Summary
Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu.
Abstract
sinir sistemi adapte ve çeşitli uyaranlara yanıt olağanüstü bir yeteneği vardır. Bu sinir ayar ölçüde sinaptik düzeyde plastisite ile elde edilir. Aktif bölge (AZ) nörotransmitter salımını aracılık ve iskele proteinlerinin yoğun bir toplama oluşan presinaptik membran bölgedir. Drosophila melanogaster AZS (Drosophila) fotoreseptör doğal ortam ışığına uzun süreli maruz kalma sonrasında moleküler biçimlenme geçmesi. Böylece nöronal aktivitenin düzeyi AZ moleküler kompozisyonu yeniden ve işlevsel çıktı düzenlenmesine katkıda bulunabilir.
Immünohistokimyaya ışığa maruz kalma set-up hazırlanmasından başlayarak, bu protokol numarası, mekansal dağılımı ve Drosophila fotoreseptörlerde AZS sinaptik moleküllerin delokalizasyon seviyesini ölçmek için nasıl ayrıntıları. görüntü analizi sof kullanmayazılımlarını, GFP-kaynaşık AZ bileşeni Bruchpilot kümeleri her R8 fotoreseptör (R8) akson terminal belirlenmiştir. Algılandı Bruchpilot noktalar otomatik olarak bireysel R8 akson ayrıldı. akson boyunca nokta frekans dağılımını hesaplamak için, biz bir özel yazılım eklentisi uyguladı. Her aksonun başlangıç noktası ve bitiş noktası elle tanımlanmış ve her Bruchpilot nokta pozisyonu başlangıç ve bitiş noktası arasındaki bağlantı hattı yansıtılıyor edildi. Bruchpilot küme sayısına yanı sıra, kümeler içinde Bruchpilot-GFP delokalizasyon düzeyini sayılabilir. Bu ölçümler farklı çevresel koşullar altında tek bir nöron mekansal çözüme sinaptik dinamikleri uyaranlara ayrıntılı olarak yansıtmaktadır.
Introduction
sinaptik fonksiyon modülasyonu tam yanıt ya da çevresel uyaranlara değişen uyum sinir sisteminin olağanüstü yeteneği katkıda bulunur. Presinaptik vezikül bırakma olasılığını ayarlanması sinaptik gücü 1 kontrol etmenin bir yoludur. Sinaptik vezikül salım aktif bölge (AZ), presinaptik zar 2'nin özel bir bölgede yer alır. AZ spesifik proteinlerin 3'ün bir kaset, 4 ile karakterize edilir. AZ montaj katkıda Çoğu protein son derece nematod, böcek ve memelilerde 5 korunmuştur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nöronal aktivite düzeyi da hem in vitro ve in vivo 6, 7 fonksiyonel çıkışının düzenlenmesine katkıda AZ, moleküler yapısı düzenleyen düşündürmektedir> 8. Biz daha önce fotoreseptör AZS doğal ortam ışığı 9 uzun süre maruz kaldıktan sonra Drosophila moleküler biçimlenme geçmesi bulundu. Bu durumda biz Bruchpilot (BRP) -pozitif AZS sayısı fotoreseptör aksonlar indirgendi görülmektedir.
BRP / CAST / ELKS ailesi proteinleri omurgalı ve omurgasız sinapsların 10 AZS temel yapı taşlarıdır. Drosophila BRP mutantlar, vezikül açıklaması, 12 11 bastırılır uyarılmış. BRP 17 C-terminali amino asit kalıntıları Drosophila nöromüsküler bileşke (NMJ) 13, 14 sinaptik vezikül Kümelenme için gereklidir. Bu çalışmalar AZ organizasyon ve fonksiyonunda bu molekülün merkezi rolünü göstermiştir. Rekombinasyon (Star), BRP ile son zamanlarda geliştirilen genetik aracı Synaptic Etiketleme ileendojen ekspresyon düzeyleri ve tek bir sinaps çözünürlüğü 15 de, belirli bir hücre tiplerinde in vivo gözlenebilir. Bu araç, bu mümkün nicel olarak karmaşık, merkezi sinir sisteminde sinaps endojen dinamiklerini analiz kolaylaştırır.
konfokal mikroskopi elde edilen verilere dayalı sinaps sayımsal dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Sinaptik değişiklikler uzunluk, alan, hacim, yoğunluk ölçümü ve gelişmiş yazılım uygulamalarına dayalı sayısını sayarak değerlendirilmiştir. Örneğin, ücretsiz ImageJ toplam sinaptik alan ve Drosophila NMJ 16 sinaptik yoğunluk ölçümleri için bir miktar yöntemi sağlar. Önceden ve postsinaptik belirteçlerinin ko sitelerin sayısı ImageJ yazılım platformu 17 mevcut eklenti "puncta Analyzer" kullanılarak sayısal edilmiştir. Seçenek olarak ise, bir multi-paradigm sayısal işlem ortamı tabanlı program, Synapse Dedektörü (SYND), otomatik olarak bir floresan işaretleyici ile etiketli nöronların dendritler iz ve ardından hücre gövdesine 18 mesafenin bir fonksiyonu olarak sinaptik protein düzeyleri rakamlarla olabilir. Yazılım Sinaptik puncta Analizi (SynPAnal) konfokal veya floresan mikroskobu elde nöronların 2D görüntüler hızlı analizi için özel olarak tasarlanmıştır. Bu yazılımın ana işlevi protein puncta 19 yoğunluğu ve şiddeti otomatik ve hızlı miktar olduğunu. Son zamanlarda, otomatik öğrenme bazlı sinaps algılama algoritması 3D Görselleştirme Destekli Analizi (Vaa3D) Yazılımın 21 yararlanarak, 3D 20 sinaptik sayısının ölçümü için oluşturuldu.
Ticari görüntü analiz yazılımı da sinaptik sayımsal için güçlü araçlardır. Örneğin, flüoresanetiketli nörotransmiter reseptörleri veya presinaptik AZ bileşeni C. tek sinaps çözünürlüğü 22 elegans veya sinapsların yüzlerce izin Drosophila koku sistemi 23, 24, hızla tek bir numune içinde karakterize edilmesi ile üç boyutlu olarak sayısal edilmiştir.
Burada, özel bir görüntü analiz yazılımı tarafından bir yöntem mevcut plug-in sayıları, dağıtım ve moleküler bileşenleri zenginleştirme düzeyine dahil AZS yarı otomatik olarak birden fazla yönlerini analiz sağlayan bir çoklu-paradigma sayısal bilgi işlem ortamında uygulanan AZ. Bu nedenle, bu karmaşık analiz, farklı çevresel koşullar altında akson terminallerinde bileşenlerin dinamiklerini değerlendirmek için bize izin verdi. Biz yetişkin sinek Fotoreseptörlerin çıkış sinaps üzerinde ışığa maruz kalma etkisi araştırıldı. Prosedür üç adımda gerçekleştirilir: 1)ışığa maruz kalma, 2) diseksiyon, immünhistokimya ve konfokal görüntüleme, ve 3) görüntü analizi için hazırlık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol açıklanan deneysel prosedürler sadece Drosophila ile çalışmak barındırır Almanya ve Japonya'da hayvan refahı kanunlarına tabi değildir.
1. Işık pozlama Koşulları
- Fotoreseptör R8 nöronların (R8s) 'de BRP-GFP görselleştirmek için sensless-Flippase (sens-flp) ve bruchpilot-FRT-DUR-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 taşıyan sinekler hazırlayın. Bakteriyel Suni Kromozom (BAC) içindeki genomik lokus kodlayan BRP Bu BRP-FSF-GFP cDNA yapısı oluşturmak için modifiye edilmiştir. Bu modifiye edilmiş BAC BRP-GFP ekspresyonunu taşıyan sinekler endojen düzenleyici dizilerin kontrolü altında olmakla birlikte, FRT DURDURMA-FRT kasetinin 15 sensless-flippase aracılı çıkarıldıktan sonra R8 fotoreseptör sınırlayıcı. Sens-flp nadiren R7s içinde Flippase ifade eden unutmayın.
- 12 saatlik li sinekler tutmakeclosion (Şekil 1A) kadar larva 25 ° C 'de GHT / 12 saat karanlık çevrimi (LD).
- eclosion 6 saat sonra ve sinek gıda içeren yeni bir şişenin içine koyun - Sinekler 0 toplayın.
- Üç aşamada (41 cm yükseklikte, 21 sm bir bazın 4 cm'lik bir kalınlığa ve her adım için 13 sm bir yükseklik) (Şekil 1B) akrilik reçineden yapılmış şeffaf bir rafın içine şişeleri ayarlayın.
- Bir dijital ışık ölçer (Şekil 1C) kullanarak 1000 lux ortalama yoğunluğu ile aydınlatma sağlamak için raf ve bir LED panelde arasındaki mesafeyi ayarlayın.
- 1 sinekler tutun - aşağıdaki koşullardan birinin altında 3 gün: Küçük bir inkübatör 25 ° C'de sabit karanlık (DD), 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngüsü (LD), ya da sabit ışık (LL) (Şekil 1A ve 1C).
2. Diseksiyon, İmmunohistokimya ve Görüntüleme
- , Forseps ile sinek beyinleri teşrih% 4 fo ile bunları düzeltmekChaoptin karşı birincil antikor (1:50) ve daha önceki deney prosedürü 25 göre fotoreseptörlerin görüntülenmesi için ikinci bir antikor ile rmaldehyde ve immunostain. kısaca:
- PBS içinde% 0.1 Triton X-100 (% 0.1 PBT) hazırlayın. Bu çözelti, bir antikor Doku penetrasyonunu arttırmak için kullanılır.
- Bir CO 2 pad üzerinde sinekler uyutmak doğru genotipi sıralamak ve% 0.1 PBT ile dolu bir petri aktarabilirsiniz.
- burnumun altında forseps sopa ve diğer forseps ile sırasıyla sağ ve sol gözleri çekin.
- proboscis ve beyin bağlı trakea çıkarın.
- Oda sıcaklığında,% 0.1 PBT 150 uL ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içine forseps ile beyin aktarın.
- 2.1.3 10 dk tekrar içinde - 2.1.5 mümkün olduğunca çok sayıda beyin elde etmek.
- tüp içine% 16 formaldehit 50 uL ekleyin ve pipetleme karıştırın.
- odasında fiksatif beyinleri inkübe50 dakika boyunca sıcaklığı.
- tüp içinde beyinleri bırakmak dikkat, bir mikropipet ile% 0.1 PBT 200 uL ile üç kez yıkayın.
- şöyle Son yıkamadan sonra, hazırlanan,% 0.1 PBT çıkarın ve primer antikor çözeltisi ekleyin:% 0.3 PBT (% 0.3 PBS içinde Triton X-100), anti-Chaoptin antikorun 4 uL (nihai seyreltme oranı: 1 196 uL ekle : fotoreseptörlerin görünüm için 50).
- 4 ° de CO / N birincil antibodi çözeltisinin içine beyinleri inkübe edin.
- mikropipet ile% 0.1 PBT 200 uL yıkama 3x.
- Son yıkamadan sonra,% 0.1 PBT çıkarın ve bir sekonder antikor içeren% 0.3 PBT 200 uL ekleyin.
- 4 ° de CO / N karanlıkta o inkübe edin.
- mikropipet ile% 0.1 PBT 200 uL ile üç kere yıkanır.
- Montaj için, yaklaşık 2 cm Dista bir mikroskop lamı merkezinde bir mikropipet ile bir montaj ortamı (2 ul her biri) iki küçük damla koymakbirbirinden ım.
- Her damla üzerine iki lamelleri, bir koyun ve yaklaşık 0.2 mm lamelleri arasındaki dar bir boşluk bırakın.
- lamel üzerine bir montaj ortamı 15 ul koyun ve montaj aracı madde içine bir mikropipet ile beyin ekleyin.
- Bir mikroskop altında, iki lamelleri arasındaki dar aralıkta (Şekil 2) içine ventral yüzü beyinleri yerleştirin.
- Üstüne bir lamel yerleştirin ve örnek (Şekil 2) düzeltmek için net oje kullanarak lameller kenarları mühür.
- konfokal mikroskop ile beyin görüntüleri elde edebilir. Bir 63X yağ daldırma objektif lens (1.4 NA) ve bir 2.6x dijital zoom kullanın. 0.5 um arasında bir basamak boyutu ile ikinci optik ganglion medulla 20'den fazla optik bölümleri oluşturur.
Spot, Yüzey Nesneler, Start-noktaları ve Bitiş noktaları 3. Nesil
- , Distr sayısını ölçmek içinibution ve BRP-GFP puncta ve delokalizasyon seviyesi, görüntü analiz yazılımı konfokal mikroskobu ile elde edilen yığın açın ve 3D görüntü (Şekil 3A) sulandırmak. Bu çalışmada, aşama IMARIS ile gerçekleştirilmiştir unutmayın.
- Her R8 akson terminali için nokta tespiti modülü tarafından BRP-GFP puncta tanımlayın.
- "Yeni Noktalar Ekle" seçeneğini seçin.
- algoritma ayarlarında "İlgi Segment sadece bölge" seçeneğini seçin. El medulla bir R8 akson terminali seçin.
- BRP-GFP sinyal kaynağı kanalını seçin.
Not: R7 ve R8, fotoreseptör aksonlar, anti-Chaoptin (Şekil 3A) ile immunolabeled edildi. Sadece, R8, birlikte, BRP GFP puncta içerir ve bu nedenle kolayca (Şekil 3A) ayırt edilebilir. Bundan başka, R8 uç M3 medulla tabakası içine giriş noktasında, anti-Chaoptin pozitif akson incelmesi tarafından tespit edilebilir. - Tahmini XY çap t Seto 0.35 mikron ve spot algılama "Arka Plan çıkarma" kapalı kontrol.
- Filtre tipi "Kalite" yi seçin ve otomatik filtre. Sonra bitirmek tıklayın.
- Diğer R aksonlar (Şekil 3B) için 3.2.1 t 3.2.5 itibaren tekrarlayın.
- R8 aksonlardaki BRP-GFP delokalizasyon düzeyini ölçmek her akson (Şekil 3C) için "Surface" fonksiyonu ile yüzey nesneleri oluşturmak için.
- "Yeni Yüzeyler Ekle" seçeneğini seçin.
- algoritma ayarlarında "İlgi Segment sadece bölge" seçeneğini seçin. Daha sonra elle medulla bir R8 akson terminalleri seçin.
- Fotoreseptörlerin kaynak kanalını seçin.
- "Smooth" işaretleyin.
- eşik "Mutlak Yoğunluk" seçeneğini seçin.
- "Enable". "Tohum Noktaları Çapı" 0,5 mm.
- Seçin filter Tip "Kalite" ve "voksellerdeki sayısı" ve daha sonra otomasy filtreyapılsın.
- "Düzenle" ye gidin ve diğer non-ilginç aksonlar oluşturulan yüzeylerin parçaları silin.
- Diğer R akson (Şekil 3C) için 3.3.8 - 3.3.1 itibaren tekrarlayın. Not Bazı yüzey nesneleri çünkü inceliği ve M2 katmanında fotoreseptör zayıf sinyal kesildi, ama yine de baştan uç noktalarına tek bir nesne olarak kabul edildi.
- Medulla neuropil her nöron boyunca BRP-GFP puncta dağılımının tespit edilmesi, ölçüm noktası işlevi (Şekil 3D) ile başlangıç noktası ve bitiş noktası tanımlar.
- "Yeni Ölçüm Noktaları Ekle" seçeneğini seçin. Daha sonra "Düzenle" seçin ve yüzey nesnelerin en kesiştiği için "Nesne Surface" i seçin.
- sırayla M1 tabakasında R akson yüzey nesnelerin en üstünde ölçüm noktaları koyun. Bunlar şimdi başlangıç noktaları (Şekil 3D) olarak tanımlanır.
- "Yeni Ölçüm Noktaları Ekle" seçeneğini seçin.Daha sonra "Düzenle" seçin ve yüzey nesneleri alt kesiştiği için "Nesne Surface" i seçin.
- sırayla M3 tabakasında R akson yüzey nesnelerin altındaki ölçüm noktaları koyun. Bunlar, artık uç noktaları (Şekil 3B) gibi tanımlanmıştır.
- GFP kanalından arka plan sinyalini çıkarmak M6 tabakasının (Şekil 3E) iki R akson yüzey nesneleri, lekeler, başlangıç noktaları ve bitiş noktaları oluşturmak için.
- "Yeni Yüzeyler Ekle" seçeneğini seçin.
- algoritma ayarlarında "İlgi Segment sadece bölge" seçeneğini seçin. Daha sonra elle M5 ve M6 tabakası arasında bir R7 akson terminali seçin.
- fotoreseptör kaynak kanalını seçin.
- "Smooth" işaretleyin.
- eşik "Mutlak Yoğunluk" seçeneğini seçin.
- Seçin filter Tip "Kalite" ve "voksellerdeki sayısı", daha sonra otomatik olarak filtre.
- "Yeni Noktalar Ekle" seçeneğini seçin;.
- "Elle düzenlemek, otomatik oluşturmayı atla" seçeneğini seçin.
- "Nesne Merkezi" seçin ve 3.5.1 oluşturulan yüzey nesnenin iç alanına bir nokta eklemek - 3.5.6.
- Başka bir R7 akson terminali için 3.5.9 - 3.5.1 itibaren tekrarlayın.
- "Yeni Ölçüm Noktaları Ekle" seçeneğini seçin. Daha sonra "Düzenle" seçin ve M6 katmanda R7 akson terminali ucu iki yüzey nesnelerin en üstünde ölçüm noktaları koydu. Bunlar şimdi başlangıç noktası olarak tanımlanır.
- "Yeni Ölçüm Noktaları Ekle" seçeneğini seçin. Daha sonra "Düzenle" seçin ve M6 katmanda R7 akson terminali ucu iki yüzey nesnelerin altındaki ölçüm noktaları koydu. Bunlar, artık uç noktaları (Şekil 3E) gibi tanımlanmıştır.
Spot sayısı 4. hesaplanması, Nokta Frekans ve Dağılımı Özelleştirilmiş Görüntü Veri Analizi Yazılımı ile BRP-GFP Zenginleştirme Düzeyi
- dosyasını kopyalayın"XtquantifySynapseSNR.m" ve Imaris XT matlab klasörüne "fonksiyonları" klasörü. Bu çalışmada, hesaplama Matlab uygulanan özel bir eklenti ile gerçekleştirilmiştir unutmayın. Web sitesi (gelen eklentisini indirin https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ).
- n noktalar, n yüzeyler ve 2 ölçüm noktası nesneleri, (- 3.4 3.1 hazırlanan) her biri n ölçüm noktaları ile bir veri kümesi açın. İlk ölçüm noktası nesnesi tüm akson için başlangıç pozisyonları tanımlar. İkinci ölçüm noktası nesnesi tüm akson son konumu tanımlar. Her iki ölçüm noktası nesneleri ölçüm noktaları aynı sayıda (yani akson sayısı) olması gerekir.
- Yürütme görüntü işleme >> ÖZEL> sinaps algılama 6 Vs atsushis.
- meta kontrol edin ve doğru olmaması halinde görüntü analiz yazılımı piksel boyutlarını değiştirin.
- perf için kanal seçinnoktalar bölgeler ve sitoplazmik bölgeler (BRP-GFP ile kanal) yoğunluk analizi sergilemiş.
- Sonuçları ihracat için dosya adını tanımlayın.
- yüzde bidonları ve akson uzunluğu sayısını tanımlayın. "10" olarak bidonları ve "% 100" (Şekil 4A ve 4B) olarak depo aralığının numarasını girin.
- BRP-GFP delokalizasyon analizi için noktalar ve diğer sitoplazmik bölgelerin bölgelerin tanımlanması. Enter noktalar "0.35 mikron" ve "50 um" olarak alanı çevreleyen genişliği olarak radius. noktalar yarıçapı (tek punktumdan merkezli 0.35 mikron çapında) puncta GFP sinyali için bölgeyi tanımlar. Alanı çevreleyen genişliği sitoplazmik alanında GFP sinyali bölgesini tanımlayan (punktumdan merkezli 50 mikron çaplı, ancak R8 dahil ve sitoplazmasında tüm nokta alanlar hariç) (Şekil 4A ve 4C).
- tüm nöron maskeleri işlenir kadar bekleyinve PDF dosyaları (Şekil 4B ve 4C) ve bir elektronik tablo içinde daha fazla analiz için bir csv tablo olarak ihraç etti. csv tablo noktaların sayısını, "sitoplazmik alanı" ve tüm R8 akson her bin "spot" maksimum sinyal yoğunluğu ortalama sinyal yoğunluğu içerir.
- arka plandaki sinyal çıkarıldıktan için 3.5 hazırlanmış bir veri kümesi açın.
- 4.9 - 4.3 den açıklandığı gibi görüntü işleme gerçekleştirin.
- Toplam sayısının ortalamasını ve bir tablo (Şekil 4D ve 4E) 'de BRP-GFP puncta dağılımını hesaplayın.
- Arka plan sinyali ortalama yoğunluğu ile çıkarılır "spot" maksimum yoğunluğu bölü "sitoplazmik alan" ortalama yoğunluk oranı ile bir elektronik tablo BRP-GFP sinyali yerel olmaktan ortalamasını hesaplayın (Şekil 4F) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila bileşik göz ~ 780 ommatidia içermektedir, fotoreseptör içeren her sekiz türleri (R1-8). R7 ve R8 proje, katmanlar M6 ve M3, sırasıyla 26 yılında sinaps oluşturan ikinci optik ganglion, medulla, onların aksonları. Fotoreseptör R8 aktif bölgeleri moleküler kompozisyonu üzerine ışığa uzun süre maruz kalma etkisini araştırmak için, biz Star Yöntem 15 yararlandı. BRP endojen ifade seviyeleri floresan sens-FLP türetilen R8 fotoreseptör ifade bir Flippase ile BRP-FSF-GFP olarak durdurma kodonu dışarı çevirerek etiketli. 25 ° C (Şekil 1A) de aynı süre için LL, LD veya DD eclosion sonra 3 gün - sinekler 1 tutuldu. 1000 Lux ışık sinekler ortaya çıkarmak için, sinekler, bir akrilik reçine raf (Şekil 1B) içine yerleştirilmiş ve aynı mesafede tutulduKüçük bir inkübatör (Şekil 1C) LED ışık kaynağından.
Immün sonra disseke beyinleri BRP-GFP puncta görüntülenmesi ve ölçümü için yukarı bakacak şekilde beyinleri (Şekil 2) ventral tarafı ile bir mikroskop lamı üzerine iki lamelleri arasındaki dar boşluğa yerleştirildi. Medulla (Şekil 3A) R8 içinde farklı puncta lokalize elde BRP-GFP sinyali.
Sayısını ve BRP-GFP puncta dağılımını ölçmek ve R8S içinde BRP-GFP sinyali delokalizasyon düzeyini değerlendirmek için, özelleştirilmiş görüntü analiz yazılımı eklentisi çok paradigma sayısal işlem ortamında 9, 27 geliştirilmiştir. İlk başta, puncta her R8 (Şekil 3B) için bir nokta algılama fonksiyonu ile tespit edildi. Daha sonra, yüzeyher R8 s delokalizasyon seviyesinde (Şekil 3C) değerlendirilmesi için üretilmiştir. Son olarak, biz AZ dağılımı (Şekil 3D) ölçmek için sırasıyla her fotoreseptör M1 tabakasının üstüne ve M3 tabakasının altındaki başlangıç noktaları ve bitiş noktaları tanımlanır. Yüzey nesneler, lekeler, başlangıç noktaları ve M6 katmanda iki R7 akson terminalleri için son noktaları da GFP kanalının (Şekil 3E) arka plan sinyali çıkarmak için üretildi. Sayısına (Şekil 4D), dağıtım (Şekil 4A, 4B ve 4E) ve delokalizasyon düzeyi sonuçları (Şekil 4A, 4C ve 4F) otomatik olarak çok paradigma sayısal işlem ortamında yazılmış eklenti özel hesaplanmıştır . Biz BRP ayrık puncta sayısı önemli ölçüde LL koşulları (Şekil 4D ve 4E) muhafaza sineklerin R8 fotoreseptör azalmış olduğu bulunmuştur. Eklemekitionally, biz R8 sinaps tüm M3 katmanına M1 aksonal mil boyunca dağıtıldı bulundu, ancak yoğunluk M1 ve M3 katmanları (Şekil 4E) daha yüksek idi. BRP-GFP delokalizasyon seviyesi tüm ışık koşullarında (Şekil 4F) de değişmedi. Bu floresan daha önce 9 açıkça LL (Şekil 4G) yayılmış olur bildirildiği gibi, BRP (BRP-kısa-kiraz) 28, kısa versiyonunu etiketlenmiş bir yerelleştirme tersidir. Biz delokalize BRP-kısa-kiraz sinyali AZ 9 dan sökülmesi sonra BRP-kısa fragmanın uygunsuz işlenmesi ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Test edilen diğer AZ proteinler arasında, floresan DLiprin-α veya Drosophila Jant bağlayıcı protein (DRBP) yapıları puncta sayısında bir azaltma ve LL açık bir delokalizasyonu gösterir etiketli. Bunun aksine, floresan Dsyd-1 ya da Cacophony (CAC) do etiketli Hatta LL (Şekil 4G) sonra artan bir sitoplazmik sinyal göstermez. Böylece, sinyal AZ proteinlerin işlenmesi anlamak alaka olabilir sitoplazmik hale sistematik olmadığını ölçmek.
Şekil 1: Tanımlı Işık Şiddeti Maruz Şartlar hazırlanması. (A) eclosion sonra Işığa maruz kalma protokolleri. DD, sürekli karanlık; LD, 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık; LL, ışığa sürekli maruz kalma. Fly beyin (bir önceki yayın 9 den uyarlanmıştır) parantez içinde belirtilen zamanlarda disseke edildi. (B) Şişeler özelleştirilmiş akrilik şeffaf rafa hizalanır. (C) akrilik raf ve iki LED paneli, küçük bir inkübatör koymak ve 1000 lux ışık yoğunluğu sinekler ortaya çıkarmak için ayarlanır.s / ftp_upload / 55176 / 55176fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Örnek hazırlanması. (A) Tüm monte beyin hazırlıkları. (B - D) hazırlıkları şematik çizimi. (C, D) preparasyonların kesitleri. Beyinleri ventral yan lamelleri (D) arasındaki (C) kadar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Spot, Yüzey Nesneler ve Ölçme Noktaları Üretimi.
Şekil 4: Sayı, Dağıtım ve BRP-GFP puncta ve delokalizasyon Düzeyi miktarının belirlenmesi. (A) R8 delokalize BRP-GFP sinyal seviyesini ölçmek için kullanılan prosedürün şematik çizimi. BRP-GFP puncta tanımlanır ve iki alanda çevrelerindeki tanımlanmıştır: "nokta" alanı ve "sitoplazmik" alanı. başlangıç ve bitiş noktalarını birleştiren hat 10 bölümlerde bölünmüştür. (B, C) bir multi-paradigma sayısal bilgi işlem ortamında yazılmış özel görüntü analiz yazılımı eklenti Çıktı. Her BRP-GFP punktum başlangıç po dan nöron temsil eden bir hat tahmin edilmektedir koordinat(B) noktasına bitirmek için int. Ölçek çubuğu, 5 mikron. BRP-GFP puncta tespit edilir ve iki alan etrafında tanımlanır: (A) şematize olarak "nokta" alanı ve "sitoplazmik" alanı (C). (D - F) puncta (D), kendi dağıtım (E) ve R8 akson DD (F) başına BRP-GFP delokalizasyon düzeyi (83 aksonlar / 7 beyin), LD toplam sayısını karşılaştıran Çubuk grafikler (107 aksonlar / 5 beyin) ve LL (226 aksonlar / 15 beyin). Delokalizasyon LD BRP-kısa-kiraz seviyesi (74 aksonlar / 7 beyin) ve LL (70 aksonlar / 5 beyinleri) LD, GFP-DLiprin-a'yı (67 aksonlar / 7 beyin) ve LL karşılaştırılması (G) Çubuk grafikler (52 aksonlar / 6 beyin), LD GFP-DRBP (70 aksonlar / 7 beyin) ve LL (83 aksonlar / 6 beyin), GFP-Dsyd-1 LD (48 aksonlar / 5 beyin) ve LL (69 aksonlar / 7 beyin) ve LD Cac-GFP (31 aksonlar / 5 beyin) ve LL (27 aksonlar / 5 beyin). *** P <0.0001, ** p <0.001, * p <0.0 5, ns p> 0.05; Welch düzeltme ile eşleştirilmemiş t testi iki kuyruklu. Buradaki hata çubuğu, ortalamanın standart hatasını gösterir. Şematik çizimi (A) ve (D) veri, (e) ve (g) bir önceki yayın 9 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Video: Imaris Eklentisi "Synapse Trafo" ile Yapılan Bilgi İşlem Açıklaması. veri işleme tartışılması. Bu video Imaris eklentisi "synapse_trafo" tarafından gerçekleştirilen dönüşüm ve veri işleme adımlarını koordine göstermek için kısa bir ders içerir.5176 / theory_data_analysis_withaudio.avi "target =" _ blank "> Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, biz eşit bir ışık yoğunluğu sinekler ortaya çıkarmak için ışık koşulları nasıl hazırlanacağını gösterdi. Sizlere sadece bir sinaptik işaretleyici puncta sayısını sayısal hem de mekansal akson boyunca sinaps yoğunluğu gidermek ve sitoplazmik alanlarda işaretleyici protein delokalizasyon düzeyini ölçmek olabilir. Bu üç değerlendirmeler bizi farklı çevre koşullarında tek nöron düzeyinde sinaptik dinamikleri ayrıntılarını değerlendirmek için izin verir. Bizim protokol farklı sinaptik proteinlere, aynı zamanda noktasal sinyalleri içeren herhangi bir veri adapte edilebilir.
protokolü içinde kritik bir adım beyinlerinin montaj olduğunu. Drosophila fotoreseptör ikinci optik ganglion medulla onların aksonları proje. monte edilmiş beyinler doğru bir mikroskop lamı üzerine yerleştirildi ise her fotoreseptör akson delikanlı taranabilir. doğru montaj da görüntü analizi softwa ile fotoreseptör seçimini yaparkolay fonksiyonları yeniden. Her bir fotoreseptör bölgesi puncta sayısı ve delokalizasyon seviyesi sayılması için manuel olarak seçilmelidir. başlangıç ve bitiş noktaları da elle seçilir. bir ölçümü geçebilirsiniz kadar bu hazırlıklar nispeten uzun bir zaman gerektirir. R8, akson avantajı, dallanmamış olmasıdır ve her bir R8, akson ayrıdır. bu gibi basit bir izole nöron o nöronun tam alanı tanımlamak gereklidir çünkü bu uygulamalar için tavsiye edilir. Ayrıca, bu nonspesifik puncta ve diğer nöronlardan türemiş yüzeylerin kurtulmak için yardımcı olur. Bu yaklaşımda bir sınırlaması ise, Z, projeksiyon derinliğidir. puncta sinyal yoğunluğu z yığının daha derin katmanlarında az olur. Doku temizleme yöntemleri gibi bir SeeDB2 29 şeffaf beyinleri hazırlanması bu sınırlamayı aşmak ve hatta derin beyin net bir noktasal sinyalinin görüntüleme izin yardımcı olabilir.
bizim protocol potansiyel bir nano ölçekte ve canlı görüntüleme ile sinaptik organizasyon analiz etmek için de kullanılabilir. Süper çözünürlüklü görüntü birleştiren teorik modelleme ile anlayışımızı ilerlemiştir (örneğin, emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi, stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (Fırtına), fotoğraf aktive yerelleştirme mikroskobu (PALM), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM) vb uyarılmış) yapısı ve sinapsların moleküler dinamik. Örneğin, BRP Ortaölçek örgütü Drosophila NMJ 30 doğrudan STORM (d STORM) tarafından süper çözünürlüklü görüntüleme ile tek moleküler çözünürlükte değerlendirildi. Bizim protokol presinaptik aktif bölgesinde ve ayrıca sinapslar mekanik bir düzeyde nasıl düzenlendiği anlamak için bir postsinaptik bölgede tek bir postsinaptik reseptör tek bir aktif bölge molekülünün dinamiklerinin ölçümü için uyarlanmıştır. Ayrıca, bizim protokol moleküler görselleştirmek için kullanılan olabilircanlı hayvanlarda sinaps hareketi. Aslında, BRP-GFP immün dayanmadan görülebilir. Böylece, R8 akson presinaptik gelişme iki foton mikroskopi 15 ile canlı hayvan görüntülenmiştir edilmiştir. Tespit ve yüzeyler ve özel nöronların pozisyonları protokolde tarif edildiği çünkü, farklı zaman noktalarında noktalar analiz edilerek canlı hayvan aktif bölge bileşenlerinin noktalı sinyali takip etmek mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz yazının yararlı düzeltmeler, tartışmalar ve yorumlar için T. Stürner minnettarız; sinek stokları sağlamak için SL Zipursky; görüntü işleme gerçekleştirmek için M Schölling. Görüntü analizi Bölüm A. Kakita laboratuarda gerçekleştirilmiştir. Bu eser, Yenilikçi Alanları Başlat-up için Alexander von Humboldt Vakfı ve JSPS Bursu Yurtdışı Araştırma (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-İçi Aid (24800024), (25110713), Mochida tarafından desteklenmiştir Takeda, Inamori Daiichi-Sankyo, Toray Temelleri (TS), DZNE çekirdek finansman (GT) ve DZNE Işık Mikroskopi Tesisi (CM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 mL tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
