Summary
在这里，我们将展示如何量化的数量和果蝇光感受器突触活动区域的空间布局，突出了遗传编码的分子标记，并长时间暴露于光后的调制。
Abstract
神经系统有适应和各种刺激作出反应的非凡能力。这种神经调节主要是在突触水平通过可塑性来实现的。活动区（亚利桑那州）是在该介导神经递质的释放，并且由支架蛋白的致密集合的突触前膜的区域。 果蝇的锆刚玉（ 果蝇 ）光感受器长时间暴露在自然光环境发生后重塑分子。因而神经元活性的水平可以重新排列AZ的分子组成和向功能输出的调节。
从曝光设置准备到免疫组开始，该协议细节如何量化数，空间分布，并且在AZS 果蝇光感受器突触分子的离域电平。使用图像分析SOFtware，绿色荧光蛋白融合AZ成分Bruchpilot集群被认定为每个R8感光器（R8）轴突终端。检测Bruchpilot点被自动分配给各个R8轴突。要计算点频率沿轴突的分布，我们实现了一个定制的软件插件。每个轴突的开始点和结束点进行人工定义和每个Bruchpilot光斑的位置被投影到的开始和结束点之间的连接线。除了Bruchpilot簇的数目，我们还定量Bruchpilot-GFP的簇内的离域电平。这些测量反映详细在单个神经元的空间分辨突触动力学不同环境条件下对刺激。
Introduction
突触功能的调制有助于神经系统的显着能力精确响应或适应不断变化的环境刺激。调节突触前小泡释放的概率是控制突触强度1的一种方法。突触囊泡释放在活动区（AZ），突触前膜2的一个专门区域发生。在AZ的特征在于特定蛋白质3 4的盒，。促进AZ组装大多数蛋白质是高度保守的线虫，昆虫和哺乳动物5。最近的研究表明，神经元活动的水平调节AZ，这又在体外和体内 6,7有助于官能输出的调节的分子组成，> 8。我们以前发现，感光AZS发生在果蝇分子重塑长时间暴露在自然的环境光9点以后。在这种情况下，我们观察到Bruchpilot（BRP）阳性AZS的数量在感光体轴突降低。
该BRP / CAST / ELKS家族蛋白是脊椎动物和无脊椎动物神经突触10 AZS的基本构件。在果蝇突变BRP，诱发囊泡释放被抑制11，12。 BRP的17 C-末端氨基酸残基是在果蝇神经肌肉接头（NMJ）13,14突触小泡簇的关键。这些研究证明这种分子在亚利桑那州的组织和功能的核心作用。与最近开发的基因工具，突触标记与重组（STAR），BRP可以在特定细胞类型的体内观察到的，在内源表达水平和在单个突触决议15。这个工具使得它可行的定量评价在复杂的中枢神经系统突触的内生动力。
已经有多项研究，包括基于从共聚焦显微镜获得的数据突触quantifications。突触改动了测量的长度，面积，体积，密度和基于复杂的软件应用计数的数目进行评价。例如，免费软件ImageJ的提供了用于总突触面积，并在果蝇 NMJ 16突触密度措施定量方法。前期和突触后标记的共定位网站的数量一直在使用插件“泪点分析仪的”ImageJ的软件平台17可量化。替代地，多参数adigm数值计算环境的基础方案，突触检测器（SynD），可以自动跟踪标记有荧光标记的神经元的树突，然后量化突触蛋白水平作为距离从细胞体18的功能。软件突触泪点分析（SynPAnal），已被设计用于从共焦或荧光显微镜获取的神经元的二维图像的快速分析。该软件的主要功能是蛋白质泪点19的密度和强度的自动和快速定量。近日，在3D突触20多项量化已生成一个自动基于学习的突触检测算法，采取的三维可视化辅助分析（Vaa3D）软件21的优势。
商业图像分析软件也是突触quantifications的强大工具。例如，荧光标记的神经递质受体或突触前AZ组件已在三个维度与C中的单突触分辨率线虫 22或果蝇嗅觉系统23，24，使数百突触被快速地特征在于单个样品中进行定量。
这里，我们通过定制图像分析软件呈现一个方法插件在一个多范式数值计算环境，允许分析AZS的半自动多个方面，包括它们的数量，分布和分子成分浓缩到水平实现在AZ。因此，这种复杂的分析使我们能够评估在不同环境条件下轴突终末突触部件的动力学。我们研究了成年果蝇光感受器的输出突触曝光的效果。这个程序是在三个步骤执行：1）对于光照射，2）夹层，免疫组织化学和共焦成像，3）图像分析制剂。
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Protocol
在这个协议中所述的实验程序涉及专门与果蝇工作，并不会受到在德国和日本动物福利法。
1.光照条件
- 准备携带sensless-翻转 （SENS-FLP）和bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP（BRP-FSF-GFP）15在感光R8神经元（R8S）可视化BRP-GFP苍蝇。一个细菌人工染色体（BAC）中的基因组基因座编码BRP被修改以产生此BRP-FSF-GFP构建体。在执行该修改的BAC BRP-GFP表达的蝇是内源调节序列的控制之下，但sensless-翻转酶介导的切除FRT-STOP-FRT盒15的后限于R8光感受器。需要注意的是SENS-FLP很少表达在R7S翻转酶。
- 不让苍蝇在12小时里GHT / 12小时黑暗周期（LD），在25℃下从幼虫阶段，直至羽化（ 图1A）。
- 收集苍蝇0 - 6小时羽化后，将它们放入含有飞食品新的小瓶。
- 设置小瓶与三个步骤（41厘米的高度，21厘米的的基础上，其厚度为4厘米，13厘米的每个步骤的高度）（ 图1B）由丙烯酸树脂构成的透明的机架。
- 调整齿条和一个LED面板之间的距离，以提供照明用的数字光计（ 图1C）1000勒克斯的平均强度。
- 保持1苍蝇- 3天以下条件之一：持续黑暗（DD），12小时光照/ 12小时黑暗周期（LD），或恒光（LL）在25℃的小型孵化（ 图1A和1C）。
2.解剖，免疫组化和成像
- 解剖大脑飞用钳子，用4％FO修复rmaldehyde和免疫染色用抗Chaoptin第一抗体（1:50）和用于根据以前的实验程序25感光体的可视化的第二抗体。简述：
- 制备0.1％的Triton X-100的PBS（0.1％PBT）。该溶液是用来改善抗体的组织穿透。
- 麻醉苍蝇在二氧化碳垫，整理出正确的基因，并将它们转移到一个培养皿中充满0.1％PBT。
- 粘钳子长鼻下方并分别与其他钳拉断右眼和左眼。
- 除去长鼻和连接到大脑气管。
- 与镊子进入含有0.1％的PBT 150微升在RT 1.5mL管转移大脑。
- 距离2.1.3 10分钟重复 - 2.1.5，以获得尽可能多的大脑越好。
- 添加16％的甲醛50μL进管吹打混合。
- 孵育大脑在室温固定液温度50分钟。
- 用0.1％的PBT 200微升洗涤三次用微量，注意离开的大脑中的管中。
- 在最后一次洗涤后，取出0.1％PBT和添加第一抗体溶液，制备如下：添加0.3％的PBT（0.3％的Triton X-100的PBS）抗Chaoptin抗体的4微升（最终稀释1的196微升：50），用于光感受器的可视化。
- 孵育在一次抗体溶液的大脑在4℃CO / N。
- 3倍洗净用微量200微升0.1％的PBT。
- 最后一次洗涤后，除去0.1％的PBT，并添加含二级抗体的0.3％PBT的200微升。
- 在4°CO / N孵育它在黑暗中。
- 与用微量200μL的0.1％的PBT洗涤三次。
- 安装时，把两个小滴的安装介质（每次2μL）用微量在显微镜载玻片中心在约两厘米见方DISTANCE彼此。
- 将两个盖玻片，一是到每个下降，留下的约为0.2毫米盖玻片之间的狭窄缝隙。
- 放置在盖玻片顶部的安装平台15微升并用微量添加的大脑到安装平台。
- 在解剖显微镜下，用腹侧定位大脑成（ 图2）在两个盖玻片之间的窄的间隙。
- 在上面放置盖玻片并密封用透明指甲油固定检体（ 图2）的盖玻片的边缘。
- 获得脑部图像用共聚焦显微镜。使用63X油浸物镜（1.4 NA）和2.6倍数码变焦。产生第二视神经节髓质超过20光学切片为0.5微米的步长大小。
3.斑点，表面对象，开始点和结束点的生成
- 量化数，颇ibution和BRP-GFP泪点的离域电平，打开在图像分析软件通过共聚焦显微镜获得的协议栈和重建的3D图像（ 图3A）。注意，在此研究中的步骤，用了Imaris进行。
- 通过为每个R8轴突终端斑检测模块识别BRP-GFP泪点。
- 选择“添加新景点”。
- 在算法设置中选择“段只是一个感兴趣区域”。选择手动髓质的R8轴突终末。
- 选择BRP-GFP信号的源信道。
注：R7和R8感光体轴突与抗Chaoptin（ 图3A）免疫标记。仅R 8，不过，包含BRP-GFP泪点并因此可以很容易地区别（ 图3A）。另外，R8的端点可以通过抗Chaoptin阳性轴突在入口点到M3的髓质层变薄来识别。 - 设置估计XY面直径TØ0.35微米，并在现场检测勾选“后台减法”。
- 选择滤波器类型“质量”，并自动过滤。然后单击Finish。
- 从3.2.1 T-3.2.5重复其它R轴突（ 图3B）。
- 为了测量BRP-GFP的R8轴突离域层面，以及每个轴突（ 图3C）的“表面”功能生成曲面对象。
- 选择“添加新的表面”。
- 在算法设置中选择“段只是一个感兴趣区域”。然后手动选择在髓质的R8轴突终末。
- 选择感光器的源通道。
- 勾选“平滑”。
- 在门槛，选择“绝对强度”。
- 勾选“启用”。 “种子点直径”为0.5微米。
- 选择滤波器类型“质量”和“素数”，然后筛选automati凯莉。
- 进入“编辑”，并删除其他非有趣的轴突产生表面的碎片。
- 从3.3.1重复- 3.3.8其它R轴突（ 图3C）。注意一些表面的物体被打断，因为相对较小，且在M2层的光感受器的微弱信号，但他们仍然认为作为一个对象从开始到结束点。
- 以确定BRP-GFP泪点的沿着在髓质神经毡每个神经元的分布，定义起始点和结束点与所述测量点的功能（ 图3D）。
- 选择“添加新的测量点”。然后选择“编辑”，然后选择“对象表面”与表面物体的顶部相交。
- 把测量点上的M1层R.轴突的表面物体的顶部顺序。这些现在被定义为开始点（ 图3D）。
- 选择“添加新的测量点”。然后选择“编辑”，然后选择“对象表面”与表面物体的底部相交。
- 把测量点上在M3层R.轴突的表面的物体的底部的顺序。这些现在被定义为结束点（ 图3D）。
- 减去来自GFP的信道的背景信号，产生表面的对象，地点，开始点和结束点为M6的层（ 图3E）两个R轴突。
- 选择“添加新的表面”。
- 在算法设置中选择“段只是一个感兴趣区域”。然后手动选择M5和M6层之间的R7轴突终末。
- 选择感光体的源通道。
- 勾选“平滑”。
- 在门槛，选择“绝对强度”。
- 选择滤波器类型“质量”和“素数”，然后自动过滤。
- 选择“添加新景点”;。
- 选择“跳过自动创建，手动编辑”。
- 选择“对象的中心”，并在从3.5.1中产生的表面的对象的内部区域加一个点 - 3.5.6。
- 从3.5.1重复 - 3.5.9另一个R7轴突终末。
- 选择“添加新的测量点”。然后选择“编辑”，并把在M6的层中的R 7轴突终端的尖端的两个表面的物体的顶部测量点。现在，这些均定义为启动点。
- 选择“添加新的测量点”。然后选择“编辑”，并把在M6的层中的R 7轴突终端的尖端的两个表面的物体的底部测量点。这些现在被定义为结束点（ 图3E）。
4.计算点的数量的，现货的频率和分布BRP-GFP的富集程度与一个自定义图像数据分析软件
- 复制文件“XtquantifySynapseSNR.m”和“功能”文件夹进了Imaris XT MATLAB的文件夹中。注意，在此研究的计算用在Matlab实现的定制的插件执行。从网站（下载插件https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ）。
- 打开一个数据集有n个点，正表面和2个测量点的对象，每个都包含n个测量点（3.1编写 - 3.4）。第一个测量点对象定义为所有轴突的起始位置。第二个测量点的对象定义了所有轴突的结束位置。两个测量点对象需要具有相同数量的测量点（即轴突的数量）。
- 执行图像处理>> CUSTOM> atsushis突触检测VS 6。
- 检查元数据和更改像素大小的图像分析软件的情况下，这是不正确的。
- 对于PERF选择通道斑点区域和胞浆区域（与BRP-GFP的信道）的强度分析ormance。
- 定义文件名导出的结果。
- 定义百分比仓和轴突长度的数目。输入仓为“10”和箱为“100％”（ 图4A和4B）的范围的数量。
- 定义点和其它细胞质区域的BRP-GFP离域分析的区域。输入点半径为“0.35微米”和周边地区为“50微米”的宽度。斑点半径定义了泪点GFP信号（直径0.35微米，集中在一个泪点）的区域。周边区域的宽度定义区域在细胞质区域的GFP信号（直径50微米，集中于泪点，但仅包括R 8和不含在细胞质中的所有点区域）（ 图4A和4C）。
- 等到所有的神经元的口罩被处理并导出为PDF文件（ 图4B和4C），并在电子表格中进一步分析CSV表。该CSV表包括斑点数，在“胞质区域”，并且在每个块对所有R8轴突的“斑点”的最大信号强度的平均信号强度。
- 打开3.5编写的背景信号的减法的数据集。
- 4.9 - 从4.3的描述执行图像处理。
- 计算的总数的平均值和BRP-GFP泪点的电子表格中的（ 图4D和4E）的分布。
- 由平均强度中的“胞质区域”通过的最大强度在“点”的平均强度在背景信号中减去分割比率计算BRP-GFP信号的离域的电子表格中的平均值（ 图4F） 。
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Representative Results
果蝇的复眼包括〜780小眼，每个包含八种类型光感受器（R1-8）。 R7和R8项目它们的轴突到第二视神经节，髓质，在那里它们形成在层M6和M3，分别为26突触。为了研究长时间暴露于光的感光R8活动区域的分子组成的影响，我们采取了STAR方法15的优势。 BRP的内源性表达水平荧光翻转出BRP-FSF-GFP终止密码子在从SENS-FLP衍生R8感光表达了翻转标记。在25℃（ 图1A）在LL，LD或DD的时间同期羽化后3天-苍蝇被关1。以暴露果蝇到1000勒克斯的光，苍蝇分别套入丙烯酸树脂架（ 图1B），并保持在相同的距离从在一个小孵化器（ 图1C）的LED光源。
免疫染色后，解剖大脑进行显微镜载玻片上2盖玻片之间放置到狭窄的间隙与朝上的BRP-GFP泪点的可视化和量化的大脑（ 图2）的腹侧。在髓质（ 图3A）定位至不同的泪点内R8所得BRP-GFP信号。
计数的数量，并测量BRP-GFP泪点的分布，并评估在R8S BRP-GFP信号的离域电平，定制的影像分析软件插件中一个多范式数值计算环境9，27开发的。起初，泪点通过为每个R 8（ 图3B）的点检测功能检测。随后，表面对于离域电平（ 图3C）的评价生成每个R 8的第最后，我们在M1层的顶部和M3层的底部上的每个感光体分别限定开始点和结束点来测量AZ分布（ 图3D）。也产生表面的对象，地点，开始点和结束点为M6层中的两个R 7轴突终末减去从GFP通道（ 图3E）的背景信号。数量（ 图4D），分布（ 图4A，4B和4E）和离域电平的结果（ 图4A，4C和4F）会自动插件写在一个多范式数值计算环境定制计算。我们发现，BRP离散泪点的数量保持在LL条件（ 图4D和4E）的苍蝇R8光感受器被显著降低。加itionally，我们发现，R8突触都沿着从M1至M3层轴突轴分布，但密度在M1和M3的层（ 图4E）较高。 BRP-GFP的离域水平在所有光照条件下（ 图4F）不变。这是在对比的本地化荧光标记BRP（BRP-短樱花）28，正如我们先前报道的9成为LL（ 图4G）清楚地扩散的短版。我们建议，离域BRP-短樱桃信号可能会从AZ 9拆卸后进行相关的BRP-短片段的处理不当。除其他测试AZ蛋白，荧光标记DLiprin-α或果蝇轮圈结合蛋白（DRBP）构建体显示在泪点的数量减少，并在LL明确离域。与此相反，荧光标记Dsyd-1或杂音（CAC）做不显示即使在LL（ 图4G）增加细胞质信号。因此，测量信号系统是否变为细胞质可能是相关的理解AZ蛋白的加工。
图1：条件的接触定义的光强准备。 （A）羽化后曝光量的协议。 DD，持续黑暗; LD，12小时光照/ 12小时黑暗; LL，不断暴露在光线下。飞脑，在括号中的（从先前的出版物9改编）所示的时间解剖。 （B）的小瓶中定制的丙烯酸透明齿条对齐。 （C）的丙烯酸齿条和两个LED面板放入小孵化器，并调整为苍蝇暴露于1000勒克司的光强度。S / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2：试件的制备。 （一）所有安装的大脑准备。 （B - D）准备的示意图。 （C，D）的制剂的横截面。大脑的腹侧方达（C）之间的盖玻片（D）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：斑点，表面对象和测量点的产生。
图4：数量，分布及BRP-GFP泪点的离域级别的定量。 （A）用来测量离域BRP-GFP信号的R8水平的过程示意图。该BRP-GFP泪点被识别和两个区域周围定义：“现货”区域和“胞质”区域。连接开始和结束点的线在10个分区细分。 （B，C）从写在一个多范式数值计算环境的定制图像分析软件的插件输出。每一个BRP-GFP泪点坐标预计代表从开始溥神经元一行诠释结束点（B）。比例尺，5微米。在BRP-GFP泪点进行识别和两个区域周围定义：“斑”区域和“细胞质”区域（C）中 ，如图式（A）中。 （D - F）柱状图对比泪点（D），它们的分布（E）和每R8轴突（F）的DD BRP-GFP的离域级（83轴突/ 7的大脑），LD总数（107轴突/ 5的大脑）和LL（226轴突/ 15的大脑）。 （G）条形图比较在LD BRP-短樱桃的离域级（74轴突/ 7的大脑）和LL（70轴突/ 5的大脑）的LD，GFP-DLiprin-α（67轴突/ 7的大脑）和LL （52轴突/ 6的大脑），GFP-DRBP的LD（70轴突/ 7的大脑）和LL（83轴突/ 6的大脑），GFP-Dsyd-1 LD（48轴突/ 5的大脑）和LL（69轴突/ 7大脑），和CAC-GFP的LD（31轴突/ 5的大脑）和LL（27轴突/ 5的大脑）。 *** P <0.0001，** p <0.001，* P <0.0 5，NS P> 0.05;与韦尔奇的修正配对t检验双尾。误差棒表示平均值的标准误差。在示意图（A）和（D）中的数据，（E）和（G）的适于从先前出版物9。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充视频：用了Imaris插件“突触TRAFO”进行数据处理的说明。讨论的数据处理。这部影片包含一个简短的演讲，说明坐标的插件了Imaris“synapse_trafo”进行转换和数据处理步骤。5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi“目标=”_空白“>请点击这里观看该视频。（右键点击下载）。
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Discussion
在这项研究中，我们展示了如何准备光照条件下暴露苍蝇平等的光强度。那么，定量突触标记泪点的数量，但也可以在空间上解决突触沿轴突密度，并测量在细胞质区域的标志物蛋白的离域电平。这三个评估允许我们在不同环境条件下的单神经元水平评价突触动力学的细节。我们的协议可以适应不同的突触蛋白，而且对包含点状的信号的任何数据。
该协议中的关键步骤是大脑的安装。 果蝇光感受器项目其轴突到第二视神经节髓质。每个感光体轴突可以直截了当进行扫描，如果所安装的大脑进行正确地放置在显微镜载玻片上。正确的安装也使得感光器的选择与图像分析softwa重功能更容易。每个感光体区域，必须手动选择用于计数泪点的数目和离域电平。在开始和结束点也手动选择。这些制剂需要相对长的时间，直到一个可进行到定量。 R8轴突的优点是，它们是无支链的并且每个R 8轴突是分开的。一个简单的分离的神经元，如这样的建议对这些应用，因为它是必要定义神经元的确切区域。此外，这有助于摆脱非特异性泪点和其他神经元的衍生表面。在这种方法的一个限制，但是，是在Z突起的深度。泪点的信号强度得到在Z堆叠的深层以下。通过组织清除方法，一个SeeDB2 29准备透明的大脑可能有助于克服这个限制，并允许一个明确的点状信号的影像在大脑更深。
我们原山坳可能会被用于在纳米尺度和实时成像分析突触组织。结合超高分辨率成像（ 例如，受激发射损耗（STED）显微镜，随机光学重建显微镜（STORM），照片激活定位显微镜（PALM），结构照明显微镜（SIM） 等 ）理论模型拥有先进的我们的理解结构和突触的分子动力学。例如，BRP的纳米级组织在与果蝇 NMJ 30直接STORM（D STORM）的超高分辨率成像的单分子的分辨率进行评估。我们的协议在一个突触前活性区，并在突触后区的单个突触后受体，以进一步理解突触如何在一种机械水平调节的适于单一活性区分子的动力学的定量。此外，我们的协议可以被用于可视化的分子运动在活的动物突触。事实上，BRP-GFP可以不依赖于免疫染色进行可视化。因此，在R8轴突突触前发展已成像在活的动物与双光子显微镜15。有可能通过检测和分析，因为表面和特定的神经元的位置中的协议被定义在不同时间点的斑点跟踪生活动物有源区组分的点状信号。
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Acknowledgments
我们感谢T.Stürner对稿件有益的修正，讨论和评论; SL Zipursky提供即时的股票;中号Schölling用于进行图像处理。图像分析部分A处Kakita的实验室中进行。这项工作是由亚历山大·冯·洪堡基金会和日本学术振兴会奖学金为研究海外（AS），日本学术振兴会研究员（SH-S），格兰特 - 在 - 援助启动（24800024），对创新领域（25110713），持田的支持，武田，稻盛和夫，第一三共，东丽基金会（TS），DZNE核心资金（GT）和DZNE光学显微镜基金（CM）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
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