Summary
私たちは、網膜の表面に平行に切片化の面で大人の哺乳類の網膜の水平スライス標本を開発しました。 nonradially指向の網膜神経細胞の樹状のフィールドは、パッチクランプおよびイメージング技術と信号処理の研究を可能にする、切り捨てられませんでした。
Abstract
垂直スライス標本はよく大人の哺乳類の網膜内の回路および信号伝送を研究するために設立されています。これらの製剤で切片の面は、光受容体と双極細胞のような半径方向に配向ニューロンの研究に最適です、網膜表面に対して垂直です。しかし、水平細胞、広視野アマクリン細胞、および神経節細胞の大きな樹状アーバは、これらの細胞中で著しく減少シナプス活性を残して、ほとんどが切り捨てられます。神経節細胞と変位アマクリン細胞は網膜の全体に取り付けられた準備に研究することができるのに対し、内顆粒層に位置する水平細胞とアマクリン細胞がわずかしか全体の網膜組織内の電極のためにアクセスできます。
最大のアクセシビリティとシナプス完全性を達成するために、我々は、マウス網膜の水平スライス標本を開発し、感光体と水平の間のシナプスでの信号伝達を研究しました細胞。水平方向の切片は、水平細胞の樹状突起に無傷で機能的なコーンシナプス入力のための前提条件として、電極の標的化のための水平細胞体の（1）簡単かつ明確な視覚識別、および拡張水平細胞の樹状のフィールド（2）保存を可能にします。
水平スライスからの水平細胞は暗所でトニックシナプス活性を示し、そして、彼らは内向き電流と減少したシナプス活性の低下と光の点滅を短時間に応答しました。免疫細胞化学的証拠は水平細胞の樹状フィールド内のほぼすべてのコーンはその周辺の樹状突起とシナプスを確立することを示しています。水平スライス標本は、したがって、水平方向に拡張網膜神経細胞の生理学的特性ならびに選択されたシナプス全体の感覚信号伝送との統合を研究するのに適しています。
Introduction
視覚情報は、感光体活性化の動的な時空間的パターンとして符号化され、光受容体および二次ニューロン間のリボンシナプスは、視覚情報の下流の転送を決定します。哺乳動物の網膜の垂直スライス標本、 すなわち光受容体と双極細胞との間、および双極細胞、およびアマクリン細胞1、2、3、4、いくつかのタイプの間で、垂直の経路の信号処理を研究するための非常に貴重なツールです。
しかし、垂直切片は常にシナプスの連絡先のかなりの損失につながる、多くの網膜神経細胞の樹状突起分野の厳しい切り捨てが発生します。特に、網膜の外側に、水平細胞は、それらの横に広がる拡張樹状のフィールドと軸索末端システム5に影響を受けます。垂直でスライス標本、水平細胞の樹状突起の円錐感光体端末の数百のシナプス入力は、このように、いくつかの疎コンタクトに低減されます。これは、個々のシナプスの特性を研究するためには十分かもしれないが、それは決してないが、感光体リボンシナプスの同期化された活性化の基礎となる信号処理機能を表します。
したがって、我々は、無傷で機能的な水平細胞の樹状突起にほぼすべての錐体光受容体のシナプス入力を離れる水平スライス標本を、開発しました。切片ランの面は、理想的には、水平細胞及びアマクリン細胞間の内顆粒層を通して切断し、網膜の表面に平行です。このように、外側の網膜の水平スライスを含んで作成され、シナプス前サイト上で、シナプス後サイト上の内側と外側のセグメントだけでなく、シナプス終末、および水平細胞と双極細胞と光受容体。この調製は、トンに非常に適していますOその樹状のフィールド内のすべての錐体視細胞、水平細胞の樹状突起に協調シナプス入力を調べます。したがって、より良い、シナプス後応答に感光体活性化のマトリックスからの視覚情報の伝達のために重要である感光体リボンシナプスの働きを理解するのに有用であることが分かるかもしれません。
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Protocol
すべての手順は、ドイツ連邦共和国によって発行された動物実験のためのガイドラインに従って行いました。
注：網膜組織は、この手順の延長部分の間に酸素を欠いていることになりますので、すべてのステップができるだけ速く行われるべきです。マウスは、解剖の前に少なくとも3時間暗順応でなければなりません。網膜の光適応を回避するために、準備とスライスは、暗赤色灯の下で行われるべきです。
メディアやその他の化学物質の作製
- エイムズ「中6を準備します。解剖後、すべての回でエイムズ「中に網膜組織を浸します。
- エイムズ「中の2.2グラムと蒸留水250ミリリットルで298ミリグラムのHEPESを溶解させます。 HEPESの濃度は5 mMのだろう。すべての粒子が溶解するまで穏やかに撹拌します。
- カーボゲンを用いて室温でバブルエイムズ「中（95％酸素、5％の車少なくとも5分間、ボン二酸化）。溶液へのガラスパスツールピペットで供給カーボゲン。ガス調整器の出口に適切なチューブを介して、パスツールピペットを接続します。
- 溶液に、475 mgのナトリウム - 炭酸水素を追加します。バブリング後の重炭酸塩の添加は、炭酸カルシウムの沈殿を防止します。
- 低ゲル化温度アガロースを準備します。アガロースをビブラトーム切片中に網膜組織の埋め込みのために必要とされます。
- 9ミリリットルエイムズ「中で180mgのアガロースおよび蒸留水1ミリリットルに溶解します。全ての固体が溶解するまでゆっくりとアガロース溶液を加熱するためにマイクロ波を使用してください。オーバーフローを避けるために10秒ずつ - 5の熱。溶液は透明かつ透明であるべきです。
- ストアは、処置の期間、37℃の水浴中でアガロースを溶解しました。
2.ビブラトームを設定します
注：すべての切片を用いて行われています材料表に記載されているビブラトーム。指定された設定は、ビブラトームのこのタイプを参照してください。神経組織のビブラトーム切片の詳細については7を参照するために参照してください。
- ブレードホルダーにビブラインジェクタブレードを置きます。
- "のVibroCheck「デバイスとブレードの垂直偏向を測定します。それは切断面に平行になるまで、ブレードを傾けるために、ブレードホルダーの調整ネジを使用してください。ブレードの正確な位置決めは、部分表面のブラインド効果を防止するために、その表面上の生きている細胞を含む平坦部を製造する必要があります。
- 以下の設定にビブラトームを設定します。振幅、1.00;スピード、0.20;厚さ、180から200ミクロン。
マウス網膜の3解剖
- 気密容器に約1ミリリットルイソフルランの蒸発によって大人C57BL / 6マウスをAnaesthetize。麻酔が完了すると、頸椎脱臼によって動物を安楽死させます。ザマウスは、そうでなければ、スライスの品質が低下する、3カ月以上経過してはなりません。
- 眼の下に曲がったピンセットを置くことによって、眼球を削除します。静かに視神経を公開します目のボールを持ち上げます。春のはさみで視神経を切断して、2ミリリットルエイムズ「中を含む35ミリメートルのペトリ皿に眼球を転送します。
- 実体顕微鏡のステージ上のすべての後続のステップを実行してください。以下の手順（ - 3.9 3.4ステップ）の最適な視覚的な制御を可能にする値に倍率を調整します。
- 尖った鉗子または20 G針で強膜への移行で角膜を穿刺。このステップの間、別のピンセットで眼球を安定。穿刺装置で網膜を損傷しないように注意してください。
- ステップ3.3で作られた小さな穴に春のはさみを挿入し、角膜の周りに円を切りました。切断しながら、再び、ピンセットで眼球を安定。 Cの順で表面に非常に接近していない切開をしてください網膜にユタ。
- 慎重にピンセットで角膜、レンズ、および硝子体を除去します。硝子体は、眼の後部にのみ薄い透明層を含みます。しかし、硝子体が完全に除去されること切片ビブラトームに必須です。
- ペトリ皿では、1がダウンし、網膜上に穴を通して見えるような方法でアイカップを置きます。開口部の縁は、強膜組織のみで構成する必要があります。円形カット（ステップ3.4）が近すぎるアイカップの赤道に行われた場合、網膜組織はまた、切開部に存在近くなります。ステップ3.8で網膜を損傷しないように、次に注意してください。
- 鉗子で強膜をつかみ、慎重に離れて組織を引き裂きます。このステップの間に、網膜を破壊することはないが不可欠です。必要に応じて、鉗子で組織の強膜の部分を安定さ、慎重に他の鉗子で網膜を剥離することによって鋸状縁から網膜を切り離します。鉗子を閉じておいてください。再処理することはありません組織は非常に柔らかく、すぐに道を与えるので、ピンセットでティナ。
注：このステップでは、網膜とアイカップの残りの部分のみが視神経頭で接続されます。 - 春のはさみで視神経乳頭に付着部位をカット。網膜は今自由にエイムズ「中における組織の単一の部品として浮遊する必要があります。
- 位置にそれを操作するために、鉗子でエッジに沿って網膜を保持することにより、湾曲した手術用メスの刃を用いて、約23ミリメートルの6小さな長方形 - 4に網膜をカット。長方形内の網膜組織を挟まないようにしてください。網膜、遠くない周辺部の中央部から駒を取ります。
- 35mmのプラスチック製ペトリ皿に大径プラスチックパスツールピペットで網膜の小片を移送、の底を1mm未満のグリッドサイズを有するメッシュで置換されています。ビーカーまたは三角フラスコの上部3分以内にシャーレを修正し、エイムズ「中府の網膜の部分を沈めますカルボゲンでbbled。
アガロースにおける網膜個の4埋め込み
- エイムズ「中のいくつかと一緒に35ミリメートルのプラスチックシャーレに3網膜個 - 注意深く2を転送します。転送のために大口径のプラスチックパスツールピペットを使用することが最も便利です。このステップでは、網膜片の正確な向きは重要ではありません。
- ガラスパスツールピペットで残りのエイムズ「中のできるだけ多くを削除してください。すぐ流体が削除されているように、ステップ4.3に進みます。網膜組織を乾燥させないでください。
- すぐにアガロース溶解の2ミリリットル（37°C）で網膜の部分をカバーしています。ステップ3.10に記載されたサイズを考えると、作品をアガロース内丸くしません。
- 液体アガロースの中で、静かにシャーレの底に網膜の部分を押してください。神経節細胞層が下向きにする必要があります。正確な位置を判断するための立体顕微鏡を使用してください。位置決めのために、網膜のパイを扱います小さなへらでECES。アガロースは迅速に固化するため、可能な限り迅速かつ正確に網膜を配置します。
- 網膜片をガラス皿の底に平行なアレンジ。そうでない場合のセクションでは、接線方向または斜めになります。個々の部分は、互いに接触しないはずですが、あまりにも遠く離れてはなりません。同じ水平レベルに多かれ少なかれ網膜片を配置してみてください。
- 少なくとも2分間 - （6°Cの4）冷蔵庫の中に埋め込まれた網膜片とガラスシャーレを入れてください。これはすぐに、さらなる処理のためにアガロースを硬化します。すぐにアガロースが重合したとして、次のステップに進みます。
網膜個の5取付
- 慎重にペトリ皿から網膜片を含むアガロースブロックを削除します。ガラスからアガロースブロックを持ち上げるために、スパチュラまたは同様のデバイスを使用してください。接着力のために、これは非常に困難であることが判明することができます。ただし、破損しませんアガロースブロック。室温で、この以降のすべてのステップを実行してください。
- カバーガラス上のアガロースブロックを配置し、手術用メスの刃で、サイズを調整します。網膜片の両側にアガロースの2ミリメートル - 1のままにしておきます。ブロックの最終的なサイズは、約1066ミリメートル（10ミリメートルは、ブロックの高さを意味し、その辺の長さ6ミリメートル）でなければなりません。
- 瞬間接着剤を使用してビブラトームの試料ホルダーにアガロースブロックを接着。底部がホルダーに固定されながら網膜の作品は、その表面に平行に10ミリメートル、高ブロックの上部に配置し、配向されるべきです。
- ビブラトームのバッファトレイに以前バブリングエイムズ「中を注ぐことにより、すぐにブロックをカバーしています。
水平ビブラトーム切片の6準備
- 切片を開始します。網膜組織の断片が、スライスに表示されるまで最初は、手動でスライスの厚さを設定します。そして、ステップ2.3での設定に変更します。からアガロースブロックごとに3スライス - マウスの網膜は、これ以上2以下があるだろう、だけで約200μmの厚さです。
- ガラス棒でバッファトレイからセクションを削除し、35ミリメートルペトリ皿に2ミリリットルエイムズ「中に転送します。
- すぐに37℃（5％CO 2/55％のO 2）でインキュベーターに保管してセクション。セクションを囲むアガロースインキュベーター固体とどまると網膜を損傷することなくセクションを処理するために使用することができます。室温で酸素エイムズ '培地に比べてそれぞれの雰囲気中37℃で保存するときに、より良いスライス品質が得られます。切片を直ちに使用することができ、または良好な生理学的結果をインキュベーターに4時間まで保存することができます。
- 6 - アガロースと繰り返しセクション4の次の網膜の部分を埋め込みます。
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Representative Results
マウス網膜の水平スライスでは、水平細胞体は簡単に多角形の細胞体（ 図1A）から出てくるいくつかの主要な樹状突起とのユニークな形態に応じて特定することができました。スライスの表面近くに位置する水平細胞体は、パッチクランプ電極のための日常的にアクセス可能でした。録音時には、細胞が密接に無傷のマウス網膜8（ 図1B）の軸索保有水平細胞の形態と類似していた彼らの複雑な樹状樹枝状分岐を、明らかにし、蛍光色素を充填しました。フルオレセイン結合ピーナッツ凝集素とコーン茎の標識はコーン茎と水平細胞の樹状突起（ 図1C）との間の密接な空間的な関係を示しました。いくつかの例外を除いて、水平細胞の樹状のフィールド内のすべてのコーン茎は、樹状突起により接触させました。
ENT "FO：キープtogether.withinページ=" 1 ">コーンと水平細胞間の接触は、パッチクランプ記録は、水平細胞体から実施した暗順応条件下で機能的であったことを証明するために、現在の応答がありました。大きな高周波シナプス活性に中等度に伴う内向き電流（ 図2A）によって特徴づけられる。ベースラインからの偏差と興奮性シナプス後電流は、シナプス後AMPA-とカイニン酸型グルタミン酸を活性化、暗所でのグルタミン酸の一定の放出によって引き起こされました受容体9。個々のシナプスのイベントが単相波形またはより複雑な現在の軌道（ 図2B）によって特徴付けられた。トニックシナプス後活性の存在は、グルタミン酸が錐体光受容体および図1Cに示す水平細胞の樹状突起間のシナプスの連絡先に発売されたことを示唆しています。Horizo記録NTAL細胞は錐体視細胞内シグナル伝達カスケードは、水平スライス標本でも、無傷で機能的であったことを示し、光強度の変化に応答しました。伝達物質放出の減少に、暗順応水平細胞の内向き電流トニックは抑制され、シナプス活性は、明らかに、フルフィールド光刺激の存在（1300 W / cm 2で、470は40nm）の間に減少した（ 図現れました図3（a））。同様に、明順応状態から闇への切り替えは、内向き電流を引き起こし、シナプス活性（ 図3B）の増加となりました。また、短い電気パルス（1-15 V、1ミリ秒）は、水平細胞体の近くにすべての錐体視細胞を脱分極するために、白金 - イリジウム双極刺激電極を介して適用しました。グルタミン酸の刺激によって誘発される放出は、記録された水平細胞（ 図3C）に大きな振幅興奮性シナプス後電流を誘発しました。 S INummary、これらの知見は、錐体視細胞と水平細胞間のシナプスは、いずれかの内因性刺激光によって、またはシナプス前要素の制御された脱分極によって実験的に操作できることを説得力をもって示しています。
図1：水平スライスの準備中の水平細胞の形態とシナプスの連絡先。スライスの表面近くに位置する水平細胞（矢印）がDodtコントラスト光学系を用いて可視化しました。スケールバー=10μmの（A）。イメージング実験のために、水平細胞は依然として細胞に結合しているパッチ電極を介して、オレゴングリーン488 BAPTA-1（100μM）を充填しました。スケールバー=10μmの（B）。色素注入された水平細胞のオーバーレイおよびフルオレセイン結合ピーナッツ凝集素で標識されたコーン茎の配列は、推定されるシナプスの連絡先を明らかにしています。スケールバー=10μmの（C）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 水平細胞体から記録されたシナプス活性。 -60 mVの保持電位で全細胞電圧クランプ記録は、高周波トニックシナプス活性（A）を示しています。高い時間分解能（B）では、シナプス事象は、単相波形（矢印）や、より複雑な現在の軌道（矢じり）を表示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3：光と電気刺激によって誘発水平細胞体の電流応答。 -60 mVの保持電位で記録し暗順応水平細胞体の光応答。フルフィールド照明は、内向き電流トニックを阻害し、シナプス活性（A）を低下させます。同じ条件で記録された光に適合した水平細胞体は闇（B）の間に増加したシナプス活性を伴う暗いフラッシュ以下の内向き電流が表示されます。 AとBでの水平線は、刺激のタイミングを表しています。短い電気パルスによる細胞外刺激は、錐体視細胞（C）からのグルタミン酸の同期のリリースに伴う大振幅興奮性シナプス後電流を誘導します。保持電位：-60mVに。矢印は、刺激パルスのタイミングを示しています。トレースの開始時に切り捨てられた電流は、刺激アーチファクトを表します。.COM /ファイル/ ftp_upload / 55173 / 55173fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
垂直スライスとは対照的に、水平細胞とアマクリン細胞のような半径方向に配向ニューロンの樹状突起形態がよく保存されています。全網膜製剤と比較して、これらの細胞型は、微小電極のために容易にアクセス可能であり、両方の電気及びイメージング技術によって研究することができます。ここでは、網膜の外側に焦点を当てました。しかしながら、同様のアプローチは、特に、内網膜10のアマクリン細胞について報告されています。
水平スライス標本の特性は、機能的研究のためのいくつかの意味を持ちます。錐体光受容体とシナプス後水平細胞間のシナプス結合の数は、無傷の網膜からほとんど区別できませんでした。シナプスの連絡先は、暗闇の中で神経伝達物質の強壮剤の放出を示す、機能的でした。シナプスは、明/暗の遷移などの内因性刺激するか、外部の双極刺激によって活性化することができました。
ここで紹介する技術は、主に水平方向のニューロンに限定されています。双極細胞の軸索は切り捨てられますので、したがって、水平スライスに光受容体と無傷の双極細胞から録音することはできません。また、完全にセクショニングのレベルを制御することは不可能です。単一網膜枚メートルこのように光受容体の外側と内側のセグメント間、例えば、望ましくないレベルで切断さIGHT。少なくとも1枚で切片の正しい面のアガロース増加のチャンスの1ブロック内の網膜ピースの数を増やします。
水平スライス標本は、ロッドとコーン光受容体のリボンシナプスのユニークな特性を研究に適しています。これまでのところ、我々は、錐体視細胞と水平細胞11との間のシナプス伝達に3とcomplexin 4をcomplexinシナプス前タンパク質の役割を調べるために、動物ノックアウトシステムを使用しています。以前9に示すように、後シナプスの神経伝達物質受容体の特性を研究することも可能です。
将来のアプリケーションは、電気生理学とイメージング技術を有するトランスジェニックマウス系統に基づいて、シナプスのタンパク質の研究が含まれます。また、生物物理学的プロを調査することが可能となります水平細胞間のギャップ結合のperties。光応答を測定することができるので、この技術はまた、視覚系の最初のシナプスにおける内因性の刺激の符号化を調査するために使用されます。それ以外の場合は、光反応が大きく円錐駆動され、組織の明順応を防ぐために、暗闇の中で準備を行うことができます。
要約すると、水平スライス標本は、哺乳類の網膜12におけるそれらの機能的特性を研究するための前提条件として、個々のシナプスのアクセシビリティを高めるための新しいアプローチを表しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35 mm Petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass Petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20 G needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
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