Summary
여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.
Abstract
신경계는 적응하고 다양한 자극에 반응하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 이 신경 조정은 크게 시냅스 수준에서 소성을 통해 달성된다. 활성 영역 (AZ)는 신경 전달 물질 방출을 매개과 골격 단백질의 조밀 한 컬렉션으로 구성되어 시냅스 막에서의 영역이다. 노랑 초파리의 AZS은 (초파리) 광 수용체 자연 주변 광에 장시간 노출 된 후 분자 리모델링을 받다. 따라서, 신경 세포 활성도의 레벨은 AZ의 분자 성분을 재 배열하여 출력 기능의 조절에 기여할 수있다.
면역 조직 화학에 빛을 노출 설정 준비에서 시작,이 프로토콜은 수, 공간적 분포 및 초파리의 광 수용체에 AZS에서 시냅스 분자의 비편 재화 수준을 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이미지 분석 SOF 사용tware의 GFP 융합 AZ 구성 요소 Bruchpilot의 클러스터는 각 R8의 광 수용체 (R8) 축삭 터미널 확인되었다. 감지 Bruchpilot 명소가 자동으로 개별 R8의 축삭에 할당되었다. 축삭을 따라 자리 주파수의 분포를 계산하기 위해, 우리는 사용자 정의 소프트웨어 플러그인을 구현했습니다. 각 축삭의 시작 지점과 끝 지점을 수동으로 정의 된 각 Bruchpilot 지점의 위치는 시작과 끝 지점 사이의 연결 라인에 투영되었다. Bruchpilot 클러스터의 수 외에, 우리는 또한 클러스터 내의 Bruchpilot-GFP의 비편 재화 수준을 정량화. 이러한 측정은 서로 다른 환경 조건 하에서 단일 신경 세포의 공간적 해결 시냅스 역학 자극에 구체적으로 반영합니다.
Introduction
시냅스 기능의 변조를 정확하게 대응 자극이나 환경 변화에 적응할 수있는 신경계의 놀라운 능력에 기여한다. 시냅스 소포 방출 확률을 조정 한 시냅스 강도를 제어하는 하나의 방법이다. 시냅스 소포 릴리스는 활성 영역 (AZ), 시냅스 막 2의 전문 영역에서 발생한다. AZ는 특정 단백질 (3)의 카세트, (4)에 의해 특징입니다. AZ 어셈블리에 기여하는 대부분의 단백질은 매우 선충, 곤충, 포유류 (5)에 보존되어있다. 최근의 연구는 신경 활동의 레벨이 차례로 모두 시험 관내 및 생체 내 (6, 7)의 출력 기능의 조절에 기여 AZ, 분자 조성을 조절하는 것을 제안> 8. 우리는 이전에 광 수용체 AZS 자연 환경 광 (9)에 장시간 노출 된 후 초파리의 분자 리모델링을 겪는 것으로 나타났습니다. 이 상태에서는 Bruchpilot (BRP) 양성 AZS 수가 감광체 축삭 감소되었음을 관찰 하였다.
BRP / CAST / ELKS 가족 단백질은 척추 동물과 무척추 동물의 시냅스 (10) AZS의 기본 빌딩 블록입니다. 초파리 BRP 돌연변이 체에서 소포 자료, 12 (11)을 억제 유발. BRP 17의 C 말단 아미노산 잔기는 초파리 신경근 접합 (NMJ) (13) (14)에 연접 소포 클러스터링 필수적이다. 이 연구는 AZ의 조직과 기능에서이 분자의 중심 역할을 보여 주었다. 재조합 (STAR), BRP와 최근에 개발 된 유전 도구, 시냅틱 태그와내인성 발현 수준 번의 시냅스 해상도 15, 특정 유형의 세포에서 생체 내에서 관찰 할 수있다. 이 도구는 가능한 정량적 복소 중추 신경계의 시냅스 내인성 역학을 평가한다.
공 초점 현미경에서 얻은 정보에 기초하고 시냅스의 정량화를 포함한 여러 연구가 있었다. 시냅스 변화는 길이, 면적, 체적 밀도를 측정하고 정교한 소프트웨어 애플리케이션에 기초하여 상기 수를 계수하여 평가 하였다. 예를 들어, 프리웨어 ImageJ에 총 시냅스 영역 및 초파리 NMJ 16 시냅스 농도를 측정하는 정량 방법을 제공한다. 사전 및 시냅스 마커의 colocalization을 사이트의 수는 ImageJ에 소프트웨어 플랫폼 (17)에서 사용할 수있는 플러그인 "puncta의 분석"을 사용하여 정량화하고있다. 대안 적으로, 다중 파adigm 수치 컴퓨팅 환경을 기반으로 프로그램 시냅스 검출기 (신디케이트)는 자동 형광 마커로 표지 된 신경 돌기를 추적 한 다음, 전지 본체 (18)로부터의 거리의 함수로서 시냅스 단백질 수준을 정량화 할 수있다. 소프트웨어 시냅스 puncta의 분석 (SynPAnal)은, 공 초점 형광 현미경으로부터 취득 뉴런의 2 차원 영상의 신속한 분석을 위해 설계되었다. 이 소프트웨어의 주요 기능은 단백질 puncta의 (19)의 밀도 및 강도의 자동적이고 빠르게 정량화이다. 최근, 자동 학습 기반 시냅스 검출 알고리즘은 3 차원 시각화 이용한 분석 (Vaa3D) 소프트웨어 (21)을 활용 3D 20 시냅스 수 정량에 대해 생성되었다.
상용 이미지 분석 소프트웨어는 또한 시냅스 정량화를위한 강력한 도구입니다. 예를 들어, 형광표지 된 신경 전달 물질 수용체 또는 시냅스 AZ 구성 요소는 C에서 단일 시냅스 해상도 22 엘레 간스 또는 시냅스의 수백을 허용 초파리 후각 시스템 23, 24, 빠르게 하나의 샘플에서 특징으로하는 세 차원으로 정량화되고있다.
여기서는 사용자 정의 이미지 분석 소프트웨어에 의한 방법을 제시 플러그 그들의 수, 분포 및 분자량 성분의 농축 수준으로 포함 AZS의 반자동 여러 양상을 분석 할 수있는 멀티 패러다임 수치 컴퓨팅 환경에서 구현 AZ. 따라서,이 복잡한 분석은 서로 다른 환경 조건 하에서 축삭 터미널에서 시냅스 구성 요소의 역학을 평가하기 위해 우리를 허용했다. 우리는 성인 플라이 광 수용체의 출력 시냅스에 빛 노출의 효과를 조사 하였다. 프로 시저가 세 단계로 수행된다 : 1)노광, 2) 해부, 면역 조직 화학 및 공 초점 이미징, 3) 이미지 분석을위한 준비.
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Protocol
이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 독점적으로 초파리와 함께 작동 것을 포함하고 독일과 일본에서 동물 복지 법률을 실시하지 않습니다.
1. 빛 노출 조건
- 광 수용체 R8 뉴런 (의 R8)에 BRP-GFP를 시각화 sensless-flippase (SENS-FLP) 및 bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15를 가지고 파리를 준비합니다. 세균 인공 염색체 (BAC) 내의 게놈 궤적 인코딩 BRP이 BRP-FSF-GFP 구조를 생성하도록 수정되었습니다. 이 변형 BAC에게 BRP-GFP의 발현을 수행 파리에서 내인성 조절 서열의 제어하에, 그러나 FRT-STOP-FRT 카세트 (15)의 sensless-flippase - 매개 R8 제거한 후 광 수용체로 제한. SENS-FLP 거의 R7S에 flippase 없음을 표현합니다.
- 12 시간 리에서 파리를 유지우화 (그림 1A)까지 유충 단계에서 25 ° C에서 GHT / 12 시간 다크 사이클 (LD).
- 우화 후 6 시간과 비행 음식을 포함하는 새로운 유리 병에 그들을 배치 - 파리 0를 수집합니다.
- 세 단계 (41cm, 높이 21 cm의 기재 4 cm의 두께와 각 단계 13cm 높이) (도 1B) 아크릴 수지의 투명 랙에 튜브를 설정한다.
- 디지털 광 측정기 (도 1C)를 사용하여 1,000 룩스의 평균 강도로 조명을 제공하도록 랙과 LED 패널 사이의 거리를 조정한다.
- 1 파리 유지 - 다음 조건 중 하나에 3 일을 : 작은 배양기에서 25 ° C에서 상수 어둠 (DD), 12 시간 조명 / 12 시간 다크 사이클 (LD), 또는 일정한 빛 (LL) (도 1a 및 1C).
2. 해부, 면역 및 이미징
- , 집게와 플라이 뇌를 해부 4 % FO로 해결Chaoptin에 대한 일차 항체 (1시 50분) 이전 실험 절차 (25)에 따라 광 수용체의 시각화를위한 두 번째 항체 rmaldehyde 및 발현 사이. 간단히:
- PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 (0.1 % PBT)를 준비한다. 이 용액을 항체 조직 침투를 개선하기 위해 사용된다.
- 하는 CO 2 패드에 파리를 마취 정확한 유전자형을 분류하고 0.1 % PBT 가득 배양 접시로 전송.
- 프로보 시스 아래에있는 집게를 스틱, 다른 집게로 각각 오른쪽과 왼쪽 눈을 떼어.
- 프로보 시스 뇌에 부착 된 기관을 제거합니다.
- RT에서 0.1 % PBT 150 μL를 포함하는 1.5 ML의 튜브에 집게로 머리를 전송합니다.
- 2.1.3에서 10 분 반복 내 - 2.1.5 가능한 한 많은 두뇌을 얻었다.
- 튜브에 16 %의 포름 알데히드의 50 μL를 추가하고 피펫으로 혼합한다.
- 방에서 정착액에 머리를 품어50 분 동안 온도.
- 튜브에 머리를 떠나지주의를 기울이고, 마이크로 피펫으로 0.1 % PBT 200 μL로 3 회 씻는다.
- 다음 마지막으로 세척 한 후, 제조 된 0.1 %의 PBT를 제거하고 차 항체 용액을 추가 0.3 % PBT (0.3 % PBS 트리톤 X-100) 안티 Chaoptin 항체 4 μL (최종 희석 한 196 μL 추가 : 광 수용체의 시각화를위한 50).
- 4 ° CO / N에서 차 항체 용액에 머리를 품어.
- 마이크로 피펫으로 0.1 % PBT 200 μL 씻을 배.
- 마지막 세척 후, 0.1 % PBT를 제거하고 차 항체를 함유하는 0.3 % PBT 200 μL를 추가한다.
- 4 ° CO / N에서 어둠 속에서 그것을 품어.
- 마이크로 피펫으로 0.1 % PBT 200 μL로 3 회 씻는다.
- 장착 약 2cm의 dista에서 현미경 슬라이드의 중심에 마이크로 피펫으로 장착 매체 (2 μL를 각각의) 두 개의 작은 방울을 넣어서로 NCE.
- 각 드롭에 두 개의 커버 슬립, 하나를 놓고 약 0.2 mm의 커버 슬립 사이의 좁은 간격을 둡니다.
- 커버 슬립의 상단에 장착 매체의 15 μL를 넣고 설치 매체에 마이크로 피펫으로 머리를 추가합니다.
- 해부 현미경, 두 개의 커버 슬립 사이의 좁은 틈 (그림 2)에 최대 복부 측면과 두뇌를 놓습니다.
- 상단에 커버 슬립을 놓고 시편 (그림 2)을 해결하기 위해 명확한 매니큐어를 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 밀봉.
- 공 초점 현미경으로 뇌의 이미지를 얻습니다. 63X 기름 침지 대물 렌즈 (1.4 NA) 및 2.6 디지털 줌을 사용합니다. 0.5 ㎛의 스텝 사이즈를 상기 제 2 광섬유 신경절 수질 20 개 이상의 광 부분을 생성한다.
반점, 표면 개체, 시작 포인트 및 엔드 포인트의 3 세대
- 의 DISTR을 수를 정량화하기ibution과 BRP-GFP의 puncta의 비편 재화의 레벨은, 이미지 분석 소프트웨어에 공 초점 현미경에 의해 얻어지는 스택을 열고 3D 영상 (도 3a)를 재구성한다. 이 연구의 단계가 Imaris 수행 하였다합니다.
- 각 R8의 축삭 터미널 자리 검출 모듈에 의해 BRP-GFP의 puncta의를 식별합니다.
- "새로운 관광 명소를 추가"를 선택합니다.
- 알고리즘 설정에서 "관심의 세그먼트 만 지역"을 선택합니다. 수동으로 수질의 R8의 축삭 터미널을 선택합니다.
- BRP-GFP 신호의 소스 채널을 선택합니다.
참고 : R7 및 R8 광 수용체의 축색 돌기가 반 Chaoptin (그림 3A)와 immunolabeled했다. 만 R8은, 그러나, BRP-GFP의 puncta에 포함되어있어 쉽게 (그림 3A) 구분 될 수있다. 또한, R8의 종점은 M3의 수질 층 진입 점에서 반 Chaoptin 양성 축삭의 씨닝에 의해 식별 될 수있다. - 추정 XY 직경 t 설정ㅇ 0.35 μm의 그 자리 검출에 "배경 빼기를"오프 확인합니다.
- 필터 유형에서 "품질"을 선택하고 자동으로 필터링합니다. 다음 마침을 클릭합니다.
- 다른 R 축삭 (그림 3B)에 대한 3.2.1 T-3.2.5에서 반복합니다.
- , R8 축삭의 BRP-GFP의 비편 재화 수준을 측정하는 각각의 축삭 (그림 3C)의 "표면"기능과 표면 객체를 생성합니다.
- "새로운 표면 추가"를 선택합니다.
- 알고리즘 설정에서 "관심의 세그먼트 만 지역"을 선택합니다. 수동으로 수질의 R8의 축삭 단자를 선택합니다.
- 광 수용체의 소스 채널을 선택합니다.
- "부드럽게"오프 확인합니다.
- 임계 값에 "절대 강도"를 선택합니다.
- 확인 "사용". "씨 포인트 직경은"0.5 μm의입니다.
- 선택 필터 유형 "품질"과 "복셀의 수"를 선택한 후, 사설 필터링으.
- "편집"로 이동 및 기타 비 흥미로운 축삭에서 발생하는 표면의 조각을 삭제합니다.
- 다른 R 축삭 (그림 3C)에 대한 3.3.8 - 3.3.1에서 반복합니다. 주 표면 일부 개체 때문에 박형화 및 M2 층에서의 감광체의 약한 신호의 방해 되었으나, 이들은 여전히 시작에서 끝 지점에 하나의 오브젝트로 간주 하였다.
- 수질의 neuropil의 각 신경 세포를 따라 BRP-GFP의 puncta의 분포를 확인하려면, 측정 지점 기능 (그림 3D)로 시작 지점과 끝 지점을 정의합니다.
- "새로운 측정 포인트를 추가"를 선택합니다. 그런 다음 "편집"을 선택하고 표면 객체의 상단과 교차하는 "개체의 표면"을 선택합니다.
- 위해 M1 층에서 R 축삭의 표면 객체 위에 측정 포인트를 넣습니다. 이 이제 시작 지점 (그림 3D)로 정의됩니다.
- "새로운 측정 포인트를 추가"를 선택합니다.그런 다음 "편집"을 선택하고 표면 객체의 바닥과 교차하는 "개체의 표면"을 선택합니다.
- 위해서는 M3 층 R 축삭의 표면 물체의 저면에 측정점을 넣어. 이들은 지금 엔드 포인트 (그림 3D)로 정의됩니다.
- 는 GFP 채널에서 배경 신호를 빼 M6 층 (그림 3E)에 두 개의 R 축삭에 대해 표면 객체, 관광 명소, 시작 지점과 끝 지점을 생성합니다.
- "새로운 표면 추가"를 선택합니다.
- 알고리즘 설정에서 "관심의 세그먼트 만 지역"을 선택합니다. 수동 M5와 M6 층 사이에 R7의 축삭 터미널을 선택합니다.
- 광 수용체의 소스 채널을 선택합니다.
- "부드럽게"오프 확인합니다.
- 임계 값에 "절대 강도"를 선택합니다.
- 선택 필터 유형 "품질"과 "복셀의 수", 자동으로 필터링 할 수 있습니다.
- "새로운 관광 명소를 추가"를 선택;.
- "수동으로 편집, 자동 생성을 건너 뛰기"를 선택합니다.
- "개체의 센터"를 선택하고 3.5.1에서 발생하는 표면 객체의 내부 지역에 지점을 추가 - 3.5.6.
- 다른 R7의 축삭 터미널 3.5.9 - 3.5.1에서 반복합니다.
- "새로운 측정 포인트를 추가"를 선택합니다. 그런 다음 "편집"을 선택하고 M6 층에서 R7의 축삭 단자의 팁의 두 표면 객체 위에 측정 포인트를 넣어. 이 이제 시작 지점으로 정의된다.
- "새로운 측정 포인트를 추가"를 선택합니다. 그런 다음 "편집"을 선택하고 M6 층에서 R7의 축삭 단자의 팁의 두 표면 객체의 바닥에 측정 지점을했습니다. 이들은 지금 엔드 포인트 (그림 3E)로 정의됩니다.
관광 명소의 번호 4. 계산, 스팟 주파수 및 배포 사용자 정의 된 이미지 데이터 분석 소프트웨어와 BRP-GFP의 농축 수준
- 파일을 복사"XtquantifySynapseSNR.m"및 Imaris XT matlab에 폴더에 "기능"폴더. 이 연구에서 계산 matlab에 구현 된 사용자 정의 플러그인을 실시 하였다합니다. 웹 사이트 (에서 플러그인을 다운로드 https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
- N 관광 명소, n은 표면이 측정 점 개체, (- 3.4 3.1에서 준비) 각각 포함하는 n 개의 측정 포인트 데이터 집합을 엽니 다. 제 1 측정 포인트 객체는 모든 축삭의 시작 위치를 정의한다. 두 번째 측정 포인트 객체는 모든 축삭의 끝 위치를 정의한다. 두 측정점 개체 측정점 동일한 수 (즉 축삭의 수이다)이 필요.
- 실행 이미지 처리 >> CUSTOM는> 시냅스 감지 6 대 atsushis.
- 메타 데이터를 확인하고 정확하지 않은 경우 이미지 분석 소프트웨어의 픽셀 크기를 변경합니다.
- 반환 한 선택 채널스폿 영역 및 세포질 영역 (BRP-GFP와 채널)의 강도를 분석 필요치 않는.
- 결과를 내보낼 파일 이름을 정의합니다.
- 백분율 빈들 및 엑손 길이의 수를 정의한다. "10"로 빈과 "100 %"(도 4a 및도 4b)와 같은 빈의 범위의 번호를 입력합니다.
- BRP-GFP의 비편 재화 분석 스폿 다른 세포질 영역의 영역을 정의한다. 입력 반점은 "0.35 μm의"와 "50 μm의"로 주변 지역의 폭으로 반경. 스폿 반경 (하나 누점 중심 0.35 ㎛의 직경)을 puncta에의 GFP 신호를위한 영역을 정의한다. 주변 지역의 폭은 세포질 영역에서 GFP 신호를위한 영역 정의 (누점 중심 50㎛의 직경 있지만 R8 포함 세포질에서 모든 반점 영역을 제외하고) (도 4a 및도 4c).
- 모든 신경 세포 마스크가 처리 될 때까지 기다립니다그리고 PDF 파일 (도 4b 및도 4c)와 스프레드 시트에 추가 분석을 위해 CSV 테이블로 수출했다. csv로 테이블 스폿의 수는 "세포질 영역"및 모든 R8 축삭 각 bin에 "얼룩"의 최대 신호 강도의 평균 신호 세기를 포함한다.
- 배경 신호의 공제 3.5에서 제조 된 데이터 집합을 엽니 다.
- 4.9-4.3에서 설명한 바와 같이 화상 처리를 수행한다.
- 총 수의 평균 스프레드 시트 (도 4D 및 4E)의 BRP-GFP의 puncta의 분포를 계산합니다.
- 상기 배경 신호의 평균 휘도 감산 "스팟"의 최대 강도로 나눈 "세포질 영역"의 평균 강도의 비에 의해 스프레드 BRP-GFP 신호의 비편 재화의 평균을 계산한다 (도 4F) .
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Representative Results
초파리의 겹눈은 ~ 780 ommatidia, 개안을 포함, 광 수용체 각각 포함 8 종류 (R1-8). R7 및 R8 프로젝트가 층 M6와 M3, 각각 26 시냅스를 형성하는 두 번째 광학 신경절, 수질, 그들의 축삭. 광 수용체 R8 활성 영역의 분자 구성에 빛에 장시간 노출의 영향을 조사하기 위해, 우리는 별 방법 (15)을 이용했다. BRP의 내생 발현 수준은 형광 영상 축적 FLP에서 파생 된 R8의 광 수용체 표현 된 flippase와 BRP-FSF-GFP의 종결 코돈을 뒤집기로 표시 하였다. 25 ° C (그림 1A)에서 시간의 같은 기간 LL, LD 또는 DD의 우화 후 3 일 - 파리 1 동안 유지되었다. 1000 룩스의 빛에 노출시키기 파리, 파리는 아크릴 수지 랙 (도 1b)로 설정하고 동일한 거리를 유지했다작은 인큐베이터 (그림 1C)의 LED 광원에서.
면역 염색 후, 해부 뇌는 BRP-GFP의 puncta의 시각화 및 정량화를 위해 위를 향 뇌 (그림 2)의 복부 측면과 현미경 슬라이드에 두 개의 커버 슬립 사이의 좁은 틈에 배치했다. 수질 (그림 3A)에서 R8 내에서 별개의 puncta의 언어로 번역 결과 BRP-GFP 신호.
개수를 세고 BRP-GFP의 puncta의 분포를 측정하고,의 R8의 BRP-GFP 신호의 비편 재화 수준을 평가하기 위해, 사용자 정의 이미지 분석 소프트웨어 플러그인 멀티 패러다임 수치 컴퓨팅 환경 (9), (27)에서 개발되었다. 우선, puncta의 각 R8 (그림 3B)에 대한 현장 검출 기능에 의해 발견되었다. 그 후, 표면각 R8의 s는 비편 재화 수준 (그림 3C)의 평가를 위해 생성되었다. 마지막으로, AZ 분포 (도 3D)을 측정하기 위해, 각각 각 감광체에 M1 층의 상부 및 M3 층 하단의 시작 지점과 끝 지점을 정의. 표면 객체, 관광 명소, 시작 지점과 M6 층에 두 개의 R7의 축삭 터미널 엔드 포인트는 GFP 채널 (그림 3E)에서 배경 신호를 빼기 위해 생성되었다. 수 (도 4d), 분포 (도 4a,도 4b 및도 4e)와 비편 재화 레벨의 결과가 (도 4a,도 4c 및도 4F)이 자동 멀티 패러다임 수치 컴퓨팅 환경에서 작성된 플러그인 사용자에 의해 계산되는 . 우리는 BRP 이산 puncta의 수가 크게 LL 조건 (도 4D 및 4E)에 보관 파리의 R8 광 수용체 감소 된 것으로 나타났습니다. 더하다itionally, 우리는 R8의 시냅스가 모두 M3 층에 M1에서 축삭 샤프트를 따라 분포 된 것을 발견하지만, 밀도는 M1과 M3 층 (그림 4E)에서 높았다. BRP-GFP의 비편 재화 수준은 모든 조명 조건 (그림 4 층)에서 불변이었다. 이 찬란 우리가 이전에 9 명확 LL (그림 4 세대)으로 확산된다보고, BRP (BRP 짧은 체리) 28 일의 짧은 버전을 태그 한의 지역화 대조적이다. 우리는 편재 BRP - 짧은 벚꽃 신호가 AZ 9에서 분해 한 후 BRP - 짧은 단편의 부적절한 처리와 관련 될 수 있음을 제안했다. 다른 테스트 AZ 단백질 중, 형광 DLiprin-α 또는 초파리 림 결합 단백질 (DRBP) 구조가 puncta의 수의 감소 및 LL의 명확한 비편 재화를 표시 태그. 대조적으로, 형광 Dsyd-1 또는 불협화음 (CAC)를 수행 태그 심지어 LL (그림 4 세대) 이후 증가 된 세포질 신호를 표시하지. 따라서, 신호 AZ 단백질의 프로세싱을 이해 관련성이있을 세포질된다 체계적 여부를 측정.
그림 1 : 정의 된 빛의 강도에 노출 조건의 준비. (A) 우화 후 노광 프로토콜. DD 연속 어둠; LD, 12 시간 조명 / 12 시간 어두운; LL, 빛에 지속적으로 노출. 플라이 두뇌는 (이전의 출판물 9에서 적응) 괄호에 표시된 시간에 해부했다. (B) 튜브는 사용자 정의 아크릴 투명 랙에 정렬됩니다. (C) 아크릴 래크 개의 LED 패널 작은 인큐베이터에 넣고, 1,000 룩스의 조도에 파리 노출되도록 조정된다.S / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 시편의 준비. (A) 전체 장착 뇌 제제. (B - D) 준비의 개략도. (C, D) 준비의 크로스 섹션. 두뇌의 복부 측면은 커버 슬립 (D)와 (C)까지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 명소, 표면 개체 및 측정 포인트의 생성.
그림 4 : 수, 유통 및 BRP-GFP puncta에의 비편 재화 수준의 정량화. (A) R8에 편재 BRP-GFP 신호의 레벨을 측정하기 위해 사용되는 절차의 개략도. BRP-GFP의 puncta의 식별하고,이 영역은 주위 정의 : "현재"영역과 "세포질"영역을. 시작 - 최종 점을 연결하는 선은 10 파티션에 세분화됩니다. (B, C) 다중 패러다임 수치 컴퓨팅 환경에 기재된 지정 이미지 분석 소프트웨어 플러그인에서 출력. 각 BRP-GFP의 누점이 시작 포에서 신경 세포를 나타내는 선에 투영 좌표(B) 지점을 종료 int로. 스케일 바, 5 μm의. BRP-GFP의 puncta의 식별하고 두 영역 주위 정의된다 : (A)에 도식화 같은 "현재"영역과 "세포 내"영역 (C). (D - F) puncta의 (D), 그 분포 (E) 및 R8 엑손 DD의 (F) 당 BRP-GFP의 비편 재화 레벨 (83 축삭 / 7 뇌), LD의 수를 비교하는 막대 그래프 (107 축삭 / 5 두뇌) 및 LL (226 축삭 / 15 두뇌). 비편 재화의 LD에서 BRP - 짧은 벚꽃의 수준 (74 축삭 / 7 두뇌) 및 LL (70 축삭 / 5 두뇌) LD에서, GFP-DLiprin-α (67 축삭 / 7 두뇌) 및 LL을 비교 (G) 막대 그래프 (52 축삭이 / 6 두뇌), LD에서 GFP-DRBP (70 축삭 / 7 두뇌) 및 LL (83 축삭 / 6 두뇌), GFP-Dsyd-1 LD에서 (48 축삭 / 5 두뇌) 및 LL (69 축삭 / 7 두뇌), 및 LD의 CAC-GFP (31 축삭 / 5 두뇌) 및 LL (27 축삭 / 5 두뇌). *** p <0.0001, ** P <0.001, * P <0.0 5, NS의 P> 0.05; 웰치의 보정 짝 t 테스트는 두 개의 꼬리. 오류 막대는 평균의 표준 오차를 보여줍니다. 의 개략도 (A) 및 (D)에 데이터 (E) 및 (G)는 이전 공보 (9)로부터 구성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 다음 Imaris 플러그인 "시냅스 TRAFO"로 수행 된 데이터 처리의 설명. 데이터 처리 토론. 이 동영상은이 Imaris 플러그인 "synapse_trafo"에 의해 수행 변환 및 데이터 처리 단계를 좌표 설명하는 짧은 강의가 포함되어 있습니다.5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "대상 ="_ 빈 ">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)
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Discussion
본 연구에서는 동일한 빛의 세기에 파리를 노출하는 조명 조건을 준비하는 방법을 보여 주었다. 우리는 단지 시냅스 마커 puncta의 수를 정량 아니라 축삭을 따라 공간적으로 시냅스의 밀도를 해결 세포질 영역에서 마커 단백질의 비편 재화 수준을 측정 할 수있다. 이 세 가지 평가는 우리가 다른 환경 조건에서 단일 신경 세포 수준에서 시냅스 역학의 세부 사항을 평가 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 서로 다른 시냅스 단백질뿐만 아니라 반점 신호를 포함하는 모든 데이터에 적용 할 수 있습니다.
프로토콜 내에서 중요한 단계는 뇌의 장착입니다. 초파리의 광 수용체는 두 번째 광학 신경절 수질에 자신의 축삭 전망이다. 장착 뇌 올바르게 현미경 슬라이드 상에 배치 된 경우, 각 감광체 엑손이 노골적 스캔 할 수있다. 올바른 장착 또한 화상 해석 softwa와 감광체의 선택을하게쉽게 기능을 다시. 각 수광 영역 puncta의 수와 비편 재화 레벨 카운트 수동으로 선택해야한다. 시작 - 최종 지점은 수동으로 선택됩니다. 하나는 정량화를 진행 할 수있을 때까지 이러한 준비는 비교적 긴 시간을 필요로한다. R8 축삭의 장점은 분지 점이다 각 R8 엑손 별도이다. 이와 것과 같은 간단한 격리 된 뉴런은 신경 세포의 정확한 영역을 정의 할 필요가 있기 때문에 이러한 응용 프로그램을 권장합니다. 또한,이 비특이적 puncta의 다른 신경 세포에서 파생 된 표면을 제거하는 데 도움이됩니다. 이 방법에 제한은 있지만, Z 돌기의 깊이이다. puncta에의 신호 강도는 Z 스택 심층 덜 얻는다. 조직 삭제 방법 등 SeeDB2 (29)에 의해 투명 두뇌를 준비하는 것은 이러한 한계를 극복하고도 깊은 뇌에서 명확한 반점 신호의 이미징을 할 수 있도록 도움이 될 수 있습니다.
우리의 프로토COL 잠재적 나노 규모의 라이브 영상과 시냅스 조직 분석을 위해 사용될 수있다. 슈퍼 해상도 영상을 결합하여 이론적 모델링과 우리의 이해를 고급 (예를 들어, 방출 고갈 (STED) 현미경, 확률 적 광 재건 현미경 (STORM), 사진 활성화 된 현지화 현미경 (PALM), 구조화 조명 현미경 (SIM) 등 자극) 구조와 시냅스의 분자 역학. 예를 들어, BRP의 나노 조직 초파리 NMJ 30에서 직접 STORM (d의 STORM)에 의한 초 - 해상도 이미징 단일 분자 해상도 평가 하였다. 우리의 프로토콜은 시냅스 활성 영역에 추가 시냅스는 기계적인 수준에서 조절하는 방법을 이해하는 시냅스 영역에서 단일 시냅스 수용체의 하나의 활성 영역의 분자 역학의 정량화에 대한 적응했다. 또한, 우리의 프로토콜은 분자 시각화하는 데 사용할 수 있습니다살아있는 동물의 시냅스에서 운동. 사실, BRP-GFP는 면역에 의존하지 않고 보여 질 수있다. 따라서, R8 축삭의 연접 개발은 두 광자 현미경 (15)과 살아있는 동물에 몇 군데있다. 이 검출 표면 특정한 뉴런의 위치가 우리의 프로토콜에서 정의되어 있기 때문에 서로 다른 시간 지점에서 지점을 분석함으로써 살아있는 동물에서 활성 존 성분의 점상 신호를 추적 할 수있다.
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Acknowledgments
우리는 원고에 도움이 수정, 토론 및 의견 T. Stürner에 감사하고 있습니다; 플라이 주식을 제공하는 SL Zipursky; 화상 처리를 행하는 M Schölling. 이미지 분석의 일부는 A. Kakita의 실험실에서 수행되었다. 이 작품은, 혁신적인 분야에 시동을위한 알렉산더 폰 훔볼트 재단과 JSPS 동호회 해외 연구 (AS), JSPS 휄로우 (SH-S.), 그랜트-IN- 원조 (24800024), (25110713), 모치다에 의해 지원되었다 다케다, 이나모리, 다이 이치 산쿄, 도레이 재단 (TS), DZNE 핵심 자금 (GT)과 DZNE 광학 현미경 시설 (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
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