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Neuroscience

Analisando Synaptic Modulação da Published: February 10, 2017 doi: 10.3791/55176
Automatic Translation
1,2,5, 3, 4, 1,2, *4, *5
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)
* These authors contributed equally

Summary

Aqui nós mostramos como quantificar o número ea distribuição espacial das zonas ativas sinápticas em fotorreceptores de Drosophila melanogaster, destacou com um marcador molecular geneticamente codificado, e sua modulação após a exposição prolongada à luz.

Abstract

O sistema nervoso tem a notável capacidade de se adaptar e responder a vários estímulos. Este ajuste neural é em grande parte alcançado através de plasticidade no nível sináptico. A zona activa (AZ) é a região na membrana pré-sináptica que medeia a libertação de neurotransmissores e é composto de uma colecção de proteínas densa de andaime. AZs de Drosophila melanogaster (Drosophila) fotorreceptores submetidos a remodelação molecular após a exposição prolongada à luz ambiente natural. Assim, o nível de atividade neuronal pode reorganizar a composição molecular do AZ e contribuem para a regulação da saída funcional.

A partir da exposição à luz preparação set-up para a imuno-histoquímica, os detalhes deste protocolo como quantificar o número, a distribuição espacial, eo nível de deslocalização de moléculas sinápticas em AZs em fotorreceptores de Drosophila. Usando análise de imagem software, foram identificados grupos de o componente AZ fundido-GFP Bruchpilot para cada fotorreceptor R8 (R8) axônio terminal. manchas Bruchpilot detectados foram atribuídos automaticamente a axônios R8 individuais. Para calcular a distribuição de frequência local ao longo do axônio, implementamos um plug-in de software personalizado. -Ponto de partida de cada axônio e ponto final foram definidas manualmente e a posição de cada ponto Bruchpilot foi projetada na linha de conexão entre início e ponto final. Além do número de aglomerados Bruchpilot, nós também quantificado o nível de deslocalização Bruchpilot-GFP dentro dos aglomerados. Estas medidas refletem em detalhe a dinâmica sinápticas espacialmente resolvidos em um único neurônio sob diferentes condições ambientais aos estímulos.

Introduction

A modulação da função sináptica contribui para a notável capacidade do sistema nervoso para responder ou se adaptar às mudanças estímulos ambientais com precisão. Ajustar a probabilidade de liberação de vesículas pré-sináptica é uma forma de controlar a força sináptica 1. Libertação das vesículas sinápticas tem lugar na zona activa (AZ), uma região especializadas da membrana pré-sináptica 2. O AZ caracteriza-se por uma cassete de proteínas específicas 3, 4. A maioria das proteínas que contribuem para a montagem AZ são altamente conservadas em nematóides, insectos e mamíferos 5. Estudos recentes sugerem que o nível de actividade neuronal regula a composição molecular do AZ, que por sua vez contribui para a regulação da saída funcional tanto in vitro como in vivo, 6, 7,> 8. Nós já descobriram que AZs fotorreceptoras submetidos a remodelação molecular em Drosophila após a exposição prolongada à luz ambiente 9 natural. Nesta condição, observou-se que o número de Bruchpilot (Brp) AZs -positivo foi reduzida nos axônios fotorreceptoras.

As proteínas Brp / cast / família ELKS são blocos de construção fundamentais da AZs em vertebrados e invertebrados sinapses 10. Em mutantes BRP Drosophila, evocado liberação da vesícula é suprimida 11, 12. Os resíduos de aminoácido 17 do terminal C da BRP são essenciais para o agrupamento de vesícula sináptica na junção neuromuscular de Drosophila (JNM) 13, 14. Estes estudos demonstraram o papel central desta molécula na organização e na função AZ. Com uma ferramenta genética desenvolvida recentemente, Synaptic Tagging com Recombinação (estrela), a BRPpode ser observado in vivo em tipos específicos de células, a níveis de expressão endógenos e a uma única resolução sinapse 15. Esta ferramenta faz com que seja possível avaliar os dinâmica endógena de sinapses quantitativamente no sistema nervoso central complexo.

Houve diversos estudos, incluindo quantificações sinapse com base em dados obtidos a partir de microscopia confocal. alterações sinápticas foram avaliadas medindo o comprimento, a área, o volume, a densidade e contagem do número baseado em aplicações de software sofisticadas. Por exemplo, o ImageJ gratuito fornece um método de quantificação para o total de área sináptica e medidas de densidade sinápticas no Drosophila JNM 16. O número de sites de co-localização de marcadores pré e pós-sinápticos foram quantificados usando o plugin "puncta Analyzer", disponível na plataforma de software ImageJ 17. Alternativamente, um multi-parprograma baseado adigm ambiente de computação numérica, Synapse Detector (SYND), pode traçar automaticamente dendrites dos neurónios marcados com um marcador fluorescente, e, em seguida, quantifica os níveis de proteína sinápticas como uma função da distância a partir do corpo da célula 18. O software Synaptic puncta Análise (SynPAnal), foi projetado para a rápida análise de imagens 2D de neurônios adquiridos de microscopia confocal ou fluorescente. A principal função deste software é a quantificação automática e rápida da densidade e intensidade dos puncta proteína 19. Recentemente, um algoritmo de detecção automática de sinapse à base de aprendizagem tem sido gerado para a quantificação do número de sinapses em 3D 20, aproveitando-se do software de análise 3D Visualization Assistida (Vaa3D) 21.

comercial da imagem de software de análise também são ferramentas poderosas para quantificações sinápticas. Por exemplo, a fluorescênciareceptores de neurotransmissores marcados ou um componente pré-sináptico AZ foram quantificados em três dimensões com resolução-sinapse único em C. elegans 22 ou o sistema de Drosophila olfactory 23, 24, permitindo que centenas de sinapses para ser caracterizado rapidamente dentro de uma única amostra.

Aqui, nós apresentamos um método, por um software de análise de imagem personalizada plug-in implementada num ambiente de computação numérica multi-paradigma que permite analisar semi-automaticamente os múltiplos aspectos da AZs, incluindo o seu número, a distribuição e o nível de enriquecimento de componentes moleculares de o AZ. Assim, esta análise complexa nos permitiu avaliar a dinâmica de componentes sinápticas em terminais do axônio sob diferentes condições ambientais. Investigou-se o efeito da exposição à luz nas sinapses de fotorreceptores mosca adulta de saída. O procedimento é realizado em três etapas: 1)preparação para a exposição à luz, 2) dissecção, imuno-histoquímica e de imagem confocal, e 3) análise de imagem.

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Protocol

Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo envolvem exclusivamente trabalhar com Drosophila e não estão sujeitas a leis de protecção dos animais na Alemanha e no Japão.

1. As condições de exposição à luz

  1. Prepare moscas que carregam sensless-flipase (sens-flp) e bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 para a visualização Brp-GFP em neurónios R8 fotorreceptoras (R8). A BRP locus de codificação genómica dentro de um cromossoma bacteriano artificial (BAC) foi modificado para gerar esta construção-brp-FSF GFP. Nas moscas portadoras deste modificado BAC a expressão da BRP-GFP está sob o controlo das sequências reguladoras endógenas, mas limitado a R8 fotorreceptores após sensless-flipase remoção mediada FRT da cassete de FRT-Stop-15. Note-se que sens-flp raramente expressa flipase em R7s.
  2. Mantenha as moscas em um 12 h light / 12 h ciclo de escuro (LD) a 25 ° C desde a fase de larva até eclosão (Figura 1A).
  3. Recolher as moscas 0 - 6 h após a eclosão e colocá-los em um novo frasco contendo alimentos mosca.
  4. Definir os frascos em uma cremalheira transparente feito de resina acrílica com três passos (uma altura de 41 cm, uma base de 21 cm, uma espessura de 4 cm e uma altura de 13 cm para cada passo) (Figura 1B).
  5. Ajustar a distância entre a prateleira e um painel de LED para proporcionar a iluminação com uma intensidade média de 1.000 lux usando um medidor digital de luz (Figura 1C).
  6. Manter as moscas para 1-3 d sob uma das condições seguintes: escuridão constante (DD), 12 h 12 h ciclo de luz / escuro (LD), ou a luz constante (LL) a 25 ° C numa pequena incubadora (Figuras 1A e 1C).

2. Dissecção, imuno-histoquímica e imagem

  1. Dissecar cérebros da mosca com uma pinça, corrigi-los com 4% de formaldehyde e imunocoloração com o anticorpo primário contra Chaoptin (01:50) e um segundo anticorpo para a visualização de fotorreceptores com base em procedimentos experimentais anteriores 25. resumidamente:
    1. Prepare 0,1% de Triton X-100 em PBS (0,1% PBT). Esta solução é usada para melhorar a penetração no tecido anticorpo.
    2. Anestesiar moscas em uma almofada de CO 2, resolver o genótipo correta e transferi-los para uma placa de petri preenchida com 0,1% de PBT.
    3. Furar a pinça sob a tromba e retirar os olhos direito e esquerdo, respectivamente, com os outros fórceps.
    4. Remover a tromba e a traqueia ligado ao cérebro.
    5. Transferir o cérebro com a pinça para um tubo de 1,5 mL contendo 150 uL de 0,1% de PBT à TA.
    6. Dentro de 10 min de repetição 2.1.3 - 2.1.5 para obter o máximo de cérebros quanto possível.
    7. Adicionar 50 ul de 16% de formaldeído para o tubo e misturar por pipetagem.
    8. Incubar o cérebro em fixador na salatemperatura durante 50 min.
    9. Lavar três vezes com 200 uL de 0,1% de PBT com uma micropipeta, prestando atenção para deixar os cérebros no tubo.
    10. Após a última lavagem, remover o PBT 0,1% e adicionar a solução de anticorpo primário, preparado como se segue: adicionar 196 uL de 0,3% de PBT (0,3% de Triton X-100 em PBS) 4 uL de anticorpo anti-Chaoptin (diluição final 1 : 50) para visualização dos fotorreceptores.
    11. Incubar os cérebros na solução de anticorpo primário a 4 ° CO / N.
    12. Lavar 3x com 200 uL de 0,1% de PBT com uma micropipeta.
    13. Após a última lavagem, remover o PBT 0,1% e adicionar 200 uL de 0,3% a PBT contendo um anticorpo secundário.
    14. Incubar no escuro a 4 ° CO / N.
    15. Lavar três vezes com 200 uL de 0,1% de PBT com uma micropipeta.
  2. Para a montagem, colocar duas pequenas gotas (2 mL cada) de um meio de montagem com uma micropipeta no centro de uma lâmina de microscópio em aproximadamente 2 cm distaNCE um do outro.
  3. Coloque duas lamelas, um em cada gota e deixar uma abertura estreita entre as lamelas de aproximadamente 0,2 mm.
  4. Colocar 15 mL de um meio de montagem na parte superior da lamela e adicionar os cérebros com uma micropipeta para o meio de montagem.
  5. Sob um microscópio de dissecação, a posição do cérebro com o lado ventral para cima para dentro do intervalo estreito entre as duas lamelas (Figura 2).
  6. Coloque uma lamela em cima e selar as bordas da lamela usando unha polonês claro para corrigir a amostra (Figura 2).
  7. Obtenção de imagens do cérebro com um microscópio confocal. Use uma lente de 63X de imersão em óleo objectivo (1,4 NA) e um zoom digital 2,6X. Gerar mais de 20 seções ópticas da segunda medula gânglio óptico com um tamanho de passo de 0,5 mm.

3. Geração dos pontos, objetos de superfície, Start-pontos e pontos finais

  1. Para quantificar o número, distribution e o nível de deslocalização da BRP-GFP pontos lacrimais, abrir a pilha obtidas por microscopia confocal de software de análise de imagem e reconstituir imagens 3D (Figura 3A). Note-se que o passo neste estudo foi realizado com Imaris.
  2. Identificar o puncta Brp-GFP pelo módulo de detecção de ponto para cada terminal axônio R8.
    1. Selecione "Adicionar novos Spots".
    2. Selecione "Segmento de apenas uma região de interesse" nas configurações do algoritmo. Escolha um terminal axônio R8 na medula manualmente.
    3. Selecione o canal de origem do sinal Brp-GFP.
      NOTA: Os axónios fotorreceptoras R7 e R8 foram immunolabeled com anti-Chaoptin (Figura 3A). Apenas a R8, embora, contém Brp-GFP pontos lacrimais e poderia, assim, ser facilmente distinguidas (Figura 3A). Além disso, o ponto de extremidade de R8 pode ser identificado pelo desbaste dos axónios anti-Chaoptin-positivos no ponto de entrada para a camada de medula M3.
    4. Definir o diâmetro XY estimada to 0,35 mm e verificar off "subtração" na detecção de ponto.
    5. Seleccione "Qualidade" no tipo de filtro e filtrar automaticamente. Em seguida, clique em Concluir.
    6. Repita a partir do 3.2.1 t- 3.2.5 para outros axônios R (Figura 3B).
  3. Para medir o nível de deslocalização da BRP-GFP nos axônios R8, gerar objetos de superfície com a função de "Surface" para cada axônio (Figura 3C).
    1. Selecione "Adicionar novas superfícies".
    2. Selecione "Segmento de apenas uma região de interesse" nas configurações do algoritmo. Em seguida, selecione uma terminais do axônio R8 na medula manualmente.
    3. Selecione o canal de origem dos fotorreceptores.
    4. Verifique fora "Smooth".
    5. Seleccionar "intensidade absoluta" no limiar.
    6. Marque a opção "Ativar". "Pontos de origem" de diâmetro é de 0,5 uM.
    7. Selecionar tipo de filtro "Qualidade" e "Número de voxels", e depois filtrar automaticacamente.
    8. Vá em "Editar" e excluir os pedaços de superfícies geradas em outros axônios não interessantes.
    9. Repita a partir do 3.3.1 - 3.3.8 para outros axônios R (Figura 3C). Nota Alguns objetos de superfície foram interrompidos por causa da magreza e o sinal fraco em fotorreceptores na camada M2, mas eles ainda eram considerados como um único objeto do início ao pontos finais.
  4. Para identificar a distribuição dos puncta Brp-GFP ao longo de cada neurônio na neurópilo medula, definir o ponto de partida e ponto-final com a função de ponto de medição (Figura 3D).
    1. Selecione "Adicionar novos pontos de medição". Em seguida, selecione "Editar" e selecione "Superfície do objeto" a interseção com a parte superior dos objetos de superfície.
    2. Coloque pontos de medição em cima dos objetos de superfície de axônios R na camada M1 em ordem. Estas são agora definidos como start-pontos (Figura 3D).
    3. Selecione "Adicionar novos pontos de medição".Em seguida, selecione "Editar" e selecione "Superfície do objeto" a interseção com a parte inferior dos objetos de superfície.
    4. Coloque pontos de medição na parte inferior dos objectos de superfície de axónios R em camada M3 em ordem. Estas são agora definidos como pontos finais (Figura 3D).
  5. Para subtrair o sinal de fundo do canal de GFP, gerar objetos de superfície, manchas, começar pontos e pontos finais de dois axônios R na camada M6 (Figura 3E).
    1. Selecione "Adicionar novas superfícies".
    2. Selecione "Segmento de apenas uma região de interesse" nas configurações do algoritmo. Em seguida, selecione um terminal axônio R7 entre a camada M5 e M6 manualmente.
    3. Selecione o canal de origem do fotorreceptor.
    4. Verifique fora "Smooth".
    5. Seleccionar "intensidade absoluta" no limiar.
    6. Escolha um filtro do tipo "Qualidade" e "Número de voxels", em seguida, filtrar automaticamente.
    7. Selecione "Adicionar novos Spots";.
    8. Selecione "Ir criação automática, editar manualmente".
    9. Selecione "Centro de Objeto" e adicionar um local na área interna do objeto de superfície gerada a partir de 3.5.1 - 3.5.6.
    10. Repita a partir do 3.5.1 - 3.5.9 para outro terminal axônio R7.
    11. Selecione "Adicionar novos pontos de medição". Em seguida, selecione "Editar" e colocar pontos de medição na parte superior dos dois objetos de superfície da ponta do axônio terminal R7 na camada M6. Estas são agora definidos como start-pontos.
    12. Selecione "Adicionar novos pontos de medição". Em seguida, selecione "Editar" e colocar pontos de medição na parte inferior dos dois objetos de superfície da ponta do axônio terminal R7 na camada M6. Estas são agora definidos como pontos finais (Figura 3E).

4. Cálculo do número de manchas, Distribuição da Frequência Spot e nível de enriquecimento da BRP-GFP com uma imagem personalizada Software de Análise de Dados

  1. Copie o arquivo"XtquantifySynapseSNR.m" e a pasta "funções" para a pasta Matlab Imaris XT. Observe que o cálculo neste estudo foi realizado com um plug-in personalizado implementado em Matlab. Faça o download do plug-in no website ( https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
  2. Abra um conjunto de dados com n pontos, on superfícies e 2 objetos de ponto de medição, cada uma contendo pontos de medição n (preparados a partir de 3,1 - 3,4). O primeiro objeto de ponto de medição define as posições de início para todos os axônios. O segundo objeto ponto de medição define a posição final de todos os axônios. Ambos os objectos ponto de medição precisa de ter o mesmo número de pontos de medição (que é o número de axónios).
  3. Executar o processamento de imagem >> CUSTOM> atsushis detecção sinapse Vs 6.
  4. Verifique metadados e alterar o tamanho do pixel em software de análise de imagem no caso, não é correto.
  5. Escolha um canal para o performance da análise da intensidade das regiões pontos e regiões citoplasmáticos (o canal com Brp-GFP).
  6. Definir o nome do arquivo para exportar os resultados.
  7. Definir o número de caixas e comprimento do axônio em por cento. Digite o número de caixas como "10" e conjunto de posições como "100%" (Figuras 4A e 4B).
  8. Definem as regiões de as manchas e as outras regiões citoplasmáticas para a análise deslocalização Brp-GFP. Introduza pontos RADIUS como "0,35 mm" e largura da área como "50 mm" circundante. O raio pontos define a região para o sinal de puncta GFP (0,35 mm de diâmetro, centrado em um punctum). A largura da área circundante define a região para o sinal de GFP no domínio citoplasmático (50 um de diâmetro, centrado no ponto lacrimal, mas inclui apenas R8 e excluindo todas as áreas especiais no citoplasma) (Figuras 4A e 4C).
  9. Espere até que todas as máscaras de neurônios são processadose exportados como arquivos PDF (Figuras 4B e 4C) e uma mesa de CSV para posterior análise em uma planilha. A tabela CSV inclui o número dos pontos, a intensidade média do sinal na "área citoplasmática" e a intensidade máxima do sinal no "spot" em cada caixa para todos os axónios R8.
  10. Abra um conjunto de dados preparados em 3,5 para a subtração do sinal de fundo.
  11. Executar o processamento de imagem como descrito 4,3-4,9.
  12. Calcule a média do número total e a distribuição do puncta Brp-GFP em uma planilha (Figuras 4D e 4E).
  13. Calcula-se a média da deslocalização do sinal Brp-GFP em uma folha de cálculo, a razão entre a intensidade média na "área citoplasmática" dividida pela intensidade máxima no "spot" subtraída pela intensidade média do sinal de fundo (Figura 4F) .

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Representative Results

O olho composto de Drosophila compreende ~ 780 ommatidia, cada um contendo oito tipos de fotorreceptores (R1-8). R7 e R8 projeto de seus axônios para o segundo gânglio óptico, a medula, onde formam sinapses em camadas M6 e M3, respectivamente 26. Para investigar o efeito da exposição prolongada à luz sobre a composição molecular de fotorreceptoras R8 zonas ativas, tiramos vantagem do método STaR 15. Os níveis de expressão endógenos da BRP foram fluorescente etiquetado por lançando o códon de parada na BRP-FSF-GFP com um flipase expressos em fotorreceptores R8 derivados da sens-flp. As moscas foram mantidas durante 1-3 d após a eclosão em LL, LD ou DD para o mesmo período de tempo a 25 ° C (Figura 1A). Para expor as moscas a 1000 lux de luz, as moscas foram criadas em uma cremalheira resina acrílica (Figura 1B) e manteve-se à mesma distânciaa partir da fonte de luz LED numa pequena incubadora (Figura 1C).

Após imunocoloração, cérebros dissecados foram colocados dentro do intervalo estreito entre duas lamelas numa lâmina de microscópio com o lado ventral do cérebro viradas para cima para a visualização e quantificação dos pontos lacrimais Brp-GFP (Figura 2). O sinal resultante Brp-GFP localizada pontos lacrimais distinta dentro R8 na medula (Figura 3A).

Para contar o número e medir a distribuição da BRP-GFP puncta, e avaliar o nível de deslocalização de sinal Brp-GFP em R8, uma análise de imagem plug-in de software personalizado foi desenvolvido em uma multi-paradigma ambiente de computação numérica 9, 27. Em primeiro lugar, pontos lacrimais foram detectados por uma função de detecção de ponto para cada R8 (Figura 3B). Posteriormente, a superfícieS de cada R8 foram gerados para a avaliação do nível de deslocalização (Figura 3C). Finalmente, nós definimos o arranque de pontos e de pontos finais na parte superior da camada de M1 e o fundo da camada de M3 de cada fotoreceptor, respectivamente, para medir a distribuição AZ (Figura 3D). Objetos de superfície, manchas, começar pontos e pontos finais de dois terminais do axônio R7 na camada M6 também foram gerados para subtrair o sinal de fundo do canal GFP (Figura 3E). Os resultados do número (Figura 4D), a distribuição (Figuras 4A, 4B e 4E) e o nível de deslocalização (Figuras 4A, 4C e 4F) são calculados automaticamente por o plug-in personalizado escrita em um ambiente de computação numérica multi-paradigma . Verificou-se que o número de pontos lacrimais Brp discreta foi significativamente reduzida em fotorreceptores R8 de moscas mantidos em condições ll (Figuras 4D e 4E). Adicionaritionally, encontramos que as sinapses R8 foram distribuídos ao longo de todo o eixo axonal do M1 a M3 a camada, mas a densidade era mais elevada nas camadas M1 e M3 (Figura 4E). O nível de deslocalização da BRP-GFP permaneceu inalterada em todas as condições de luz (Figura 4F). Isso está em contraste com a localização de uma fluorescente etiquetado versão curta da BRP (Brp de curto-cereja) 28, que, como já relatado anteriormente 9 torna-se claramente difundido no LL (Figura 4G). Sugere-se que o sinal de curto-Brp cereja deslocalizada pode ser relacionado com o processamento inadequado da Brp de curto fragmento depois da desmontagem do AZ 9. Entre outras proteínas AZ testados, fluorescente etiquetado ligação às proteínas (DRBP) Constrói DLiprin-a ou Drosophila Rim exibir uma redução no número de puncta e uma deslocalização claro em LL. Em contraste, fluorescente etiquetado Dsyd-1 ou Cacophony (CAC) fazer não exibir um sinal aumentado citoplasmática mesmo depois LL (Figura 4G). Assim, medindo sistematicamente se o sinal torna-se citoplasmática pode ser de relevância para entender o processamento de proteínas AZ.

figura 1
Figura 1: Preparação de Condições para a exposição a intensidade da luz definida. (A) protocolos de exposição à luz após a eclosão. DD, escuridão contínua; LD, 12 h luz / 12 h escuro; LL, a exposição constante à luz. Cérebros voam foram dissecados nos horários indicados nos suportes (adaptado de uma publicação anterior 9). (B) Os frascos são alinhados em um rack transparente de acrílico personalizado. (C) A cremalheira acrílico e dois painéis de LED são colocados numa pequena incubadora e ajustado para expor as moscas a uma intensidade de luz de 1000 lux.s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: A preparação da amostra. Tudo montado preparações de cérebro (A). (B - D) Desenho esquemático dos preparativos. (C, D) As seções transversais das preparações. O lado ventral do cérebro é para cima (C) entre lamelas (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Geração das manchas, objetos de superfície e pontos de medição. 15 utilizando recombinase sens-flp. Anti-Chaoptin (azul) destaca os axônios fotorreceptoras R7 e R8. barra de escala, 5 mm. (B) Identificação da BRP-GFP puncta pelo módulo de detecção de ponto para cada terminal axônio R8. (C) Detectado axônio regiões ( "objetos de superfície", azul) e regiões local ( "spot objetos", branco) para medir o nível de deslocalização da BRP-GFP nos axônios R8. (D) As start-pontos e pontos finais são ajustadas manualmente com a função de "ponto de medição" para definir a orientação de cada axônio no espaço 3D e para definir um sistema de coordenadas no qual o local Brp-GFP são projetadas. (E) A superfície de objetos, manchas, começar pontos e pontos finais de dois terminais do axônio R7 na camada M6 que não incluem R8 são gerados para subtrair o sinal de fundodo canal de GFP. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Quantificação do número, a distribuição e deslocalização Nível da BRP-GFP puncta. (A) Desenho esquemático do procedimento utilizado para medir o nível de sinal de Brp-GFP deslocalizada em R8. O puncta Brp-GFP são identificados e duas áreas são definidas em torno deles: a área "spot" ea área "citoplasmático". A linha de conexão de início e fim dos pontos é subdividido em 10 partições. (B, C) A saída do plug-in software de análise de imagem personalizado escrito em um ambiente de computação numérica multi-paradigma. Cada punctum Brp-GFP coordenada é projetada para uma linha que representa o neurônio de start-point para acabar pontos (B). barra de escala, 5 mm. O ponto lacrimal Brp-GFP são identificados e duas zonas são definidas em torno deles: a área "spot" e a área "citoplasmática" (C), tal como esquematizado em (A). (D - F) Os gráficos de barras comparando o número total de puncta (D), a sua distribuição (E) eo nível de deslocalização da BRP-GFP por R8 axônio (F) em DD (83 axônios / 7 cérebros), LD (107 axônios / 5 cérebros) e LL (226 axônios / 15 cérebros). Gráficos (G) de barras que compara o nível de deslocalização da BRP de curto-cereja em LD (74 axônios / 7 cérebros) e LL (70 axônios / 5 cérebros), GFP-DLiprin-α em LD (67 axônios / 7 cérebros) e LL (52 axônios / 6 cérebros), GFP-DRBP em LD (70 axônios / 7 cérebros) e LL (83 axônios / 6 cérebros), GFP-Dsyd-1 em LD (48 axônios / 5 cérebros) e LL (69 axônios / 7 cérebros), e Cac-GFP em LD (31 axônios / 5 cérebros) e LL (27 axônios / 5 cérebros). *** P <0,0001, ** p <0,001, * p <0,0 5, ns p> 0,05; teste t não pareado com correção de Welch bicaudais. barra de erro mostra o erro padrão da média. O desenho esquemático em (A) e os dados em (D), (E) e (G) estão adaptadas de uma publicação anterior 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Video 1
Vídeo suplementar: uma descrição do tratamento de dados realizadas com o Imaris Plugin "Synapse Trafo". Discussão de processamento de dados. Este vídeo contém uma pequena palestra para ilustrar a passos de transformação e processamento de dados realizados pelo Imaris plug-in "synapse_trafo" coordenadas.5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "target =" _ blank "> Clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).

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Discussion

Neste estudo, nós mostramos como preparar as condições de luz para expor as moscas a uma intensidade de luz iguais. Foram quantificados não só o número de pontos lacrimais um marcador sináptica, mas também poderia resolver espacialmente a densidade de sinapses ao longo dos axónios e medir o nível de deslocalização da proteína marcador em áreas citoplasmáticos. Estas três avaliações nos permitem avaliar os detalhes da dinâmica sinápticas no único nível neuronal em diferentes condições ambientais. Nosso protocolo pode ser adaptado a diferentes proteínas sinápticas, mas também para todos os dados que contém sinais puntiformes.

Um passo crítico no âmbito do protocolo é a montagem dos cérebros. Fotorreceptores Drosophila projetam seus axônios para o segundo medula gânglio óptico. Cada axônio fotorreceptor podem ser digitalizados diretamente se os cérebros montados foram correctamente colocadas numa lâmina de microscópio. A montagem correta também faz a seleção dos fotorreceptores com o softwa análise de imagemre funções mais fáceis. Cada região fotorreceptor tem que ser selecionado manualmente para a contagem do número e deslocalização nível de puncta. Os de início e fim dos pontos também são selecionados manualmente. Estas preparações requerem um tempo relativamente longo até que se possa proceder à quantificação. A vantagem de axónios R8 é que eles são não ramificado e cada R8 é separada axónio. Um neurónio simples isolado como este é recomendado para estas aplicações uma vez que é necessário para definir a área exacta do neurónio. Além disso, isso ajuda a se livrar de puncta inespecíficos e superfícies derivadas de outros neurônios. Uma limitação desta abordagem, no entanto, é a profundidade da projecção z. A intensidade do sinal da puncta recebe menos nas camadas mais profundas da pilha z. Preparando cérebros transparentes por métodos de remoção de tecido tal SeeDB2 29 pode ajudar a superar esta limitação e permitir imagem de um sinal pontuada clara ainda mais profunda no cérebro.

nossa protocol pode, potencialmente, ser usado para analisar a organização sináptica em escala nano e com imagens ao vivo. Combinando imagens de super-resolução (por exemplo, estimulou o esgotamento de emissão (STED) microscopia, microscopia óptica reconstrução estocástico (STORM), foto activado microscopia de localização (PALM), microscopia de iluminação estruturada (SIM) etc.) com modelagem teórica tem avançado nossa compreensão do estrutura e dinâmica molecular de sinapses. Por exemplo, a organização nanoscopic da BRP foi avaliada em uma resolução single-molecular com imagens de super-resolução por STORM direta (d STORM) na Drosophila MNJ 30. O protocolo foi adaptado para a quantificação da dinâmica de uma única molécula de zona activa a uma zona activa e pré-sináptica de um único receptor pós-sináptico para uma zona de pós-sináptico para entender melhor como sinapses são reguladas a um nível mecanístico. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para visualizar molecularmovimento nas sinapses em animais vivos. Na verdade, a BRP-GFP pode ser visualizado sem depender de imunocoloração. Assim, o desenvolvimento pré-sináptica nos axônios R8 foi fotografada de animais vivos com microscopia de dois fótons 15. É possível rastrear o sinal pontuada de componentes de zonas ativas em animais vivos através da detecção e análise de manchas em diferentes pontos de tempo desde as superfícies e as posições dos neurônios específicos são definidos em nosso protocolo.

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Acknowledgments

Somos gratos a T. Sturner para correções votos, discussões e comentários sobre o manuscrito; SL Zipursky para fornecer estoques de mosca; M à escolarização para a realização de processamento de imagem. Parte da análise de imagem foi realizado no laboratório de A. Kakita. Este trabalho foi financiado pela Fundação Alexander von Humboldt e JSPs Bolsas de Investigação no exterior (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-In-Aid para Start-up (24.800.024), em áreas inovadoras (25.110.713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Fundações Toray (TS), DZNE de financiamento principal (GT) e DZNE Microscopia de Luz Facility (CM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vial Hightech, Japan MKC-20
Plug Thermo Fisher Sciehtific, USA AS-275
Customized transparent rack made of acrylic resin  Shin-Shin Corporation, Japan a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step
Cool incubator MITSUBISHI ELECTRIC, Japan CN-40A
LED panel MISUMI, Japan LEDXC170-W
Digital light meter CEM DT-1301
Fly pad Tokken, Japan TK-HA03-S
Petri dish (35 x 10 mm) Greiner Bio-One International, Germany 627102
PBS tablet Takara, Japan T900
Triton X-100 Wako, Japan 160-24751
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
1.5 mL tube Sarstedt, Germany A. 152X
Formaldehyde 16% NEM, Japan 3152
Pipetman P-200 Gilson F123601 
Pipetman P-20 Gilson F123600
Pipetman P-2 Gilson F144801
anti-chaoptin antibody DSHB 24B10
Alexa568-conjugated anti-mouse antibody Life Technologies A-11031
VECTASHIELD Mounting Medium Vector Laboratories, Inc. H-1000
Microscope slide (76 x 26 mm) Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany
Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) Zeiss, Germany 474030-9000-000
Industrial Microscopes Olympus, Japan SZ61-C-SET
Stereo Microscope Lighting Olympus, Japan KL 1600 LED
confocal microscopy Zeiss, Germany LSM780
Imaris Bitplane, Switzerland Version 7.6.4 or above
Matlab The MathWorks, Inc., USA
Excel for Mac  Microsoft

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References

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Neurociência Edição 120, Fotorreceptores sinapse zona ativa Bruchpilot a exposição à luz
Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada
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Sugie, A., Möhl, C.,… More

Sugie, A., Möhl, C., Hakeda-Suzuki, S., Matsui, H., Suzuki, T., Tavosanis, G. Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light. J. Vis. Exp. (120), e55176, doi:10.3791/55176 (2017).

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