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Developmental Biology

माउस के लिए एंडोमेट्रियल उपकला और stromal कोशिकाओं का अलगाव Published: March 2, 2017 doi: 10.3791/55168
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Development and Regeneration, Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन से अलगाव और प्राथमिक माउस एंडोमेट्रियल stromal और उपकला कोशिकाओं की संस्कृति है, जो एक coculture प्रणाली में इस्तेमाल किया जा सकता है इन विट्रो decidualization में अध्ययन करने के लिए एक मानकीकृत और मान्य विधि प्रस्तुत करता है।

Abstract

Decidualization एक प्रोजेस्टेरोन निर्भर एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं के भेदभाव प्रक्रिया है और सफल भ्रूण आरोपण के लिए एक शर्त है। हालांकि कई प्रयासों decidualization की अंतर्निहित तंत्र प्रकट करने के लिए बनाया गया है, उपकला कोशिकाओं है कि भ्रूण और अंतर्निहित stromal कोशिकाओं के साथ संपर्क में हैं के बीच सटीक संकेतन समझ खराब रहता है। इसलिए, एक ही रास्ता है कि खाते में दोनों उपकला और stromal कोशिकाओं लेता decidualization की आणविक विवरण के बारे में हमारे ज्ञान में सुधार सकता है में decidualization पढ़ रही है। इस प्रयोजन के लिए कृत्रिम decidualization के vivo मॉडल में physiologically सबसे अधिक प्रासंगिक हैं; हालांकि, कहनेवाला संचार के हेरफेर सीमित है। वर्तमान में, एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृतियों में कई संकेतन अणुओं द्वारा decidualization के मॉडुलन जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। पारंपरिक, मानव या माउस एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं रहे हैंउपयोग किया गया। बहरहाल, मानव नमूनों की उपलब्धता बहुत बार सीमित है। इसके अलावा, murine ऊतकों के उपयोग के संवर्धन की विधि में विविधता के साथ साथ है। इस अध्ययन में शुद्ध एंडोमेट्रियल उपकला सेल (ईईसी) और stromal सेल (ईएससी) संस्कृतियों वयस्क बरकरार लगातार तीन दिनों के लिए एस्ट्रोजन के साथ इलाज चूहों का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए एक मान्य है और मानकीकृत विधि प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल उपज, व्यवहार्यता, और कोशिकाओं की शुद्धता में सुधार करने के लिए अनुकूलित है और आगे ईईसी और ईएससी के एक coculture में decidualization का अध्ययन करने के क्रम में बढ़ाया गया था। यह मॉडल decidualization में दोनों प्रकार की कोशिकाओं के महत्व को फायदा उठाने के लिए और महत्वपूर्ण संकेत कहनेवाला संचार के दौरान ईईसी या ईएससी द्वारा स्रावित अणुओं के योगदान का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है।

Introduction

मानव अंतर्गर्भाशयकला गर्भाशय की भीतरी परत है और संभव गर्भधारण के लिए एक तैयारी के रूप में टूटने और मरम्मत की मासिक चक्र से होकर गुजरती है। यह गर्भाशय लुमेन और अंतर्निहित स्ट्रोमा जो डिम्बग्रंथि हार्मोन एस्ट्रोजन और प्रोजेस्ट्रोन के उतार चढ़ाव के अनुसार मोटाई में बदलता अस्तर उपकला कोशिकाओं की एक परत के होते हैं। Luteal चरण के दौरान, postovulatory प्रोजेस्टेरोन उछाल बड़े, गोल decidual कोशिकाओं में एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं के भेदभाव, एक प्रक्रिया decidualization 1, 2 बुलाया प्रेरित करेगा। मानव में, इस घटना predecidua फार्म के लिए सहज होता है, लेकिन भ्रूण आरोपण पर और अधिक स्पष्ट हो जाता है। decidualization का एक कार्यात्मक परिणाम यह है कि गर्भाशय क्षणिक भ्रूण आरोपण के लिए ग्रहणशील हो जाता है। इस अंतराल 'आरोपण की खिड़की' के रूप में चिह्नित है। भ्रूण आरोपण के प्रारंभिक काल, decidualized ई के दौरानndometrial stromal दाखिल भ्रूण कोशिकाओं के आसपास भ्रूण 3 के लिए हानिकारक पदार्थों के पारित होने को रोकने के लिए एक बाधा प्रदान करेगा। गर्भावस्था के दौरान, इस पत्या विकासशील भ्रूण के लिए पोषक तत्वों प्रदान करेगा पहले गर्भनाल जगह ले ली है, और बाद में नाल 4 की मातृ हिस्सा बनेगी।

नैतिक और व्यावहारिक दृष्टिकोण decidualization की प्रक्रिया की जांच करने के लिए मानव अध्ययन के डिजाइन की सीमा और पशु मॉडल के उपयोग के लिए प्रेरित किया है। Hemochorial गर्भनाल समूह का सदस्य होने के नाते, मूषक के अंतर्गर्भाशयकला भी decidualization गर्भनाल 5 के लिए पहले से गुजरना होगा। मूषक में, हालांकि, decidualization प्रक्रिया की दीक्षा गर्भाशय लुमेन में ब्लास्टोसिस्ट की उपस्थिति पर निर्भर करता है, यह दर्शाता है कि एक अतिरिक्त प्रोत्साहन decidual प्रतिक्रियाओं 6 को गति प्रदान करने के लिए आवश्यक है। यह वीं के बीच एक जटिल संचार का अर्थब्लास्टोसिस्ट के साथ सीधा संपर्क है कि ई एंडोमेट्रियल उपकला कोशिकाओं, और अंतर्निहित stromal कोशिकाओं। फिर भी, decidualization कृत्रिम रूप से यांत्रिक scratching या एक hormonally primed गर्भाशय में तेल की टपकाना के रूप में उत्तेजनाओं का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता है। हालांकि vivo अध्ययन में कृत्रिम decidualization मॉडल का उपयोग decidualization की जटिल प्रक्रिया सिगनल, यंत्रवत में गहराई से अध्ययन, जैसे हमारे अंतर्दृष्टि में सुधार करने के लिए हमें की अनुमति दी है, उपकला और stromal कोशिकाओं के बीच संचार अपरिहार्य की जांच, सीमित हैं। इसलिए, इन विट्रो decidualization पढ़ाई के महत्वपूर्ण रास्ते में हेरफेर और मौलिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह अंत करने के लिए, प्राथमिक एंडोमेट्रियल stromal सेल संस्कृतियों मानव या कृंतक अंतर्गर्भाशयकला से स्थापित किया जा सकता है। मूषक रोजगार आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के इस्तेमाल decidualization प्रक्रिया के दौरान ब्याज की एक विशेष प्रोटीन की भूमिका की जांच करने के लिए सहमति। हालांकि, अपरिपक्व, prepuberTy चूहों अक्सर, estrous चक्र की जटिलताओं से बचने के लिए, जबकि अन्य मामलों में ग्रीवा estrous चक्र है, जो संस्कृतियों में एक विविधता में परिणाम के सभी चरणों से एकत्र कर रहे हैं क्रम में उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, decidualization की प्रक्रिया संवर्धन के माध्यम के लिए अलग प्रोटोकॉल, जैसे, में अध्ययन किया गया है (मैं) सप्लीमेंट हार्मोन (एस्ट्रोजन, प्रोजेस्ट्रोन या चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर)) द्वारा अथवा (ii) में चूहों से decidual कोशिकाओं के अलगाव (छद्म) गर्भावस्था, जो प्लग जाँच और vasectomized पुरुषों के लिए अतिरिक्त जरूरत को मांग के 4.5 दिन। इन सीमाओं विट्रो decidualization में अध्ययन करने के लिए एक मानकीकृत विधि की आवश्यकता प्रदर्शित करता है। इस अध्ययन में, एक शारीरिक मॉडल वयस्क से शुरू करने में इन विट्रो decidualization जांच करने के लिए, गैर (छद्म) गर्भवती चूहों प्रस्तुत किया जाएगा। इस विधि में, 17β-estradiol (E2) के दैनिक इंजेक्शन एंडोमेट्रियल कोशिकाओं के प्रसार को प्रेरित करेगा, समरूप और पी के एक वृद्धि की उपज है, जिसके परिणामस्वरूपUre सेल आबादी। इसके अलावा, एक coculturing प्रणाली के उपयोग उपकला-stromal crosstalk और विभिन्न स्तरों पर decidualization की प्रक्रिया में हेरफेर करने की क्षमता के अध्ययन की अनुमति देता है।

Protocol

AlexaFluor

इस अध्ययन के लिए सभी पशु प्रयोगों यू लोवेन (बेल्जियम) (परियोजना P174 / 2013) के नैतिक समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। चूहे खाना छर्रों को जी भरकर उपयोग के साथ मानक शर्तों के तहत रखे गए थे, और पानी के नल, और स्थिति नियंत्रित (23 ± 1.5 डिग्री सेल्सियस, सापेक्ष आर्द्रता 40 - 60%, 12/12 / प्रकाश अंधेरे चक्र) के तहत रखा।

1. चूहे

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस तनाव (- 12 सप्ताह पुरानी यानी C57BL / 6, महिला 8) का प्रयोग करें। आमतौर पर, 4 - 5 चूहों आगे के प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का एक उचित मात्रा निकलेगा।
  2. के लिए 17β-estradiol के 100 μL (E2) समाधान (100 एनजी / 100 μL) के साथ subcutaneously बरकरार चूहों इंजेक्षन लगातार 3 डी अलगाव से पहले क्रम में जानवरों की estrous चक्र के चरण का मानकीकरण करने और एंडोमेट्रियल के प्रसार के लिए प्रेरित करने के कोशिकाओं। प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले चूहों के चक्र चरण की जाँच के लिए की जरूरत है परिहार्य बनें3 डी 'एस्ट्राडियोल उपचार के कारण।

2. तैयारी

  1. 100 एनजी / arachis तेल में 100 μL E2 का समाधान करें। पांच चूहों (1.2 में वर्णित) के इंजेक्शन के लिए, 1.5 एमएल की राशि की जरूरत है।
    1. 1 मिलीग्राम / एमएल के एक शेयर समाधान के लिए 1 एमएल इथेनॉल में 1 मिलीग्राम E2 भंग।
    2. arachis तेल में 1000: इस शेयर समाधान 1 पतला।
  2. 500 हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HBBS) 1x 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरित एमएल (आगे के रूप में HBSS + करने के लिए कहा गया है) बनाओ।
  3. फ़िल्टर माउस एंडोमेट्रियल stromal सेल के 500 मिलीलीटर (mESC) संस्कृति mESC के लिए मध्यम: Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम / पोषक तत्व मिश्रण F12 (DMEM / F12) फिनोल लाल, एल glutamine और 4- (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic साथ एसिड, एन - (2-Hydroxyethyl) piperazine- एन '- (2-ethanesulfonic एसिड) (HEPES) 10% FBS, 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल amphotericin बी, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन युक्त (फूrther mESC माध्यम के रूप में करने के लिए कहा गया है)।
  4. decidualization दौरान संस्कृति mESC के लिए फ़िल्टर 2% mESC माध्यम की 500 एमएल बनाओ: फिनोल लाल, एल glutamine और 2% FBS, 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल amphotericin बी युक्त HEPES, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन साथ DMEM / F12।
  5. फ़िल्टर माउस एंडोमेट्रियल उपकला सेल के 500 एमएल तैयार (MEEC) मध्यम: DMEM 10% FBS, 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल amphotericin बी, 100 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन, 25% MCDB-105 मध्यम, और 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन युक्त (आगे के लिए भेजा MEEC माध्यम के रूप में)।
  6. MESC संस्कृति के लिए पाली एल Lysine (पीएलएल) लेपित coverslips तैयार करें।
    1. आसुत जल के 250 एमएल में पीएलएल के 25 मिलीग्राम भंग। समाधान के लिए एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर।
    2. 12 अच्छी तरह से थाली में बाँझ coverslips जोड़ें। भंग पीएलएल के 300 μL coverslips पर जोड़ें।
    3. ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद समाधान निकालें। (- 2 महीने के लिए 1) प्लेटों 4 डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग पर संग्रहित किया जा सकता है।
  7. एक 10 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान ओ तैयारएफ collagenase प्रकार -20 डिग्री सेल्सियस पर 300 μL की आइए और दुकान aliquots। उपयोग करने से पहले फ़िल्टर।

3. तैयारी 24 घंटे के अलगाव से पहले आवश्यक

  1. MEEC संस्कृति के लिए कोलेजन लेपित coverslips तैयार करें।
    1. आसुत जल में एक 0.02 एम एसिटिक एसिड समाधान (coverslip प्रति 1 एमएल) तैयार करें।
    2. 150 μL 0.02 एम एसिटिक एसिड के 12 एमएल में कोलेजन 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ें।
    3. 12 अच्छी तरह से थाली में बाँझ coverslips जोड़ें।
    4. कोलेजन समाधान के 1 एमएल (3.1.2 देखें) जोड़ें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन (कम से कम 12 घंटे)।
      अलगाव के दौरान:
    6. सक्शन द्वारा coverslips बंद कोलेजन समाधान निकालें और यह (लामिना का प्रवाह कैबिनेट में) एक बाँझ वातावरण में हवा शुष्क करते हैं।
    7. coverslips फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार धोएं।
  2. एक 15 एमएल विहित के 10 एमएल युक्त ट्यूब में 0.25 जी pancreatin जोड़कर एक 2.5% pancreatin समाधान तैयारHBSS +। 1 घंटे के लिए शेक (200 आरपीएम) 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान घुलनशीलता बढ़ाने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

4. अलगाव और माउस एंडोमेट्रियल उपकला कोशिकाओं की संस्कृति (MEEC) और माउस एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं (mESC)

  1. trypsin के 25 मिलीग्राम 2.5% pancreatin समाधान (3.2 देखें) एक अंतिम समाधान 0.25% trypsin युक्त (आगे mESC पाचन मिश्रण के रूप में) के साथ खत्म करने वाले एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें।
  2. ग्रीवा का अलगाव
    1. एक योनि धब्बा परीक्षा के साथ पशुओं के चक्र चरण की जाँच करें।
      1. पशु नियंत्रित करना और 50 μL पीबीएस 3 के साथ धीरे योनि फ्लश - 5 बार।
      2. एक गिलास स्लाइड पर अंतिम फ्लश लीजिए।
      3. एक 10x या 20x उद्देश्य का उपयोग एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत सामग्री की जांच करना।
      4. केवल चूहों कि मद चरण में हैं का उपयोग करें। इस चरण में योनि पानी से धोना में श्रृंगित उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति (चित्रा 1 के द्वारा होती है
    2. इस तरह के गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 प्रेरित narcosis के रूप में एक उचित विधि का उपयोग जानवरों euthanize।
    3. आदेश में एक बाँझ वातावरण उत्पन्न करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ शवों स्प्रे।
    4. बाँझ सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करना, पेट और आंतों खोलने तरफ धक्का दोनों गर्भाशय सींग कल्पना करने के लिए।
    5. फैलोपियन ट्यूब के तहत सबसे अधिक बाहर अंत में गर्भाशय सींग को पकड़ो। फैलोपियन ट्यूब से गर्भाशय सींग काटना और वसा और संयोजी ऊतक को हटा दें। गर्भाशय शरीर के ऊपर बाहर अंत में सींग बाहर कट और HBSS + के 3 एमएल के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश में जगह है।
      1. अन्य सींग के लिए और अन्य जानवरों के लिए इस चरण को दोहराएँ जब तक सभी गर्भाशय सींग एकत्र कर रहे हैं।
    6. गर्भाशय सींग (HBSS + में) स्वच्छ आगे एक स्टिरियोस्कोप के तहत और सभी अवशिष्ट वसा या संयोजी ऊतक को हटा दें।
    7. गर्भाशय सींग खुला longitudinally गर्भाशय लुमेन बेनकाब और वें को बदलने के लिए कटसाथ नए सिरे से HBSS + एक नया पेट्री डिश में ई सींग।
    8. pancreatin और trypsin युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब को सभी गर्भाशय सींग स्थानांतरण।
    9. एक कक्षीय प्रकार के बरतन (50 आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए क्षैतिज सेते हैं।
    10. 23 डिग्री सेल्सियस (आरटी) पर 45 मिनट के लिए क्षैतिज सेते हैं, मिलाते हुए बिना।
    11. 37 डिग्री सेल्सियस (पानी से स्नान) पर 15 मिनट के लिए क्षैतिज सेते हैं, मिलाते हुए बिना।
    12. इस बीच 0.05% trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान का 2.7 एमएल में 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase शेयर के 300 μL भंग द्वारा mESC पाचन मिश्रण बनाते हैं।
      नोट: अब से, आगे अलगाव कदम एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट के तहत एक बाँझ वातावरण में प्रदर्शन कर रहे हैं।
  3. माउस एंडोमेट्रियल उपकला सेल (MEEC) संस्कृति
    1. ऊष्मायन के 2 घंटे के बाद, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला समाधान दूर डालना।
    2. ठंड MEEC मध्यम युक्त एक पेट्री डिश में ग्रीवा स्थानांतरण और आदेश trypsin निष्क्रिय करने में 5 मिनट के लिए सेतेगतिविधि।
    3. की ठंड HBSS + 3 एमएल युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब ग्रीवा स्थानांतरण।
    4. 10 एस के लिए भंवर उपकला शीट जारी करने के लिए।
    5. साथ 3 एमएल HBSS + एक साफ पेट्री डिश में ग्रीवा कुल्ला।
    6. दोहराएँ कदम 4.3.2 - 4.3.4 तीन उपकला शीट युक्त निलंबन की कुल प्राप्त करने के लिए।
    7. MESC पाचन मिश्रण करने के लिए ग्रीवा स्थानांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, जबकि (200 आरपीएम) मिलाते (mESC के आगे अलगाव के लिए 4.4 कदम के लिए जाना)।
    8. ऊतक मलबे को हटाने के क्रम में एक 100 माइक्रोन नायलॉन जाल पर धीरे तीन सेल निलंबन pipetting द्वारा उपकला शीट को ठीक।
    9. 5 मिनट के लिए 500 XG पर एकत्र सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
    10. MEEC माध्यम के 12 एमएल में गोली Resuspend और अच्छी तरह मिलाएँ।
    11. आदेश शेष mESC अलग करने के लिए गुरुत्वाकर्षण अवसादन का उपयोग करने में 5 मिनट के लिए समाधान बसा।
    12. एक 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके ध्यान से ऊपरी 2 एमएल निकालें।
    13. सेल suspensio अपकेंद्रित्रn 5 मिनट के लिए 500 XG पर।
    14. धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा MEEC मध्यम में Resuspend।
    15. आगे के प्रयोगों (चित्रा 2A) के लिए वांछित घनत्व में कोलेजन लेपित coverslips पर कोशिकाओं थाली।
    16. 12 घंटे की एक न्यूनतम के लिए एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: immunostaining या फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग तरह कार्यात्मक प्रयोगों के लिए, यह है, जबकि 6 अच्छी तरह से थाली में बोने जब शाही सेना या प्रोटीन अलगाव वांछित है की सिफारिश की है कोशिकाओं coverslips पर सीधे प्लेट की सलाह दी है। माउस एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं के अलगाव केवल एक पाचन के बाद कोशिकाओं की शुद्धता के रूप में दो राउंड में बांटा गया है अपर्याप्त हो सकता है। ग्रीवा एक इष्टतम सेल स्वस्थ हो जाना और पवित्रता के लिए दो बार पचा रहे हैं। दोनों राउंड में तकनीकी हस्तक्षेप समान हैं। दोनों राउंड से एकत्र की कोशिकाओं, आगे के प्रयोगों के लिए रखा जा सकता है के रूप में शोधकर्ता द्वारा वांछित।
  4. माउस एंडोमेट्रियल StrOmal सेल (mESC) संस्कृति: 1 सेंट दौर
    1. पहले पाचन दौर की शुरुआत से पहले, 2.7 एमएल 0.05% trypsin EDTA समाधान में 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase शेयर के 300 μL भंग द्वारा एक दूसरे पाचन मिश्रण तैयार करें। इस मिश्रण कदम 4.4.8 में की जरूरत है।
    2. साथ ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) HBSS + और mESC माध्यम के 3 एमएल के साथ 3 एक्स 15 एमएल ट्यूब (ट्यूब X1, X2 और X3) तीन छोटे पेट्री डिश तैयार करें।
    3. ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद, 10 एस के लिए ग्रीवा युक्त trypsin समाधान धीरे हिला। MESC कोशिकाओं गर्भाशय ऊतक से अलग होगा और trypsin समाधान में रहेगा।
    4. ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) HBSS + 3 एमएल युक्त पहला पेट्री डिश के लिए ग्रीवा स्थानांतरण और अच्छी तरह कुल्ला।
    5. MESC माध्यम की 3 एमएल मूल (कदम 4.4.3 में ट्यूब) गर्भाशय सींग युक्त ट्यूब को जोड़ने trypsin गतिविधि को बाधित करने के लिए।
    6. HBSS + ट्यूब mESC माध्यम के 3 एमएल युक्त X1 के लिए ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ पेट्री डिश से ग्रीवा स्थानांतरण और 10 एस के लिए धीरे हिला। दोहराएँ कदम 4.4.4 (ठंड (4 डिग्री सेल्सियस के साथ एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण) HBSS +) और 4.4.6 दो बार (ट्यूब X2 और X3 के लिए स्थानांतरण)।
      नोट: अंत में, इस प्रोटोकॉल 4 सेल निलंबन में परिणाम होगा: एक ट्यूब trypsin समाधान और mESC युक्त mESC माध्यम के साथ 3 ट्यूब (नलियों X1, X2 और X3) युक्त।
    7. नई mESC पाचन में ग्रीवा स्थानांतरण, कदम 4.4.1 में वर्णित के रूप में और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, खड़ी।
    8. एक 40 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से चार सेल निलंबन से गुजर रहा stromal कोशिकाओं लीजिए। MESC की एक अतिरिक्त 5 एमएल के साथ जाल कुल्ला।
    9. 7 मिनट के लिए 500 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
    10. वांछित घनत्व के साथ आगे के प्रयोगों के लिए पीएलएल लेपित coverslips पर mESC और प्लेट में गोली Resuspend।
    11. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे या हे / एन - 4 की एक न्यूनतम के लिए सेते हैं।
  5. माउस एंडोमेट्रियल stromal सेल (mESC) संस्कृति: 2 एन डी दौर <राजभाषा>
  6. साथ ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) HBSS + और mESC माध्यम के 3 एमएल के साथ 3 एक्स 15 एमएल ट्यूब (ट्यूब Y1, Y2 और Y3) तीन छोटे पेट्री डिश तैयार करें।
  7. 4.4.7 - दोहराएँ 4.4.3 कदम।
  8. एक 40 माइक्रोन नायलॉन जाल करने के लिए ग्रीवा के साथ मिलकर पिछले सेल निलंबन स्थानांतरण।
  9. नायलॉन जाल के माध्यम से ट्यूब Y1, Y2 और Y3 की सामग्री से गुजर रहा stromal कोशिकाओं लीजिए। MESC की एक अतिरिक्त 5 एमएल के साथ जाल कुल्ला।
  10. 7 मिनट के लिए 500 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
  11. आगे के प्रयोगों (चित्रा 2 बी) के लिए पीएलएल लेपित coverslips पर mESC मध्यम और प्लेट में गोली Resuspend।
  12. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे - 4 की एक न्यूनतम के लिए सेते हैं।
    नोट: immunostaining या फ्लोरोसेंट कैल्शियम इमेजिंग तरह कार्यात्मक प्रयोगों के लिए, यह है, जबकि 6 अच्छी तरह से थाली में बोने जब शाही सेना या प्रोटीन अलगाव वांछित है की सिफारिश की है coverslips पर कोशिकाओं थाली करने के लिए सलाह दी है।

5. vimentin/ शुद्ध MEEC और mESC संस्कृतियों के सत्यापन के लिए Cytokeratin डबल धुंधला

  1. coverslips पर कोशिकाओं बीज।
  2. पीबीएस एक कक्षीय प्रकार के बरतन (50 आरपीएम) पर कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त के साथ 3 एक्स 5 मिनट धो लें।
  3. 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) (चेतावनी!) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, बरतन पर नहीं।
  4. कैल्शियम और शेखर (50 आरपीएम) पर मैग्नीशियम के बिना पीबीएस के साथ 3x धो लें।
  5. एक प्रकार के बरतन (50 आरपीएम) पर 10 मिनट के लिए 0.2% ट्राइटन X-100 के साथ कोशिकाओं Permeabilize।
  6. एक प्रकार के बरतन पर पीबीएस के साथ धो 3x।
  7. 5% बकरी एक प्रकार के बरतन पर 2 घंटे के लिए पीबीएस में सीरम (जीएस) के साथ ब्लॉक (50 आरपीएम)
  8. एक प्रकार के बरतन (50 आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर (: 500 1) और मोनोक्लोनल माउस विरोधी मानव pancytokeratin (1000 1) मोनोक्लोनल खरगोश विरोधी मानव vimentin के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। एंटीबॉडी 0.5% जीएस साथ पीबीएस में पतला कर रहे हैं।
  9. एक प्रकार के बरतन (50 आरपीएम) पर पीबीएस के साथ धो 3x।
  10. एलेक्सा स्त्राव 488 संयुग्मित विरोधी खरगोश आईजीजी और एलेक्सा स्त्राव 488 conju: (0.5% जीएस में 1,000 1) माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को सेतेएक प्रकार के बरतन पर gated विरोधी माउस आईजीजी।
  11. एक प्रकार के बरतन पर पीबीएस के साथ धो 3x।
  12. माउंट जलीय बढ़ते मध्यम DAPI और सूखी हे / एन युक्त के साथ स्लाइड।
  13. नेल पॉलिश के साथ स्लाइड सील और पर आगे उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रख (चित्रा 2A, बी)।

6. एक coculture प्रणाली इन विट्रो Decidualization में

नोट: चार से पांच जानवरों 24 अच्छी तरह से थाली में एक coculture प्रणाली स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं। एक बाँझ वातावरण में निम्नलिखित प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें, अधिमानतः एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट के तहत।

  1. एक अतिरिक्त 24 अच्छी तरह से थाली में उपकला सेल अलगाव (4.3 में वर्णित के रूप में) की centrifugation और / या ऊष्मायन चरणों के दौरान सेल संस्कृति सम्मिलित तैयार करें।
    1. MESC माध्यम के 400 μL 24 अच्छी तरह से थाली में कुओं के वांछित राशि में - 200 जोड़े।
    2. बाँझ संदंश का उपयोग प्रीफिल्ड 24 कुओं में सम्मिलित रखें।
  2. MEEC गोली ResuspendMEEC मध्यम और सम्मिलित भर में डिवाइड में (कदम 4.3.14) (काम की मात्रा: 150 - डालने के प्रति 300 μL)। संस्कृति एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं।
  3. stromal सेल अलगाव के दूसरे दौर (कदम 4.5.6) के बाद एक और 24 अच्छी तरह से थाली में stromal कोशिकाओं (सेल संस्कृति आवेषण के साथ संगत) बीज। अच्छी तरह से प्रति 400 μL सेल निलंबन के एक काम की मात्रा का प्रयोग करें।
  4. एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे - stromal कोशिकाओं कम से कम 4 के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति दें।
  5. सेकंड 24 अच्छी तरह से थाली stromal कोशिकाओं द्वारा कवर में सेल संस्कृति पहले 24 अच्छी तरह से थाली से उपकला कोशिकाओं के साथ कवर सम्मिलित स्थानांतरण। निष्फल संदंश का प्रयोग करें या केवल उनकी फांसी पैर में सम्मिलित स्पर्श करें।
  6. संस्कृति में 3 की अवधि के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं - 90% confluency - उपकला कोशिकाओं तक 5 डी एक monolayer और stromal कोशिकाओं को प्राप्त 80 के रूप में। इसके अतिरिक्त, का उपयोग Transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीर)के रूप में अनुदान एट अल द्वारा वर्णित एक वाल्ट / ओम उपकला मीटर के उपयोग के द्वारा उपकला monolayer नजर रखने के लिए। 7। 800-1000 / अच्छी तरह के मान उपकला monolayer मिला हुआ विचार करने के लिए पर्याप्त थे।
  7. कांच pipettes या ठीक pipet सुझावों का उपयोग कर 3 डी - यदि आवश्यक हो, मध्यम हर 2 की जगह। stromal कोशिकाओं (तल पर वरीयता प्राप्त) के माध्यम के प्रतिस्थापन के साथ शुरू करो, सम्मिलित में मध्यम जगह से पहले। यह 37 डिग्री सेल्सियस पर preheated सेल संस्कृति के माध्यम का उपयोग करने की सिफारिश की है।
  8. प्रयोग शुरू करने से पहले इन विट्रो decidualization में प्रेरित करने के लिए decidualization मध्यम तैयार। stromal कोशिकाओं की अच्छी तरह से प्रति 400 μL का एक काम की मात्रा का प्रयोग करें।
    1. -20 डिग्री सेल्सियस पर निम्नलिखित स्टॉक समाधान और दुकान aliquots तैयार करें।
      1. 250 माइक्रोन के medroxyprogesterone इथेनॉल में 17 एसीटेट (एमपीए) तैयार करें।
      2. 100 मिमी शेयर समाधान 8 Bromoadenosine 3 ', 5'- ultrapure पानी में शिविर तैयार।
    2. 1 माइक्रोन एमपीए और mESC 2% FBS युक्त मध्यम में 0.5 मिमी शिविर युक्त decidual मध्यम बनाओ।
  9. धीरे कुओं से मध्यम हटाने और stromal कोशिकाओं पर decidual माध्यम जोड़ें। एक नियंत्रण हालत की जरूरत है, 2% FBS युक्त mESC माध्यम का उपयोग।
  10. सेल संस्कृति आवेषण से मध्यम निकालें और कोशिकाओं पर MEEC माध्यम के 300 μL जोड़ें।
  11. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 5 डी के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  12. पांचवें दिन के बाद, आर टी-qPCR द्वारा stromal कोशिकाओं में decidualization की सीमा का आकलन (देखें नीचे)।
  13. Resazurin आधारित व्यवहार्यता अभिकर्मक का उपयोग उपकला कोशिकाओं की व्यवहार्यता मान्य।
    1. MEEC माध्यम में व्यवहार्यता अभिकर्मक की एक 1:10 समाधान तैयार है।
    2. एक नया 24 अच्छी तरह से थाली में सेल संस्कृति आवेषण स्थानांतरण।
    3. व्यवहार्यता अभिकर्मक के 300 μL - - MEEC समाधान कोशिकाओं पर 150 जोड़े।
    4. 5% सीओ 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेतेकम से कम 4 - 5 घंटे या रात भर और एक रंग परिवर्तन (बैंगनी / गुलाबी नीला) को देख कर सेल व्यवहार्यता का आकलन करें।
      ध्यान दें: Decidualization भी, के रूप में शोधकर्ता द्वारा पसंद एक माउस प्रोलैक्टिन-विशिष्ट एलिसा का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है।

QRT- पीसीआर द्वारा Decidualization की 7.Validation

नोट: QRT- पीसीआर द्वारा decidualization के सत्यापन के लिए, यह क्रम में शाही सेना के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए दो प्रतियों में सभी परीक्षण शर्तों प्रदर्शन करने की सिफारिश की है।
मात्रात्मक आरटी पीसीआर के रूप में डी CLERCQ एट अल में पहले से वर्णित किया जाता है। 8।
संक्षेप में:

  1. कुल शाही सेना के एक वाणिज्यिक आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर अलग।
    1. मात्रा और आरएनए निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक तरीकों का उपयोग कर की गुणवत्ता का आकलन, क्रमशः।
  2. सीडीएनए संश्लेषण निर्माता प्रोटोकॉल कुल शाही सेना के 1 माइक्रोग्राम से शुरू के अनुसार।
  3. QRT- पीसीआर प्रतिक्रिया से बाहर ले जाने के लिए निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट का प्रयोग करें।
    1. तीन प्रतियों में सभी नमूनों चलाएँ।
    2. प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले जाने के लिए वांछित गृह व्यवस्था जीन और प्रोलैक्टिन (prl8a2) के लिए वाणिज्यिक TaqMan मास्टर मिक्स और विशिष्ट TaqMan जांच का उपयोग करें।

Representative Results

प्रोटोकॉल के जनरल अवलोकन

चित्रा 1 ए प्रोटोकॉल की एक सामान्य अवलोकन दिखाता है। लगातार तीन दिनों के लिए E2 (100 एनजी) के एक दैनिक इंजेक्शन जानवरों सिंक्रनाइज़ और estrous चक्र के चरण के मानकीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था। estrous चक्र योनि lavages द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है और proestrus, मद, diestrus, और metestrus चरण में बांटा गया है। चक्र चरण पानी से धोना में desquamated कोशिकाओं है, जो हार्मोनल परिवर्तन के अधीन हैं के अनुपात के अनुसार नामित किया जा सकता है। एस्ट्रोजन का स्तर बढ़ने जानवरों मद चरण के लिए तैयार कर देगा। इस चरण में आसानी से विशेष रूप से श्रृंगित उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति और ल्यूकोसाइट्स की अनुपस्थिति (चित्रा 1 बी) द्वारा पता लगाया जा सकता है। 4 दिन, जानवरों है कि मद चरण में हैं की ग्रीवा एकत्र कर रहे हैं और MEEC और mESC अलग कर रहे हैं (चित्रा 1 सी)। Decidualization गएक 5 डी के एक ऊष्मायन अवधि के दौरान 0.5 मिमी शिविर और 1 माइक्रोन 2% FBS के माध्यम के लिए एमपीए जोड़कर प्रेरित किया जा।

MEEC और mESC संस्कृतियों की गुणवत्ता नियंत्रण

प्राथमिक सेल संस्कृतियों की पवित्रता vimentin और cytokeratin अभिव्यक्ति में अंतर द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। Vimentin एक मध्यवर्ती रेशा कि mesenchymal कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, इसलिए एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं में है। Cytokeratin एक मध्यवर्ती रेशा उपकला ऊतक के cytoskeleton में पाया जाता है। चित्रा 2A चलता vimentin और MEEC और mESC में cytokeratin के mRNA अभिव्यक्ति के स्तर QRT- पीसीआर का उपयोग कर का आकलन किया। Vimentin स्तरों MEEC में mESC में उच्च और निम्न हैं (2.2x उच्च, पी <0.001), cytokeratin स्तरों mESC में MEEC में उच्च और कम कर रहे हैं, जबकि (36x उच्च, पी <0.001)। एक vimentin / cytokeratin डबल धुंधला प्रदर्शन किया गया था और संकेत दिया कि stromal कोशिकाओं जबकि epit vimentin का इजहारhelial कोशिकाओं cytokeratin व्यक्त (चित्रा 2 बी, सी)। प्राथमिक एंटीबॉडी के अभाव immunostaining (चित्रा 2 डी, ई) के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ये immunohistological stainings बताते हैं कि दोनों एंडोमेट्रियल सेल संस्कृतियों (MEEC और mESC) अप करने के लिए 90% की एक पवित्रता है।

MEEC / mESC cocultures में Decidualization

अलगाव के बाद, माउस एंडोमेट्रियल और stromal कोशिकाओं एंडोमेट्रियल पर्यावरण नकल करने के लिए एक सह संस्कृति प्रणाली में वरीयता प्राप्त थे। जब तक उपकला कोशिकाओं (800 Teer मूल्यों - 1,000 / अच्छी तरह से) सेल संस्कृति डालने में एक monolayer का गठन कोशिकाओं सुसंस्कृत थे, और stromal कोशिकाओं एक उप मिला हुआ राज्य पर पहुंच गया। Decidualization 0.5 मिमी शिविर के आवेदन और 1 माइक्रोन एमपीए के साथ stromal कोशिकाओं में प्रेरित किया गया था। ऊष्मायन के पांच दिनों के बाद, प्रोलैक्टिन mRNA स्तर decid के लिए एक संकेत के रूप QRT- पीसीआर द्वारा stromal कोशिकाओं में मूल्यांकन किया गयाualization (चित्रा 3 ए)। प्रोलैक्टिन स्तर को अत्यधिक कोशिकाओं नियंत्रण मध्यम (पी <0.01) के साथ incubated कोशिकाओं में हार्मोन के अधीन है और nondetectable में व्यक्त किया गया।

चूंकि उपकला कोशिकाओं सेल संस्कृति आवेषण के अंदर कल्पना करने के लिए मेहनत कर रहे हैं, एक व्यवहार्यता परख पांच दिन ऊष्मायन अवधि (चित्रा 3 बी) के तुरंत बाद किया गया था। सामान्य मध्यम विकास और एक व्यवहार्यता अभिकर्मक का एक मिश्रण कुओं को जोड़ा गया और कम से कम 8 की अवधि के लिए incubated था - 12 h। उज्ज्वल गुलाबी नीले रंग से रंग परिवर्तन व्यवहार्य उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत दिया। ध्यान दें कि रंग परिवर्तन तभी दिया जाएगा जब व्यवहार्य कोशिकाओं में मौजूद हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का सिंहावलोकन। (ए) अलगाव प्रोटोकॉल की योजना तीन से शुरूएस्ट्रोजन इंजेक्शन के लगातार दिन। 3 दिन, आवश्यक तैयारी के लिए तैयार रहना चाहिए। 4 दिन, मद चरण (स्टार ने संकेत दिया) मूल्यांकन किया जाता है एक योनि पानी से धोना प्रदर्शन से। MESC और MEEC अलग पाचन चरणों का उपयोग कर अलग कर रहे हैं। 6 दिन पर, या जब कोशिकाओं मिला हुआ हैं, decidualization सह संस्कृति प्रणाली में मध्यम और पांच दिन के एक ऊष्मायन अवधि (- 11 दिन 6) शिविर और एमपीए जोड़कर प्रेरित किया जा सकता है। (बी) योनि पानी से धोना में श्रृंगित उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति द्वारा विशेषता मद चरण के प्रतिनिधि तस्वीर (बढ़ाई 10X)। (सी) mESC और MEEC के प्रतिनिधि तस्वीर (बढ़ाई 20X, पैमाने पर पट्टी: 100 माइक्रोन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
(ए) vimentin और cytokeratin अभिव्यक्ति की मैसेंजर आरएनए स्तरों संस्कृतियों की पवित्रता को इंगित करने के लिए। आरएनए का स्तर अपेक्षाकृत गृह व्यवस्था जीन ACTB और TBP की ज्यामितीय मतलब करने के लिए मात्रा निर्धारित किया गया। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में दिखाया गया है। MESC संस्कृतियों (बी) और MEEC संस्कृतियों (सी) पर vimentin / cytokeratin डबल धुंधला। बाएँ में सम्मिलित एक 63x बढ़ाई दृश्य दिखाता है। MESC (डी) और MEEC (ई) के लिए छोड़े गए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नकारात्मक नियंत्रण (स्केल पट्टी: 50 माइक्रोन)। ***: P <कई परीक्षण के लिए Bonferroni सुधार के साथ दो तरह एनोवा के साथ 0,001। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3: आरटी पीसीआर के माध्यम से Decidualization के मान्यकरण। (ए) mRNA stromal कोशिकाओं में प्रोलैक्टिन अभिव्यक्ति के स्तर decidualization मूल्यांकन करने के लिए। आरएनए का स्तर अपेक्षाकृत गृह व्यवस्था जीन PGK1 और TBP की ज्यामितीय मतलब करने के लिए मात्रा निर्धारित किया गया। नियंत्रण या decidual माध्यम में संवर्धित कोशिकाओं में गुना परिवर्तन ± SEM के मतलब के रूप में दिखाया गया है। (बी) से पहले (ऊपर) और बाद (नीचे) decidualization प्रोत्साहन stromal कोशिकाओं की निदर्शी तस्वीरें। सही पर डालने के एक decidualized stromal सेल के एक बढ़ाई दिखाता है। Decidualization multinucleated कोशिकाओं की उपस्थिति, काला तीर द्वारा संकेत के द्वारा होती है। (सी) परख के बाद डालने में उपकला सेल व्यवहार्यता के आकलन के प्रतिनिधि छवियाँ। चित्र व्यवहार्यता अभिकर्मक के प्रशासन (Prestoblue) (0 एच) और एफ के बाद तुरंत ले जाया गयाollowing सुबह (पर)। **: पी <मान व्हिटनी यू परीक्षण के साथ 0.01। पर: रात भर। स्केल पट्टी: 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

Decidualization दौर स्रावित decidual कोशिकाओं में एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं की प्रोजेस्टेरोन निर्भर भेदभाव है। मानव में, इस प्रक्रिया को मासिक धर्म चक्र के luteal चरण के दौरान सहज होता है और नाड़ी कोशिकाओं के आसपास predecidua के लिए फार्म stromal कोशिकाओं में शुरू की है। हालांकि, मूषक, एक ब्लास्टोसिस्ट की उपस्थिति अनिवार्य decidualization प्रेरित करने के लिए है। तथ्य यह है कि decidualization केवल एंडोमेट्रियल उपकला कोशिकाओं के साथ संपर्क के बाद होता है तात्पर्य है कि महत्वपूर्ण कारकों में अंतर्निहित स्ट्रोमा में decidualization प्रेरित करने के लिए उपकला कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं। हालांकि decidualization प्रक्रिया की दीक्षा में इस अंतर को स्वीकार किया जाना चाहिए, तथ्य यह है कि मानव भ्रूण आरोपण decidualization पर और अधिक मजबूत हो जाता है पता चलता है कि इसी तरह के तंत्र को शामिल किया जा सकता है। इन विट्रो में सेल संस्कृतियों अक्सर decidualization की प्रक्रिया के दौरान विशिष्ट अणुओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।फिर भी, उपलब्धता और मानव ऊतकों की राशि एकत्र किया जा सकता है कि अक्सर सीमित है और विविधताओं, जैसे, चक्र चरण, गर्भधारण की संख्या और endometriosis या ग्रंथिपेश्यर्बुदता तरह gynecological रोगों की उपस्थिति के साथ है। इन मुद्दों में से कई murine ऊतक का उपयोग करें कि आसानी से सुलभ और चक्र चरण स्वतंत्र है के द्वारा रोका जा सकता है। murine ऊतक का उपयोग करने का एक और मजबूत लाभ आनुवंशिक रूप से संशोधित मूषक उपयोग करने का अवसर और प्रयोगों की एक बड़ी संख्या सेटअप करने के लिए संभावना है। फिलहाल, कई अलग अलग अलगाव प्रोटोकॉल जानवरों की उम्र में उच्च परिवर्तनशीलता और उपयोग के क्षण में मद चरण में अवधि के साथ साहित्य में वर्णित किया गया है।

इस अध्ययन stromal और उपकला कोशिकाओं के प्राथमिक एंडोमेट्रियल सह संस्कृतियों में जो लाभ अलगाव से पहले एस्ट्रोजन का एक दैनिक इंजेक्शन द्वारा एक मानकीकृत estrous चक्र के लिए लिया गया था के लिए एक नई विधि प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, एस्ट्रोजन कश्मीर हैNown उपकला और stromal कोशिकाओं जो आगे अलगाव प्रति पैदावार बढ़ जाती है में प्रसार प्रेरित करने के लिए। अलगाव इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल अनुदान एट अल के आधार पर किया गया था। 7, हालांकि, आगे अनुकूलन कदम उपज, पवित्रता, और अलग अलग सेल संस्कृतियों की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए शामिल किया गया है। सबसे पहले, HBSS हमेशा एंटीबायोटिक दवाओं के साथ सहारा लिया जाता था प्राथमिक संस्कृति के संक्रमण से बचने के लिए। MEEC के अलगाव के दौरान, एक तापमान रूपांतर किया गया था (37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट) पहली पाचन के दौरान उपकला कोशिकाओं की फसल बढ़ाने के लिए। इसके बाद, एक अतिरिक्त कदम FBS युक्त अपनी गतिविधि को बाधित करने के लिए मध्यम जोड़कर trypsin पाचन के बाद enzymatic गतिविधि गुस्सा करने के लिए शामिल किया गया था। इसके अलावा, MEECs एक फिल्टर जिनमें से जाल है जो आमतौर पर वर्णन किया गया है (100 माइक्रोन) के रूप में वे अक्सर समूहों और सेल शीट में आने से बड़ा था के माध्यम से पारित किए गए। इसके अलावा, stromal कोशिकाओं द्वारा संक्रमण एक ऐड के प्रदर्शन से कम हो गया थाitional कदम जिसमें MEECs और MESCs गुरुत्वाकर्षण अवसादन के आधार पर अलग हो गए थे। अंत में, MEECs, कांच coverslips के लिए कोशिकाओं की कुर्की बढ़ाने के लिए कोलेजन लेपित coverslips पर वरीयता प्राप्त थे के रूप में यह स्पष्ट हो गया कि uncoated या पीएलएल लेपित गिलास coverslips के लिए लगाव अपर्याप्त था। MESCs के अलगाव के दौरान, कोलैजिनेज़ (1 मिलीग्राम / एमएल) के पाचन में सुधार करने के लिए सहारा लिया जाता था। इसके अलावा, इस कदम पाचन दो प्रतियों में प्रदर्शन किया गया था शेष MEECs के संक्रमण से बचने के लिए। इन सभी अतिरिक्त कदम समरूप सेल आबादी के शुद्ध और व्यवहार्य संस्कृतियों में हुई।

सेल की आबादी की शुद्धता immunostaining और QRT- पीसीआर एक stromal मार्कर और एक उपकला मार्कर के रूप में के रूप में cytokeratin vimentin उपयोग कर के साथ मूल्यांकन किया गया था। जाहिर है, vimentin और cytokeratin के एक विपरीत अभिव्यक्ति पैटर्न MEEC और mESC में मनाया गया। हालांकि, यह देखा जा सकता है कि vimentin और cytokeratin के रिश्तेदार mRNA अभिव्यक्ति MEEC संस्कृतियों में समान है। Similगिरफ्तारी के परिणाम, अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा प्रकाशित कर रहे हैं जो संस्कृति के अधिग्रहण vimentin अभिव्यक्ति 9 में उपकला कोशिकाओं में। अधिक महत्वपूर्ण vimentin और cytokeratin के रूप में अलग सेल आबादी के immunohistological stainings में मनाया गया के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति में अंतर है। डबल immunostaining से पता चला कि EECS cytokeratin के लिए सकारात्मक थे और ईएससी vimentin के लिए सकारात्मक थे। Immunostaining में इन मार्कर के उपयोग की स्थापना की एक विधि है और standardly प्रकार के 10 सेल का संकेत किया।

हालांकि अनुसंधान के एक बहुत mESC की decidualization पर प्रदर्शन किया गया है, यह संभव है कि इस मॉडल में उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति decidualization के परिणाम बदल सकता है। सबसे पहले, यह दिखाया गया है कि अगर MEEC mESC-वातानुकूलित माध्यम की उपस्थिति में या एक सह-संस्कृति की स्थापना में एक monolayer करने के लिए विकसित, monolayer एक बेहतर उपकला कोशिका transepithelial विद्युत प्रतिरोध (है कितीर), mESC 7 से स्रावित कारकों से उत्पन्न। इसके अलावा, Pierro एट अल। 11 सबूत है कि उपकला प्रसार, 17β-estradiol से प्रभावित है, stromal कोशिकाओं से स्रावित कारकों द्वारा मध्यस्थता किया जा सकता है प्रदान की है, और वैकल्पिक रूप से, उपकला कोशिकाओं कारक है कि stromal decidualization 12, 13 मिलाना जारी कर सकते हैं। कुल मिलाकर, यह स्पष्ट है कि उपकला-stromal सह संस्कृति वातावरण एक अधिक शारीरिक स्थिति है कि पैराक्राइन संपर्क और संचार के लिए अनुमति देता है प्रदान करता है। एक डालने के सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हुए दो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं संवर्धन की विधि पहले 14, 15 में वर्णित किया गया और murine प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। decidualization के लिए एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में प्रोलैक्टिन mRNA स्तर का पता लगाने के द्वारा, वर्णित तकनीक उपलब्ध है और अनुमति देने के decidualization के लिए एक बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पढ़ने के लिए बाहर हैजिससे decidualization दौरान उपकला-stromal संबंध का अध्ययन है। पैराक्राइन MEEC से मध्यस्थता संकेतों stromal कोशिकाओं में decidualization की हद तक बदल सकता है। इसके अलावा, मॉडल सीधे stromal कोशिकाओं को प्रभावित किए बिना उपकला पक्ष के विशिष्ट मॉडुलन के लिए अनुमति देता है। इसलिए, MEEC और mESC के इस सह संस्कृति हार्मोन, साइटोकिन्स, stromal decidualization पर एक पढ़ने के लिए बाहर के साथ उपकला कोशिकाओं पर आदि के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक उत्तम साधन प्रदान करता है। इस प्रणाली सह संस्कृति का एक अन्य लाभ यह है कि शोधकर्ताओं ने ट्रांसजेनिक जानवरों से अलग कक्षों का उपयोग करके या तो उपकला या stromal डिब्बे में decidualization-प्रक्रिया में एक विशिष्ट प्रोटीन की संलिप्तता की जांच करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तकनीक को ब्लास्टोसिस्ट आसंजन की जांच करने का मूल्यांकन करने के लिए है कि क्या एक ब्लास्टोसिस्ट की उपस्थिति में उपकला कोशिकाओं द्वारा स्रावित पैराक्राइन कारकों अंतर्निहित stromal की decidualization प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हैं बहुत उपयोगी हो जाएगाकोशिकाओं। trophoblast आक्रमण में एक महत्वपूर्ण कदम बाह्य मैट्रिक्स गिरावट है, जो एंजाइमों की कार्रवाई से मध्यस्थता है के लिए सहसंबद्ध। प्रस्तावित तकनीक ब्लास्टोसिस्ट, उपकला कोशिकाओं और समर्थन स्ट्रोमा के बीच परस्पर बात की जांच करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में लागू किया जा सकता है।

हालांकि, इस समय थोड़ा उपकला कोशिकाओं के रूप में जो अच्छी तरह से ग्रंथियों के रूप में हो सकता है ल्यूमिनल की उत्पत्ति के बारे में जाना जाता है। इसलिए, उपकला कोशिकाओं के आनुवंशिक और आणविक प्रोफ़ाइल के आगे लक्षण वर्णन आवश्यक है। इसके अलावा, वर्णित विधि उपकला कोशिकाओं के ध्रुवीकरण के बारे में उपलब्ध ज्ञान में सीमित है। फिलहाल, उपकला कोशिकाओं के ध्रुवीकरण खाते में नहीं लिया गया था। हालांकि, झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति में मतभेद शिखर और बेसल झिल्ली में वर्णित हैं। उपकला परत के अनुचित ध्रुवीकरण epitheli के बीच पैराक्राइन बातचीत पर असर हो सकता हैअल और stromal कोशिकाओं। हालांकि, तरीकों ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं वर्णित किया गया है प्राप्त करने के लिए और वर्णित तकनीक 15, 16 में शामिल किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, वर्णित प्रोटोकॉल एक तकनीक को सफलतापूर्वक माउस एंडोमेट्रियल उपकला और stromal कोशिकाओं के प्राथमिक सेल संस्कृतियों की स्थापना का प्रस्ताव है। इस तकनीक को शुद्ध सेल संस्कृतियों में यह परिणाम के रूप में QRT- पीसीआर द्वारा की पुष्टि की और vimentin और cytokeratin के immunostaining। अंत में, एक उपकला और stromal सह संस्कृति पेश किया गया था कि decidualization प्रक्रिया में या तो MEEC और / या mESC द्वारा मध्यस्थता पैराक्राइन संकेतों की जांच के लिए अनुमति देता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के रिसर्च फाउंडेशन-फ़्लैंडर्स (FWO G.0856.13N) और यू लोवेन का अनुसंधान परिषद (ओटी / 13/113) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। KDC FWO बेल्जियम द्वारा वित्त पोषित है। एएच ओटी / 13/113 द्वारा वित्त पोषित है। हम confocal खुर्दबीन के उपयोग के लिए यू लोवेन (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) की सेल इमेजिंग कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant Greiner Bio-one 662610 Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore.
https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/
0110_0110_0090_0030/13408/ 
Nunc Cell culture treated 24 well plates Thermo Scientific 142475 http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt Sigma Aldrich B7880 Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE 
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma Aldrich M1629 Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE 
Arachis oil Supermarket Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used
PrestoBlue cell viability reagent Thermo Scientific A13261 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175-046 Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 
17-β Estradiol Sigma Aldrich E8875 Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000).
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&region=BE
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized Merck Millipore SCGPU05RE http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070-063 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES Gibco 11330-032 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin Gibco 10500-056 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amphotericin B Gibco 15290-018 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15750-037 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Sigma Aldrich D5921 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE
MCDB-105 Sigma Aldrich M6395 Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE 
Insulin from bovine pancreas Sigma Aldrich I1882 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE
Coverslips, glass, 18 mm Ø Glaswarenfabrik Karl Hecht 1001/18 http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937
&tx_rmproducts_pi1[p]=3504
&tx_rmproducts_pi1[v]=20088
&cHash=abd12065683fe74b00eaa
5e562824d06
Poly-L-lysine Sigma Aldrich P2636 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C2674 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-094 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich T7409 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-054 Warm to room temperature before use.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable BD Falcon 352340 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable BD Falcon 352360 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized Merck Millipore SLGP033RS https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acetic acid (glacial) 100% Merck Millipore 1.00063 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagen I Corning  354236 From rat tail.
https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&
productid=354236%28
Lifesciences%29# 
Pancreatin from porcine pancreas Sigma Aldrich P3292 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile BD Falcon 353001 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent VWR Chemicals 20821296 https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)  Cell Signalling Tech #5741 Use 1/500.
http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin  Sigma Aldrich C2562 Use 1/1,000.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&region=BE
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Affymetrix 19943 http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid=
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Goat serum Sigma Aldrich G9023 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE
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VECTASHIELD mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, with calcium and magnesium Gibco 14040174 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133

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References

  1. Cummings, A. M., Yochim, J. M. Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone. J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).
  2. Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
  3. Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).
  4. Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).
  5. Power, M. L., Schulkin, J. The evolution of the human placenta. , Johns Hopkins University Press. (2012).
  6. Finn, C. A. The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse. J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).
  7. Grant, K. S., Wira, C. R. Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture. Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).
  8. De Clercq, K., et al. Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle. Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).
  9. Pieper, F. R., et al. Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells. Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).
  10. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  11. Pierro, E., et al. Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium. Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).
  12. Kim, M. R., et al. Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells. Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).
  13. Chen, J. C., et al. Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production. Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).
  14. Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. J Vis Exp. (113), (2016).
  15. Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model. Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).
  16. Park, D. W., et al. A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion. Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).

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माउस के लिए एंडोमेट्रियल उपकला और stromal कोशिकाओं का अलगाव<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Decidualization
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De Clercq, K., Hennes, A., Vriens,… More

De Clercq, K., Hennes, A., Vriens, J. Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (121), e55168, doi:10.3791/55168 (2017).

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