Summary
Her viser vi, hvordan at kvantificere antallet og rumlige fordeling af synaptiske aktive zoner i Drosophila melanogaster fotoreceptorer, fremhævet med en genetisk kodet molekylær markør, og deres modulation efter længere tids udsættelse for lys.
Abstract
Nervesystemet har den bemærkelsesværdige evne til at tilpasse og svare på forskellige stimuli. Denne neurale justering er i vid udstrækning gennem plasticitet på den synaptiske niveau. Den aktive zone (AZ) er den region på den præsynaptiske membran, der medierer neurotransmitterfrigivelse og er sammensat af en tæt samling af scaffold-proteiner. AZS af Drosophila melanogaster (Drosophila) fotoreceptorer gennemgår molekylær remodellering efter længere tids udsættelse for naturligt omgivende lys. Dermed omfanget af neuronal aktivitet kan omarrangere den molekylære sammensætning af AZ og bidrage til reguleringen af den funktionelle udgang.
Med udgangspunkt i den lyseksponering opsætning forberedelse til immunhistokemi, denne protokol detaljer, hvordan at kvantificere nummer, den rumlige fordeling og flytning niveau af synaptiske molekyler på Azs i Drosophila fotoreceptorer. Brug billedanalyse software, klynger af GFP-smeltet AZ komponent Bruchpilot blev identificeret for hver R8 fotoreceptorer (R8) Axon terminalen. Registrerede Bruchpilot spots blev automatisk tildelt individuelle R8 axoner. For at beregne fordelingen af spot frekvens langs Axon, vi implementeret en tilpasset software plugin. Hver axon start-point og endepunkt blev manuelt defineret og positionen af hver Bruchpilot spot blev projiceret op på forbindelseslinje mellem start og slutpunkt. Ud over antallet af Bruchpilot klynger, vi kvantificeret også flytning niveau af Bruchpilot-GFP inden for grupperne. Disse målinger afspejler i detaljer rumligt løst synaptiske dynamik i en enkelt neuron under forskellige miljøforhold på stimuli.
Introduction
Modulering af synaptisk funktion bidrager til den bemærkelsesværdige evne af nervesystemet til præcist reagere eller tilpasse sig skiftende miljømæssige stimuli. Justering af præsynaptiske vesikel release sandsynlighed er en måde at styre synaptisk styrke en. Synaptisk vesikel frigivelse finder sted på den aktive zone (AZ), en specialiseret region i den præsynaptiske membran 2. AZ er kendetegnet ved en kassette af specifikke proteiner 3, 4. De fleste proteiner, der bidrager til AZ samling er stærkt konserverede i nematoder, insekter og pattedyr 5. Nylige undersøgelser tyder på, at niveauet af neuronal aktivitet regulerer den molekylære sammensætning af AZ, hvilket igen bidrager til reguleringen af den funktionelle output både in vitro og in vivo 6, 7,> 8. Vi har tidligere fundet, at fotoreceptor AZS gennemgår molekylær ombygning i Drosophila efter længere tids udsættelse for naturligt omgivende lys 9. I denne tilstand, observerede vi, at antallet af Bruchpilot (BRP) -positiv AZS blev reduceret i fotoreceptor axoner.
BRP / CAST / ELKS familiens proteiner er fundamentale byggesten i Azs i hvirveldyr og hvirvelløse synapser 10. I Drosophila balanceansvarlige aktørs mutanter, fremkaldte vesikel frigivelse er undertrykt 11, 12. De 17 C-terminale aminosyrerester af BRP er afgørende for synaptisk vesikel klynger ved Drosophila neuromuskulære forbindelse (NMJ) 13, 14. Disse undersøgelser viste centrale rolle dette molekyle i AZ organisation og funktion. Med en nylig udviklet genetisk værktøj, Synaptic Tagging med Rekombination (stjerne), BRPkan observeres in vivo i specifikke celletyper, på endogene ekspressionsniveauer og ved en enkelt synapse beslutning 15. Dette værktøj gør det muligt at evaluere de endogene dynamik synapser kvantitativt i komplekset centralnervesystemet.
Der har været flere undersøgelser, herunder synapse kvantificeringer baseret på data indsamlet fra konfokal mikroskopi. Synaptiske ændringer er blevet evalueret ved at måle længden, området, volumen, densitet og tælle antallet baseret på avancerede programmer. For eksempel, freeware ImageJ giver en kvantificering metode til total synaptisk område og synaptiske foranstaltninger densitet på Drosophila NMJ 16. Antallet af co-lokaliseringstoppe steder af pre og postsynaptiske markører er blevet kvantificeret ved hjælp af plugin "puncta Analyzer" tilgængelige på ImageJ software platform 17. Alternativt, en multi-paradigm numerisk computermiljø baseret program, Synapse Detector (synd), kan automatisk spore dendritter af neuroner mærket med en fluorescerende markør, og derefter kvantificeres de synaptiske proteinniveauer som funktion af afstand fra cellelegemet 18. Den software Synaptic puncta Analysis (SynPAnal), er designet til hurtig analyse af 2D-billeder af neuroner erhvervet fra konfokal eller fluorescerende mikroskopi. Den primære funktion af denne software er den automatisk og hurtig kvantificering af tæthed og intensitet af protein puncta 19. For nylig har en automatisk læring-baserede synapse afsløring algoritme blevet genereret til kvantificering af synaptisk nummer i 3D 20, at drage fordel af 3D Visualisering-Assisted Analysis (Vaa3D) software 21.
Kommerciel billedanalyse software er også stærke værktøjer til synaptiske kvantificeringer. For eksempel den fluorescerendemærkede neurotransmitterreceptorer eller en præsynaptisk AZ komponent er blevet kvantificeret i tre dimensioner med en enkelt synapse beslutning i C. elegans 22 eller Drosophila lugtesystemet 23, 24, hvilket tillader hundreder af synapser, der skal hurtigt kendetegnet inden for en enkelt prøve.
Her præsenteres en fremgangsmåde ved en tilpasset billedanalyse software plug-in implementeret i en multi-paradigme numerisk computermiljø, der gør det muligt at analysere halvautomatisk flere aspekter af AZS, herunder deres nummer, fordeling og niveauet af berigelse af molekylære bestanddele til AZ. Således er denne komplekse analyse tilladt os at vurdere dynamikken i synaptiske bestanddele i axonterminaler under forskellige miljøforhold. Vi undersøgte effekten af lys eksponering på output synapser af voksne flyve fotoreceptorer. Proceduren udføres i tre trin: 1)forberedelse til lyseksponering, 2) dissektion, immunhistokemi og konfokal billeddannelse, og 3) billedanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De eksperimentelle procedurer beskrevet i denne protokol indebærer udelukkende arbejder med Drosophila og ikke udsættes for dyrevelfærd love i Tyskland og Japan.
1. Lette eksponeringsforhold
- Forbered fluer, der bærer sensless-flippase (sens-FLP) og bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 til visualisering BRP-GFP i fotoreceptor R8 neuroner (R8s). Den genomiske locus kodning BRP inden en Bakteriel kunstigt kromosom (BAC) blev ændret for at generere denne BRP-FSF-GFP konstruktion. I fluer transporterer denne modificerede BAC ekspressionen af BRP-GFP er under kontrol af de endogene regulatorsekvenser, men begrænset til R8 fotoreceptorer efter sensless-flippase medieret fjernelse af FRT-STOP-FRT kassetten 15. Bemærk, at sens-FLP sjældent udtrykker flippase i R7s.
- Hold fluerne i en 12 h liGHT / 12 h mørke cyklus (LD) ved 25 ° C fra larvestadiet indtil eclosion (figur 1A).
- Saml fluerne 0 - 6 timer efter eclosion og placere dem i et nyt hætteglas indeholder fly mad.
- Indstil hætteglassene i en gennemsigtig rack lavet af akryl harpiks med tre trin (en højde på 41 cm, en base af 21 cm, en tykkelse på 4 cm og en højde på 13 cm for hvert trin) (figur 1B).
- Justere afstanden mellem tandstangen og en LED panel for at tilvejebringe belysning med en gennemsnitlig intensitet på 1.000 lux ved anvendelse af en digital lysmåler (figur 1C).
- Holde fluerne i 1 - 3 D under en af følgende betingelser: konstant mørke (DD), 12 timers lys / 12 timer mørke-cyklus (LD), eller konstant lys (LL) ved 25 ° C i en lille inkubator (Figur 1A og 1C).
2. Dissektion, Immunhistokemi og Imaging
- Dissekere flyve hjerner med pincet, rette dem med 4% formaldehyde og immunofarvningsprocedure med det primære antistof mod Chaoptin (1:50) og et andet antistof til visualisering af fotoreceptorer baseret på tidligere eksperimentelle fremgangsmåder 25. Kort:
- Forbered 0,1% Triton X-100 i PBS (0,1% PBT). Denne opløsning anvendes til at forbedre antistof vævspenetration.
- Bedøver fluer på en CO2-pad, sortere den korrekte genotype og overføre dem til en petriskål fyldt med 0,1% PBT.
- Stick pincet nedenunder snabel og træk højre og venstre øjne henholdsvis med de andre pincet.
- Fjern snabel og luftrøret er fastgjort til hjernen.
- Overfør hjernen med pincet i et 1,5 ml rør indeholdende 150 pi 0,1% PBT ved stuetemperatur.
- Inden for 10 min gentag fra 2.1.3 - 2.1.5 for at få så mange hjerner som muligt.
- Der tilsættes 50 pi af 16% formaldehyd i røret og blandes ved pipettering.
- Inkuber hjernerne i fiksativ ved stuetemperatur i 50 min.
- Der vaskes tre gange med 200 pi 0,1% PBT med en mikropipette, at være opmærksom på at forlade hjernen i røret.
- Efter den sidste vask fjernes 0,1% PBT og tilsæt det primære antistof-opløsning, fremstilles som følger: tilføj til 196 pi 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 i PBS) 4 pi anti-Chaoptin antistof (slutfortynding 1 : 50) til visualisering af fotoreceptorer.
- Inkubér hjernerne i det primære antistof opløsning ved 4 ° CO / N.
- Vask 3 x med 200 pi 0,1% PBT med en mikropipette.
- Efter den sidste vask fjernes 0,1% PBT og tilsættes 200 pi af 0,3% PBT indeholdende et sekundært antistof.
- Inkubér det i mørke ved 4 ° CO / N.
- Der vaskes tre gange med 200 pi 0,1% PBT med en mikropipette.
- Til montering, sætte to små dråber (2 pi hver) af et monterings medium med en mikropipette ved midten af et objektglas ved ca. 2 cm distance fra hinanden.
- Placer to dækglas, en på hver dråbe og efterlade en smal kløft mellem dækglas på ca. 0,2 mm.
- Placer 15 pi af en monterings medium på toppen af dækglasset og tilsæt hjernerne med en mikropipette i monteringsmedium.
- Under et dissektionsmikroskop, placere hjerner med den ventrale side op i snævert mellemrum mellem de to dækglas (figur 2).
- Placer et dækglas på toppen og forsegle kanterne af dækglasset hjælp klare neglelak at fastsætte modellen (Figur 2).
- Opnå billeder af hjernen med et konfokalt mikroskop. Brug en 63X immersionsolie objektiv (1,4 NA) og en 2.6X digital zoom. Generere mere end 20 optiske sektioner af anden optik ganglion medulla med en trinstørrelse på 0,5 um.
3. generation af Steder, Surface Objekter, Start-point og endepunkter
- For at kvantificere nummer, distribution og flytning niveau af BRP-GFP puncta åbne stakken opnås ved konfokalmikroskopi i billedanalyse software og rekonstruere 3D-billeder (figur 3A). Bemærk, at trinet i denne undersøgelse blev udført med Imaris.
- Identificer BRP-GFP puncta ved stedet detekteringsmodul for hver R8 Axon terminal.
- Vælg "Tilføj nye steder".
- Vælg "Segment kun et område af interesse" i algoritmen indstillinger. Vælg en R8 Axon terminal i medulla manuelt.
- Vælge kilden kanal i BRP-GFP signal.
BEMÆRK: R7 og R8 fotoreceptor-axoner blev immunolabeled med anti-Chaoptin (figur 3A). Kun R8, dog indeholder BRP-GFP puncta og kunne således let skelnes (figur 3A). Endvidere kunne endepunkt R8 identificeres ved udtynding af de anti-Chaoptin-positive axoner ved indgang til M3 medulla lag. - Indstil den anslåede XY diameter to 0,35 um og afkrydse "Baggrund subtraktion" i stedet afsløring.
- Vælg "Kvalitet" i filter type og filtrere automatisk. Klik derefter finish.
- Gentag fra 3.2.1 t- 3.2.5 for andre F axoner (figur 3B).
- For at måle flytning niveau af BRP-GFP i R8 axoner, generere overflade objekter med "Surface" funktion for hver Axon (figur 3C).
- Vælg "Tilføj nye Surfaces".
- Vælg "Segment kun et område af interesse" i algoritmen indstillinger. Vælg derefter en R8 Axon terminaler i medulla manuelt.
- Vælg den kilde kanal af fotoreceptorer.
- Check off "Glat".
- Vælg "Absolute Intensitet" i tærskel.
- Check "Aktiver". "Seed Points Diameter" er 0,5 um.
- Vælg filter type "Kvalitet" og "Antal voxel", og derefter filtrere automamatisk.
- Gå til "Rediger" og slette de stykker af overflader genereret på andre ikke-interessante axoner.
- Gentag fra 3.3.1 - 3.3.8 for andre F axoner (figur 3C). Bemærk nogle overflade genstande blev afbrudt på grund af den tynde og svagt signal i fotoreceptorer på M2 lag, men de blev stadig betragtes som et enkelt objekt fra start til slutpunkter.
- For at identificere fordelingen af BRP-GFP puncta langs hver neuron i medulla neuropil, definere start-point og slutpunkt med målepunktet funktion (figur 3D).
- Vælg "Tilføj nye målepunkter". Vælg derefter "Rediger" og vælg "Surface of Object" til skærer toppen af overfladen objekter.
- Sæt målepunkter på toppen af overfladevand genstande af R axoner i M1 lag i orden. Disse er nu defineret som start-punkter (Figur 3D).
- Vælg "Tilføj nye målepunkter".Vælg derefter "Rediger" og vælg "Surface of Object" til skærer bunden af overfladen objekter.
- Sætte målepunkter på bunden af overfladen genstande af R axoner i M3 lag i orden. Disse er nu defineret som endepunkter (Figur 3D).
- For at trække baggrunden signal fra GFP-kanal, generere overflade objekter, pletter, starte-point og slutpunkter for to R axoner i M6 lag (figur 3E).
- Vælg "Tilføj nye Surfaces".
- Vælg "Segment kun et område af interesse" i algoritmen indstillinger. Vælg derefter en R7 Axon terminal mellem M5 og M6 lag manuelt.
- Vælg den kilde kanal fotoreceptor.
- Check off "Glat".
- Vælg "Absolute Intensitet" i tærskel.
- Vælg filter type "Kvalitet" og "Antal voxels", derefter filtreres automatisk.
- Vælg "Tilføj nye steder";.
- Vælg "Skip automatisk oprettelse, redigere manuelt".
- Vælg "Center of Object" og tilføje en plet i det indre område af overfladen objekt genereret fra 3.5.1 - 3.5.6.
- Gentag fra 3.5.1 - 3.5.9 for en anden R7 Axon terminal.
- Vælg "Tilføj nye målepunkter". Vælg derefter "Rediger" og sætte målepunkter på toppen af de to overflade objekter af spidsen af R7 Axon terminalen i M6 lag. Disse er nu defineret som start-point.
- Vælg "Tilføj nye målepunkter". Vælg derefter "Edit" og sætte målepunkter på bunden af de to overfladeaktive objekter af spidsen af R7 axon terminal i M6 lag. Disse er nu defineret som endepunkter (Figur 3E).
4. Beregning af Antal Steder, distribution af Spot Frekvens og Niveau for Berigelse af BRP-GFP med en Customized Image Data Analysis Software
- Kopier filen"XtquantifySynapseSNR.m" og "funktioner" mappe ind i Imaris XT Matlab mappe. Bemærk, at beregningen i denne undersøgelse blev udført med en tilpasset plugin implementeret i Matlab. Download plugin fra hjemmesiden ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
- Åbn et datasæt med n pletter, n overflader og 2 målepunkt objekter, som hver indeholder n målepunkter (udarbejdet 3,1-3,4). Den første målepunkt objekt definerer start positioner for alle axoner. Det andet målepunkt objekt definerer slutposition alle axoner. Begge målepunkt objekter skal have det samme antal målepunkter (dvs. antallet af axoner).
- Udfør billedbehandling >> CUSTOM> atsushis synapse detektion Vs 6.
- Kontroller metadata og ændre pixel størrelser i billedanalyse software, hvis det ikke er korrekt.
- Vælg kanal for performance af intensiteten analyse af pletter regioner og cytoplasmatiske regioner (den kanal med BRP-GFP).
- Definer filnavnet for at eksportere resultater.
- Definer antallet af skraldespande og Axon længde i procent. Indtast antallet af spande som "10" og udvalg af spande som "100%" (figur 4A og 4B).
- Definer regioner af pletter og de andre cytoplasmatiske regioner for BRP-GFP flytning analyse. Indtast spots radius som "0,35 um" og bredde omkringliggende område som "50 um". Radius spots definerer region for puncta GFP signal (0,35 um diameter, centreret på en punctum). Bredden af omgivelserne definerer region for GFP signal i cytoplasmatiske område (50 um i diameter, centreret om punctum, men inklusive kun R8 og udelukke alle spot områder i cytoplasmaet) (figur 4A og 4C).
- Vent, indtil alle neuron masker behandlesog eksporteres som PDF-filer (figur 4B og 4C) og en csv bord til yderligere analyse i et regneark. CSV Tabellen omfatter antallet af pletter, den gennemsnitlige signal intensitet i "cytoplasmatisk område" og den maksimale signal intensitet i "spot" i hver bin for alle R8 axoner.
- Åbn et datasæt udarbejdet i 3.5 for subtraktion af baggrunden signal.
- Udfør behandling billedet som beskrevet 4,3-4,9.
- Beregn gennemsnittet af det samlede antal og fordelingen af BRP-GFP puncta i et regneark (figurerne 4D og 4E).
- Beregn gennemsnittet af flytning af BRP-GFP signal i et regneark ved forholdet mellem den gennemsnitlige intensitet i "cytoplasmatiske område" divideret med den maksimale intensitet i "spot" subtraheret med den gennemsnitlige intensitet i baggrunden signal (Figur 4F) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Øjet af Drosophila forbindelsen omfatter ~ 780 ommatidia, som hver indeholder otte typer af fotoreceptorer (R1-8). R7 og R8 projekt deres axoner til anden optik ganglion, medulla, hvor de danner synapser i lag M6 og M3 26. For at undersøge effekten af langvarig udsættelse for lys på den molekylære sammensætning af fotoreceptor R8 aktive zoner, tog vi fordel af Star Metode 15. Endogene ekspressionsniveauer af BRP blev fluorescens-mærket ved at vippe ud stopkodonen i BRP-FSF-GFP med en flippase udtrykt i R8 fotoreceptorer afledt fra sens-FLP. Fluerne blev holdt til 1 - 3 dage efter eclosion i LL, LD eller DD i samme periode ved 25 ° C (figur 1A). At udsætte fluerne til 1.000 Lux lys, blev fluerne sat i en acrylharpiks rack (figur 1B) og holdt ved samme afstandfra LED lyskilde i en lille inkubator (figur 1C).
Efter immunfarvning, blev dissekeret hjerner placeret i den smalle mellemrum mellem to dækglas på et objektglas med den ventrale side af hjerner opad til visualisering og kvantificering af BRP-GFP puncta (figur 2). Den resulterende BRP-GFP signal lokaliseret til særskilte puncta inden R8 i medulla (figur 3A).
At tælle antallet og måle fordelingen af BRP-GFP puncta, og vurdere flytning niveau af BRP-GFP signal i R8s, blev en tilpasset billedanalyse software plugin udviklet i en multi-paradigme numerisk computermiljø 9, 27. I første omgang blev puncta detekteret ved en spot detektion funktion for hver R8 (figur 3B). Efterfølgende overflades af hver R8 blev genereret for evaluering af udflytning niveau (figur 3C). Endelig har vi defineret nystartede point og slutpunkter i toppen af M1 lag og bunden af M3 lag på hver fotoreceptor henholdsvis at måle AZ distribution (figur 3D). Surface objekter, pletter, starte-point og endelige point for to R7 Axon terminaler i M6 lag blev også genereret til trække baggrunden signal fra GFP-kanal (figur 3E). Resultaterne af antallet (figur 4D), fordelingen (figur 4A, 4B og 4E) og udflytning niveau (figur 4A, 4C og 4F) er automatisk beregnes af brugerdefinerede plug-in skrevet i en multi-paradigme numerisk computermiljø . Vi fandt, at antallet af BRP diskrete puncta blev reduceret betydeligt i R8 fotoreceptorer af fluer holdes i LL betingelser (figur 4D og 4E). Tilføjeitionally, fandt vi, at R8 synapser blev distribueret langs hele axonal aksel fra M1 til M3 lag, men tætheden var højere ved M1 og M3 lag (Figur 4E). Den udflytning niveau af BRP-GFP var uændret i alle lysforhold (Figur 4F). Dette er i modsætning til lokalisering af en fluorescens mærkede kort version af BRP (BRP-short-kirsebær) 28, der, som vi tidligere rapporteret 9 bliver klart diffunderet i LL (figur 4G). Vi foreslog, at delokaliseret BRP-kort kirsebær signal kan være relateret til uhensigtsmæssig behandling af BRP-kort brudstykke efter adskillelse fra AZ 9. Blandt andre testede AZ proteiner, fluorescens mærkede DLiprin-a eller Drosophila Rim protein (DRBP) konstruktioner viser en reduktion i antallet af puncta og en klar udflytning i LL. I modsætning hertil fluorescens mærkede Dsyd-1 eller Cacophony (CAC) gør ikke vise en forøget cytoplasmatiske signal selv efter LL (figur 4G). Således måler systematisk, om signalet bliver cytoplasmatisk kunne være relevant for at forstå behandlingen af AZ proteiner.
Figur 1: Udarbejdelse af Betingelser for Udsættelse for Defineret lysintensitet. (A) Lette eksponering protokoller efter eclosion. DD, kontinuerlig mørke; LD, 12 timers lys / 12 timer mørke; LL, konstant udsættelse for lys. Fly hjerner blev dissekeret på de angivne tidspunkter i konsollerne (tilpasset fra en tidligere publikation 9). (B) Hætteglas er rettet ind i en tilpasset akryl transparent rack. (C) Den acryliske rack og to LED paneler er sat i en lille inkubator og justeret for at blotlægge fluerne til en lysintensitet på 1.000 lux.s / ftp_upload / 55.176 / 55176fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fremstilling af prøven. (A) Hele monteret hjerne præparater. (B - D) Skematisk tegning af forberedelserne. (C, D) tværsnit af forberedelserne. Den ventrale side af hjernen er op (C) mellem dækglas (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Generation af Steder, Surface Objekter og målepunkter.
Figur 4: Kvantificering af antal, fordeling og Delokalisering Niveau af BRP-GFP puncta. (A) Skematisk tegning af proceduren anvendt til at måle niveauet af delokaliserede BRP-GFP signal i R8. BRP-GFP puncta identificeres og to områder defineres omkring dem: "spot" område og "cytoplasmatisk" område. Den linje, der forbinder start- og endepunkter er underopdelt i 10 partitioner. (B, C) Output fra den tilpassede billedanalyse software plugin skrevet i et multi-paradigme numerisk computermiljø. Hver BRP-GFP punctum koordinat forventes at en linje, der repræsenterer neuron fra start-point til slut-punkt (B). Scale bar, 5 um. BRP-GFP puncta identificeres og to områder defineres omkring dem: den "spot" område og "cytoplasmatisk" område (C), som skematiseret i (A). (D - F) Bar grafer, der sammenligner det samlede antal puncta (D), deres distribution (E) og flytning niveau af BRP-GFP pr R8 Axon (F) i DD (83 axoner / 7 hjerner), LD (107 axoner / 5 hjerner) og LL (226 axoner / 15 hjerner). (G) Bar grafer sammenligner flytning niveau af BRP-kort kirsebær i LD (74 axoner / 7 hjerner) og LL (70 axoner / 5 hjerner), GFP-DLiprin-α i LD (67 axoner / 7 hjerner) og LL (52 axoner / 6 hjerner), GFP-DRBP i LD (70 axoner / 7 hjerner) og LL (83 axoner / 6 hjerner), GFP-Dsyd-1 i LD (48 axoner / 5 hjerner) og LL (69 axoner / 7 hjerner), og CAC--GFP i LD (31 axoner / 5 hjerner) og LL (27 axoner / 5 hjerner). *** P <0,0001, ** p <0,001, * p <0,0 5, ns p> 0,05; uparret t-test med Welch korrektion tosidede. Fejl bar viser standard på middelværdien. Den skematiske tegning i (A) og dataene i (D), (E) og (G) er tilpasset fra en tidligere publikation 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Video: Beskrivelse af databehandling Udføres med Imaris Plugin "Synapse Trafo". Diskussion af databehandling. Denne video indeholder en kort forelæsning til at illustrere koordinattransformationen og databehandling trin udføres af Imaris plugin "synapse_trafo".5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "target =" _ blank "> Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse viste vi, hvordan du forbereder lysforholdene at udsætte fluer i lige lysintensitet. Vi kvantificeres ikke kun antallet af en synaptisk markør puncta men kunne også rumligt løse tætheden af synapser langs axoner og måle flytning niveau af markørproteinet i cytoplasmatiske områder. Disse tre vurderinger giver os mulighed for at vurdere detaljerne i synaptiske dynamik på enkelt neuron niveau i forskellige miljøforhold. Vores protokol kan tilpasses forskellige synaptiske proteiner, men også til alle data, der indeholder punktformig signaler.
Et kritisk trin i protokollen er monteringen af hjerner. Drosophila fotoreceptorer projicere deres axoner til den anden optik ganglion medulla. Hver fotoreceptor axon kan scannes ligetil, hvis de monterede hjerner blev korrekt placeret på et objektglas. Den korrekte montering også gør udvælgelsen af fotoreceptorer med billedanalyse software funktioner lettere. Hver fotoreceptor region kan vælges manuelt til at tælle antallet og flytning niveau af puncta. De start- og slutpunkter også vælges manuelt. Disse præparater kræver forholdsvis lang tid, indtil man kan fortsætte til kvantificering. Fordelen ved R8 axoner er, at de er uforgrenet og hver R8 Axon er adskilt. En simpel isoleret neuron som denne anbefales til disse applikationer, da det er nødvendigt at definere den præcise område af neuron. Desuden er denne hjælper med at slippe af uspecifik puncta og overflader afledt af andre neuroner. En begrænsning ved denne fremgangsmåde er imidlertid, dybden af z projektion. Signalintensiteten af puncta bliver mindre i dybere lag af z stakken. Forberedelse gennemsigtige hjerner ved væv-clearing metoder såsom en SeeDB2 29 kunne bidrage til at overvinde denne begrænsning og tillade billeddannelse af et klart punktformig signal endnu dybere i hjernen.
Vores protocol kan potentielt anvendes til at analysere synaptisk organisation på en nano skala og med direkte billedvisning. Kombinere super-opløsning billeddannelse (f.eks stimuleret emission depletion (STED) mikroskopi, stokastisk optisk genopbygning mikroskopi (STORM), foto aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM), struktureret belysning mikroskopi (SIM) etc.) med teoretisk modellering har avancerede vores forståelse af struktur og molekylære dynamik synapser. For eksempel blev den nanoskopiske organisering af BRP evalueret ved en enkelt molekylær opløsning med super-opløsning billeddannelse ved direkte STORM (d STORM) på Drosophila NMJ 30. Vores protokol blev tilpasset til kvantificering af dynamikken i en enkelt aktiv zone molekylet ved en præsynaptisk aktive zone og en enkelt postsynaptisk receptor på en postsynaptisk zone til yderligere at forstå hvordan synapser er reguleret på en mekanistisk niveau. Desuden kunne vores protokol anvendes til at visualisere molekylærebevægelse ved synapser i levende dyr. Faktisk kan BRP-GFP visualiseres uden at være afhængig immunfarvning. Således har præsynaptisk udvikling i R8 axoner blevet afbildet i levende dyr med to-foton mikroskopi 15. Det er muligt at spore punktformet signal af aktive zone komponenter i levende dyr ved at detektere og analysere pletter på forskellige tidspunkter siden overfladerne og positioner specifikke neuroner er defineret i vores protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for T. Stürner for nyttige rettelser, diskussioner og kommentarer til manuskriptet; SL Zipursky for at give flyve bestande; M Schölling til udførelse billedbehandling. En del af billedet analyse gennemføres ved A. Kakita laboratorium. Dette arbejde blev støttet af Alexander von Humboldt Foundation og JSP'er stipendier til forskning i udlandet (AS), JSP'er Fellows (SH-S.), Grant-In- Støtte til opstart (24.800.024), om innovative områder (25.110.713), Mochida, Takeda Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE grundfinansiering (GT) og DZNE Light Microscopy Facility (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
