.
   11. Inkubieren für mindestens 4 bis 6 h oder O / N bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ -Inkubator.
5. Maus Endometrial Stromatumoren Zelle (MESC) Kultur: ^2. Runde <ol>
6. Bereiten drei kleine Petrischalen mit kaltem (4 ° C) HBSS + 3 x 15 ml-Röhrchen mit 3 ml MESC Medium (Tubes Y1, Y2 und Y3).
7. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.3 - 4.4.7.
8. Übertragen Sie die letzte Zellsuspension zusammen mit dem Uteri auf einen 40 & mgr; m Nylon-Mesh.
9. Sammle die Stromazellen durch den Inhalt des Röhrchens Y1 vorbei, Y2 und Y3 durch das Nylonnetz. Spülen Sie das Gitter mit zusätzlichen 5 ml MESC.
10. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 g für 7 min.
11. Resuspendieren des Pellets in MESC Medium und Platte auf PLL-beschichtete Deckgläser für weitere Experimente (Abbildung 2b).
12. Inkubieren für mindestens 4 bis 6 h bei 37 ° C mit 5% CO _2.
    HINWEIS: Für die Immunfärbung oder funktionelle Experimente wie fluoreszierende Kalzium-Imaging, ist es ratsam, die Zellen auf Deckgläser an der Platte, während sie in einer 6-Well-Platte Impfen wird empfohlen, wenn RNA oder Proteinisolierung erwünscht ist.

5. Vimentin/ Cytokeratin Doppelfärbung für die Validierung der reinen MEEC und MESC Kulturen

1. Seed die Zellen auf Deckgläsern.
2. Waschen 3 x 5 min mit PBS, das Calcium und Magnesium auf einem Orbitalschüttler (50 rpm).
3. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) (ACHTUNG!) Für 10 min, nicht auf einem Schüttler.
4. Waschen Sie 3x mit PBS ohne Calcium und Magnesium auf einem Schüttler (50 rpm).
5. Permeabilisierung der Zellen mit 0,2% Triton X-100 für 10 min auf einem Schüttler (50 rpm).
6. Waschen Sie 3x mit PBS auf einem Schüttler.
7. Block mit 5% Ziegenserum (GS) in PBS für 2 Stunden auf einem Schüttler (50 Umdrehungen pro Minute)
8. Inkubiere Zellen mit monoklonalem Kaninchen-Anti-Human-Vimentin (1: 500) und monoklonalen Maus-anti-human Panzytokeratin (1: 1000) bei 4 ° C auf einem Schütteltisch (50 rpm). Antikörper werden in PBS mit 0,5% GS verdünnt.
9. Waschen 3x mit PBS auf einem Schüttler (50 rpm).
10. Inkubiere Zellen mit Sekundärantikörper (1: 1000 in 0,5% GS) Alexa Fluor 488-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG und Alexa Fluor 488-conjugated anti-Maus-IgG auf einem Schüttler.
11. Waschen Sie 3x mit PBS auf einem Schüttler.
12. Berg Träger mit wässrigen Eindeckmedium enthält DAPI und trocken O / N.
13. Verschließen Sie die Dias mit Nagellack und halten auf 4 ° C zur weiteren Verwendung (Abbildung 2a, b).

6. In - vitro - decidualization in einer Cokultur - System

HINWEIS: Vier bis fünf Tiere sind verpflichtet, eine Co-Kultur-System in einer 24-Well-Platte zu schaffen. Weiterhin mit dem folgenden Protokoll in einer sterilen Umgebung, vorzugsweise unter einer laminaren Strömungsgehäuse.

1. Bereiten Sie die Zellkultur-Einsätze während der Zentrifugation und / oder Inkubationsschritte der epithelialen Zellisolierung in einem zusätzlichen 24-Well-Platte (wie in 4.3 beschrieben).
   1. Hinzufügen 200-400 uL MESC Medium in der gewünschten Menge von Vertiefungen in der Platte mit 24 Vertiefungen.
   2. Legen Sie die Einsätze in den prefilled 24-Mulden mit einer sterilen Zange.
2. Resuspendieren MEEC Pellet(Schritt 4.3.14) in MEEC Medium und teilen sich über die Einsätze (Arbeitsvolumen: 150 - 300 ul pro Einsatz). Kultur der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ -Inkubator.
3. Seed die Stromazellen in einem anderen 24-Well-Platte (kompatibel mit den Zellkultur-Einsätze) nach der zweiten Runde der Stroma-Zellisolierung (Schritt 4.5.6). Verwenden Sie ein Arbeitsvolumen von 400 & mgr; l Zellsuspension pro Vertiefung.
4. Ermöglichen die Stromazellen für mindestens 4 zu befestigen - 6 h bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ -Inkubator.
5. Transfer der Zellkultur-Einsätze mit Epithelzellen aus dem ersten 24-Well-Platte in die zweite Platte mit 24 Vertiefungen durch Stromazellen bedeckt. Verwenden Sie sterilisierten Pinzette oder die Einsätze berühren nur an ihren hängenden Fuß.
6. Kultur die Zellen bei 37 ° C in 5% CO ₂ Inkubator für einen Zeitraum von 3 bis 5 d , bis die Epithelzellen bilden eine einlagige und die Stromazellen erreichen 80 bis 90% Konfluenz. Darüber hinaus verwenden die transepitheliale elektrische Widerstand (TEER)die epitheliale Monoschicht durch Verwendung einer Volt / Ohm - Meter epithelial zu überwachen , wie von Grant et al. ^7. Werte von 800-1.000 / gut waren ausreichend, um die epitheliale Monoschicht konfluent zu betrachten.
7. Bei Bedarf ersetzen Sie das Medium alle 2 - 3 d unter Verwendung von Glaspipetten oder feinen Pipettenspitzen. Beginnen mit dem Austausch des Mediums der Stromazellen (am Boden ausgesät), bevor das Medium in den Einsätzen zu ersetzen. Es wird empfohlen, bei 37 ° C vorgewärmten Zellkulturmedium zu verwenden.
8. Bereiten Sie die decidualization Medium in vitro decidualization einzuleiten , bevor das Experiment beginnt. Verwenden Sie ein Arbeitsvolumen von 400 & mgr; l pro Vertiefung von Stromazellen.
   1. Die folgenden Stammlösungen und speichern Aliquots bei -20 ° C.
      1. Bereiten 250 uM Medroxyprogesteron 17-acetat (MPA) in Ethanol.
      2. Bereiten 100 mM Stammlösung 8-Bromadenosin 3 ', 5' cAMP in Reinstwasser.
   2. Machen Sie das dezidualen Medium mit 1 uM MPA und 0,5 mM cAMP in MESC Medium mit 2% FBS.
9. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus den Vertiefungen und fügen Sie das dezidualen Medium auf die Stromazellen. Wenn ein Steuerzustand benötigt wird, verwenden Sie das MESC Medium mit 2% FBS.
10. Entfernen des Mediums aus der Zellkultureinsätze und 300 & mgr; l MEEC Medium auf die Zellen.
11. Inkubiere die Zellen 5 d in einem Inkubator bei 37 ° C in 5% CO _2.
12. Nach dem fünften Tag, um das Ausmaß der Dezidualisierung in stromalen Zellen durch RT-qPCR bewerten (siehe unten).
13. Bestätigen Sie die Lebensfähigkeit der Epithelzellen der Resazurin-basierten Lebensfähigkeit Reagenz.
    1. Bereiten Sie eine Lösung von 01.10 Lebensfähigkeit Reagens in MEEC Medium.
    2. Übertragen Sie die Zellkultur-Einsätze in eine neue 24-Well-Platte.
    3. In 150 bis 300 & mgr; l der Lebensfähigkeit Reagenz - MEEC Lösung auf die Zellen.
    4. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO ₂ für zuminmindestens 4 - 5 h oder über Nacht und die Lebensfähigkeit der Zellen beurteilen durch eine Farbverschiebung (blau bis violett / pink) zu beobachten.
       HINWEIS: Dezidualisierung auch bewertet werden kann, eine Maus Prolaktin-spezifischen ELISA verwendet, wie durch den Forscher bevorzugt.

7.Validation von decidualization durch qRT-PCR

HINWEIS: Für die Validierung des decidualization durch qRT-PCR, wird empfohlen, alle Testbedingungen in doppelter Ausführung durchzuführen, um eine ausreichende Menge an Zellen für die RNA-Analyse zu erhalten.
Quantitative RT-PCR wird vorher in De Clercq et al beschrieben durchgeführt. ^8.
In Kürze:

1. Isolieren Sie die Gesamt-RNA Kommerzielle RNA Isolation Kit.
   1. Beurteilen Sie die Quantität und Qualität der RNA unter Verwendung handelsüblicher Methoden gemäß dem Protokoll des Herstellers sind.
2. Synthetisieren cDNA gemäß Herstellerprotokoll von 1 ug Gesamt-RNA starten.
3. Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Kits dem Protokoll des Herstellers nach der qRT-PCR-Reaktion durchzuführen.
   1. Führen Sie alle Proben in dreifacher Ausfertigung.
   2. Nutzen Sie die kommerziellen TaqMan Master Mix und spezifischen TaqMan-Sonden für die gewünschten Housekeeping-Gene und Prolaktin (prl8a2), ​​um die Reaktion durchzuführen.

Representative Results

Allgemeiner Überblick über das Protokoll

1A veranschaulicht eine allgemeine Übersicht des Protokolls. Eine tägliche Injektion von E2 (100 ng) an drei aufeinanderfolgenden Tagen wurde verwendet, um die Tiere zu synchronisieren und um die Phase des Östrus-Zyklus standardisieren. Der Östrocyclus kann durch vaginalen Spülungen bewertet werden und wird in den Voröstrus, Brunst, Diöstrus geteilt, und Metöstrus Phase. Die Zyklusphase kann gemäß dem Verhältnis von abgestoßenen Zellen in der Lavage bestimmt werden, die der hormonellen Veränderungen unterworfen sind. Steigende Mengen an Östrogen machen die Tiere in die Brunst Phase entwickeln. Diese Phase kann leicht durch die Anwesenheit von ausschließlich verhornten Epithelzellen und der Abwesenheit von Leukozyten (1B) detektiert werden. Am Tag 4 uteri von Tieren , die in Östrus Phase werden gesammelt und MEEC und MESC isoliert (Figur 1C). decidualization ceine durch Zugabe von 0,5 mM cAMP und 1 uM MPA an die 2% FBS-Medium bei einer Inkubationszeit von 5 d induziert werden.

Qualitätskontrolle von MEEC und MESC Kulturen

Die Reinheit der primären Zellkulturen können durch den Unterschied in Vimentin und Cytokeratin-Expression zu beurteilen. Vimentin ist ein Zwischenprodukt, das Filament in mesenchymalen Zellen exprimiert wird, also in den endometrialen Stromazellen. Cytokeratin ist ein Intermediärfilament im Zytoskelett von Epithelgewebe gefunden. 2A zeigt die mRNA Expression von Vimentin und Cytokeratin in MEEC und MESC bewertet qRT-PCR. Vimentin ist hoch in MESC und niedrig in MEEC (2,2x höher, p <0,001), während Zytokeratin ist hoch in MEEC und niedrig in MESC (36x höher, p <0,001). Ein Vimentin / Cytokeratin Doppelfärbung wurde durchgeführt und zeigte an, dass Stromazellen Vimentin während EPIT auszudrückenhelial Zellen exprimieren Zytokeratin (2B, C). Das Fehlen von primärem Antikörper wurde als Negativkontrolle für die Immunfärbung (2D, E) verwendet. Diese immunhistologischen Färbungen zeigen, dass beide endometriale Zellkulturen (MEEC und MESC) eine Reinheit von bis zu 90%.

Decidualization in MEEC / MESC Cokulturen

Nach der Isolierung der Maus endometrial und Stromazellen wurden in einem Co-Kultursystem ausgesät das endometrial Umgebung nachzuahmen. Die Zellen wurden kultiviert, bis die Epithelzellen eine Monoschicht in dem Zellkultureinsatz (TEER-Werte von 800 - 1000 / Vertiefung) ausgebildet, und die Stromazellen erreichte einen subkonfluenten Zustand. Dezidualisierung wurde in den Stromazellen mit der Anwendung von 0,5 mM cAMP und 1 uM MPA induziert. Prolaktin-mRNA-Spiegel wurden in den Stromazellen nach qRT-PCR als Indikation für decid beurteilt nach fünf Tagen Inkubation,ualization (3A). Prolactin-Spiegel wurden stark in Zellen zu den Hormonen und nicht nachweisbar in Zellen, die mit dem Kontrollmedium (p <0,01) inkubiert unterworfen ausgedrückt.

Da Epithelzellen im Inneren der Zellkultureinsätze sind schwer sichtbar zu machen, wurde ein Lebensfähigkeitstest durchgeführt , unmittelbar nach der fünftägigen Inkubationsperiode (3B). Eine Mischung aus normalem Wachstumsmedium und einer Lebensfähigkeit Reagens wurde in die Vertiefungen gegeben und für eine Dauer von minimal 8 inkubiert - 12 h. Die Farbverschiebung von blau bis leuchtend rosa zeigte die Anwesenheit von lebenden Epithelzellen. Beachten Sie, dass die Farbverschiebung wird nur auftreten, wenn lebende Zellen vorhanden sind.

Abbildung 1: Allgemeiner Überblick über das Protokoll. (A) Schema des Isolierungsprotokolls mit drei Startaufeinander folgenden Tagen von Östrogen-Injektionen. Am Tag 3 sollten die notwendigen Vorbereitungen, hergestellt werden. Am Tag 4 wird Brunst Phase (durch Sterne) bewertet, indem eine vaginale Spülung durchgeführt wird. MESC und MEEC werden isoliert mit verschiedenen Verdauungsschritte. Am Tag 6, oder, wenn die Zellen konfluent sind, Dezidualisierung kann durch Zugabe von cAMP und MPA zu dem Medium und einer Inkubationszeit von fünf Tagen (- 11 Tage 6) in dem Co-Kultursystem induziert werden. (B) repräsentatives Bild der Brunst Phase durch die Anwesenheit von verhornten Epithelzellen in der vaginalen Lavage gekennzeichnet (Vergrößerung 10X). (C) repräsentatives Bild von MESC und MEEC (Vergrößerung 20X, Maßstabsbalken: 100 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

(A) Messenger - RNA - Spiegel von Vimentin und Cytokeratin - Expression die Reinheit der Kulturen zu zeigen. RNA-Spiegel wurden relativ zu dem geometrischen Mittel von Housekeeping-Genen ACTB und TBP quantifiziert. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Vimentin / Cytokeratin Doppelfärbung auf MESC Kulturen (B) und MEEC Kulturen (C). Legen Sie in der linken Seite zeigt eine 63X Vergrößerungsansicht. Negativkontrolle mit dem primären Antikörper weggelassen für MESC (D) und MEEC (E) (Maßstab: 50 um). ***: P <0,001 mit Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni-Korrektur für multiples Testen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Validierung von decidualization über RT-PCR. (A) mRNA - Spiegel von Prolaktin Expression in Stromazellen Dezidualisierung zu bewerten. RNA-Spiegel wurden relativ zu dem geometrischen Mittel von Housekeeping-Genen PGK1 und TBP quantifiziert. Die fold change in Zellen, die in Steuer- oder Dezidua-Medium wird als Mittelwert ± SEM dargestellt. (B) Illustrative Bilder von Stromazellen vor (oben) und nach (unten) decidualization Reiz. Der Einsatz auf der rechten Seite zeigt eine Vergrößerung eines decidualized Stromazellen. Dezidualisierung wird durch das Vorhandensein von mehrkernige Zellen, gekennzeichnet durch schwarze Pfeile angedeutet. (C) Repräsentative Bilder der Beurteilung der epithelialen Zellebensfähigkeit in dem Einsatz nach dem Test. Bilder wurden unmittelbar nach der Verabreichung der Lebensfähigkeit Reagens (Presto) (0 h) und f genommenach Morgen (ON). **: P <0,01 mit Mann-Whitney U-Test. ON: über Nacht. Maßstabsbalken: 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Decidualization ist die Progesteron-abhängige Differenzierung von Endometrium Stromazellen in runde sezer Deciduazellen. Beim Menschen tritt dieser Prozess spontan während der Lutealphase des Menstruationszyklus und in den Stromazellen umgeben die Gefäßzellen zu bilden, die predecidua initiiert. Jedoch bei Nagetieren ist das Vorhandensein einer Blastozyste zwingend Dezidualisierung zu induzieren. Die Tatsache, dass Dezidualisierung tritt nur nach Kontakt mit den endometrialen Epithelzellen impliziert, dass wichtige Faktoren, die von den Epithelzellen sezerniert werden Dezidualisierung in der darunterliegenden Stroma zu induzieren. Obwohl dieser Unterschied in der Initiierung der Dezidualisierung Verfahren sollte anerkannt werden, dass die Tatsache, menschliche Dezidualisierung bei die Einnistung des Embryos robuster wird legt nahe, dass ähnliche Mechanismen involviert sein könnten. In vitro werden häufig Zellkulturen verwendet , um die Wirkung von spezifischen Molekülen während des Prozesses der Dezidualisierung zu studieren.Dennoch ist die Verfügbarkeit und die Menge an menschlichem Gewebe , die gesammelt werden können , oft begrenzt und durch Veränderungen begleitet, zum Beispiel Zyklusphase, die Anzahl der Schwangerschaften und das Vorhandensein von gynäkologischen Erkrankungen wie Endometriose oder Adenomyosis. Viele dieser Probleme können durch die Verwendung von Maus-Gewebe verhindert werden, die leicht zugänglich und Zyklusphase unabhängig ist. Ein weiterer großer Vorteil von Maus-Gewebe unter Verwendung ist die Gelegenheit nutzen, genetisch veränderte Nagetiere und die Möglichkeit zur Einrichtung eine große Anzahl von Experimenten. Im Moment viele verschiedene Isolations Protokolle wurden in der Literatur mit hoher Variabilität im Alter der Tiere und der Zeit, in der Brunst Phase im Moment der Verwendung beschrieben.

Diese Studie stellt ein neues Verfahren zur primären endometrial Kokulturen von Stroma- und Epithelzellen in dem Vorteil einer standardisierten Ovarialzyklus durch eine tägliche Injektion von Östrogen vor der Isolierung genommen wurde. Weiterhin ist Östrogen known zur Proliferation in epithelialen und stromalen Zellen induzieren, die weiter erhöht die Ausbeute pro Isolation. Die Isolierung Protokoll beschrieben in diesem Papier wurde auf Grant et al basiert. ⁷ wurden jedoch weitere Optimierungsschritte enthalten , die Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit der verschiedenen Zellkulturen zu erhöhen. Zuerst HBSS wurde immer mit Antibiotika ergänzt Kontamination der Primärkultur zu vermeiden. Während der Isolierung der MEEC wurde eine Temperaturanpassung durchgeführt (15 min bei 37 ° C), um die Ernte der Epithelzellen während der ersten Digestion zu erhöhen. Als nächstes wurde ein zusätzlicher Schritt eingeschlossen, nachdem die enzymatische Aktivität zu tempern Trypsin-Verdau durch Zugabe von Medium, FBS, enthaltend seine Aktivität zu hemmen. Weiterhin MEECs wurden durch ein Filter mit einer Maschenöffnung größer war als das, was allgemein beschrieben ist (100 & mgr; m), wie sie häufig in Cluster und Zellschichten kommen. Darüber hinaus wurde eine Kontamination durch Stromazellen reduziert durch ein Add Durchführungitional Schritt, in dem MEECs und MESCs wurden auf Schwerkraftsedimentation Basis voneinander getrennt verpackt. Schließlich wurden MEECs auf Kollagen-beschichtete Deckgläser ausgesät die Befestigung von Zellen zu Glasplättchen zu erhöhen, wie es klar wurde, dass die Befestigung an unbeschichtetem oder PLL-beschichteten Glasplättchen unzureichend war. Während der Isolierung der MESCs, Kollagenase (1 mg / ml) wurde zur Verbesserung der Verdauung ergänzt. Weiterhin wurde diese Verdauungsschritt zweifach durchgeführt Kontamination von verbleibenden MEECs zu vermeiden. Alle diese zusätzlichen Schritte führten zu reinen und tragfähige Kulturen von homogenen Zellpopulationen.

Die Reinheit der Zellpopulation wurde mit Immunfärbung und qRT-PCR Vimentin als Stroma-Marker und Zytokeratin als epithelialen Marker ausgewertet. Offensichtlich eine entgegengesetzte Expressionsmuster von Vimentin und Zytokeratin wurde in MEEC und MESC beobachtet. Es kann jedoch bemerkt werden, dass die relative mRNA-Expression von Vimentin und Cytokeratin in den MEEC Kulturen ähnlich ist. Similar Ergebnisse werden von anderen Forschungsgruppen, in denen Epithelzellen in Kultur acquire Vimentinexpression ⁹ veröffentlicht. Noch wichtiger ist der Unterschied in der Proteinexpression zwischen Vimentin und Cytokeratin wie in den immunhistologischen Färbungen der verschiedenen Zellpopulationen beobachtet. Doppel-Immunfärbung zeigte, dass EECs waren positiv für Cytokeratin und ESC waren positiv für Vimentin. Die Verwendung dieser Marker in Immunfärbung ist ein etabliertes Verfahren , und üblicherweise verwendet , um die Zelltypen ¹⁰ anzuzeigen.

Obwohl viele Untersuchungen auf die Dezidualisierung des MESC ausgeführt worden ist, bleibt es möglich, dass die Anwesenheit von Epithelzellen in diesem Modell die Ergebnisse der Dezidualisierung verändern können. Erstens hat es sich gezeigt, dass, wenn MEEC zu einer Monoschicht in Gegenwart von MESC-konditioniertes Medium oder in einer Kokultur Einstellung wachsen, die Monoschicht eine verbesserte Epithelzelle transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER), aufgrund von Faktoren von MESC abgesondert ^7. Außerdem Pierro et al. Können ¹¹ Beweise dafür , dass Epithelproliferation, beeinflusst von 17β-Östradiol, könnte durch Faktoren von den Stromazellen, und alternativ Epithelzellen lösen Faktoren sezerniert vermittelt werden , die ¹² Stromatumoren decidualization ^{modulieren, 13.} Insgesamt ist es deutlich, dass die epithelial-stromale Kokultur Umgebung eine mehr physiologische Situation bereitstellt, die für parakrine Interaktion und Kommunikation ermöglicht. Das Verfahren zur Kultivierung von zwei unterschiedlichen Zelltypen unter Verwendung eines Einsatzes Co-Kultursystem wurde zuvor ^{14, 15} beschrieben , und wurde für die Verwendung von murinen Primärzellen angepasst. Durch den Nachweis von mRNA-Spiegel Prolaktin als Read-out für Dezidualisierung, hat die beschriebene Technik eine sehr reproduzierbare Auslese für Dezidualisierung verfügbar und ermöglichens, wodurch die Untersuchung der epithelial-stromale Beziehung während Dezidualisierung. Parakrine Signale von MEEC vermittelten könnte das Ausmaß der decidualization in den Stromazellen verändern. Darüber hinaus erlaubt das Modell für spezifische Modulation der epithelialen Seite ohne direkt die Stromazellen beeinflussen. Daher ist diese Co-Kultur von MEEC und MESC bietet ein perfektes Werkzeug , um die Wirkung von Hormonen, Cytokinen, usw. auf den Epithelzellen mit einem Auslese auf Stromazellen decidualization zu bewerten. Ein weiterer Vorteil dieser Co-Kultursystem ist, dass es die Forscher auf die Beteiligung eines spezifischen Proteins in der Dezidualisierung-Verfahren in entweder Kompartiment der Epithel- oder Stroma- zu untersuchen ermöglicht durch Zellen, isoliert aus transgenen Tieren. Darüber hinaus wird diese Technik sehr hilfreich sein Blastozyste Adhäsion zu untersuchen, um zu beurteilen, ob parakrine Faktoren, die von Epithelzellen in Gegenwart einer Blastozyste sezerniert werden ausreichend Dezidualisierung des darunter liegenden Stroma zu induzierenZellen. Ein wichtiger Schritt in Trophoblastinvasion korreliert extrazellulären Matrixabbau, die durch die Wirkung proteolytischer Enzyme vermittelt wird. Die vorgeschlagene Technik kann als ein in vitro - Modell angewendet werden , um das Übersprechen zwischen der Blastozyste, die Epithelzellen und dem Stütz Stroma zu untersuchen.

Jedoch wenig im Moment über den Ursprung der Epithelzellen bekannt, die ebenso wie luminalen glandulären sein kann. Daher sind weitere Charakterisierung der genetischen und molekularen Profil der Epithelzellen erforderlich. Darüber hinaus ist das beschriebene Verfahren in dem verfügbaren Wissen über die Polarisierung der Epithelzellen beschränkt. Im Moment wurde die Polarisation von Epithelzellen nicht berücksichtigt. Jedoch Unterschiede in der Expression von Membranproteinen sind in apikalen und basalen Membranen beschrieben. Unangemessen Polarisierung der Epithelschicht könnte einen Einfluss auf die parakrine Interaktion zwischen epitheli habenal und Stromazellen. Jedoch wurde beschriebenen Verfahren polarisierter Epithelzellen zu erhalten und könnte in der beschriebenen Technik ^{15, 16} aufgenommen werden.

Insgesamt schlägt die beschriebenen Protokoll eine Technik erfolgreich zu primären Zellkulturen aus Maus endometrial Epithel- und Stromazellen herzustellen. Diese Technik führt zu einer reinen Zellkulturen, wie durch qRT-PCR und Immunfärbung von Vimentin und Zytokeratin bestätigt. Letztlich wurde eine epitheliale und stromale Kokultur eingeführt, entweder durch MEEC und / oder MESC im Dezidualisierung Prozess vermittelt zur Untersuchung von parakrine Signale ermöglicht.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant	Greiner Bio-one	662610	Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/
Nunc Cell culture treated 24 well plates	Thermo Scientific	142475	http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma Aldrich	B7880	Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE
Medroxyprogesterone 17-acetate	Sigma Aldrich	M1629	Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE
Arachis oil	Supermarket		Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used
PrestoBlue cell viability reagent	Thermo Scientific	A13261	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175-046	Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046
17-β Estradiol	Sigma Aldrich	E8875	Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&region=BE
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized	Merck Millipore	SCGPU05RE	http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES	Gibco	11330-032	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	Gibco	10500-056	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amphotericin B	Gibco	15290-018	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750-037	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Sigma Aldrich	D5921	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE
MCDB-105	Sigma Aldrich	M6395	Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE
Insulin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	I1882	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE
Coverslips, glass, 18 mm Ø	Glaswarenfabrik Karl Hecht	1001/18	http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P2636	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C2674	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-094	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	T7409	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300-054	Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable	BD Falcon	352340	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable	BD Falcon	352360	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized	Merck Millipore	SLGP033RS	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acetic acid (glacial) 100%	Merck Millipore	1.00063	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagen I	Corning	354236	From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29#
Pancreatin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	P3292	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile	BD Falcon	353001	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent	VWR Chemicals	20821296	https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)	Cell Signalling Tech	#5741	Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin	Sigma Aldrich	C2562	Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&region=BE
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Affymetrix	19943	http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-11034	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;;
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594	Thermo Scientific	A-11032	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, with calcium and magnesium	Gibco	14040174	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133