Summary
Nous présentons ici un protocole de cellules d'image exprimant vert fluorescent type récepteurs de l'angiotensine 1a protéine marqués pendant endocytose initiés par le traitement de l'angiotensine II. Cette technique comprend les lysosomes d'étiquetage avec un second marqueur fluorescent, puis en utilisant un logiciel pour analyser la co-localisation du récepteur et lysosome en trois dimensions au fil du temps.
Abstract
Imagerie des cellules vivantes est utilisé pour capturer simultanément des images en accéléré des récepteurs de type angiotensine 1a (AT 1a R) et des compartiments intracellulaires dans des cellules embryonnaires humaines transfectées de rein-293 (HEK) après stimulation par l' angiotensine II (Ang II). Des cellules HEK sont transfectées transitoirement avec l' ADN plasmidique contenant AT 1a R marqué avec le renforcement de la protéine fluorescente verte (EGFP). Lysosomes sont identifiés par un colorant fluorescent rouge. images en direct de cellules sont capturées sur un microscope à balayage laser confocal après stimulation Ang II et analysées par le logiciel en trois dimensions (3D, voxels) au fil du temps. imagerie des cellules vivantes permet les enquêtes sur le trafic de récepteur et évite les facteurs de confusion liés à la fixation, et en particulier, la perte ou le déplacement artefactuelle des récepteurs membranaires EGFP-marqués. Ainsi, les cellules individuelles sont suivies dans le temps, la localisation subcellulaire des récepteurs peut être imagée et mesurée. Les images doivent être acquises sufficiently rapidement pour capter le mouvement des vésicules rapide. Pourtant, à des vitesses d'imagerie plus rapides, le nombre de photons collectés est réduit. Compromis doivent également être prises dans le choix des paramètres d'imagerie comme la taille de voxel afin de gagner de la vitesse d'imagerie. applications importantes de l'imagerie des cellules vivantes sont d'étudier le trafic de protéines, la migration, la prolifération, le cycle cellulaire, l'apoptose, l'autophagie et interaction protéine-protéine et de la dynamique, pour ne citer que quelques-uns.
Introduction
L'objectif global est d'obtenir des données quantitatives dans le temps et l'espace de colocalisation des récepteurs avec des organites intracellulaires spécifiques après un traitement par un agoniste du récepteur. Ainsi, l'objectif immédiat est ici de capturer time-lapse images confocales de lysosomes et un transmembranaire couvrant récepteur dans les cellules de rein embryonnaire humain (HEK) après transfection et à assembler ensuite et analyser les données d'imagerie en 3D pour mesurer quantitativement la distribution du récepteur à lysosomes. Enquête sur le trafic simultané d'un récepteur transmembranaire avec les lysosomes ou d'autres organites durant l'endocytose, lorsqu'il est activé par le ligand du récepteur peut aider à déterminer comment le récepteur transmembranaire est régulée dans des conditions physiologiques et physiopathologiques.
AT 1a R est présumée être dégradée dans les lysosomes après un traitement par Ang II dans le modèle des systèmes de cellules, principalement HEK293 1 , bien que la majorité des receptors sont principalement localisés dans les endosomes multivésiculaires de recyclage pour le recyclage à la suite de la membrane plasmique tandis que la masse du ligand, l' Ang II est dégradé dans le lysosome 2, 3, 4, 5. Plus récemment, Li et al. démontrée en utilisant le transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) , et la microscopie de fluorescence d'imagerie à vie (FLIM) techniques qui colocalise AT 1a R (à ~ 10 nm à l' échelle) avec LAMPE1, une protéine de la membrane lysosomale qui suggère qu'au moins une partie du récepteur est ciblé vers et dégradé 6 par les lysosomes. Ces auteurs ont noté que la chloroquine inhibiteur de lysosomale bloqué AT 1a association R-LAMP1 qui est compatible avec les précédents rapports suggérant que l'effet de la chloroquine est de bloquer la fusion des endosomes tardifs ou autophagosomes avec lysosomes. D' autres approches indirectes pour déterminer AT 1a R localization dans les lysosomes ont utilisé bafilomycine, un inhibiteur de lysosomale pour déduire AT 1a R présence dans les lysosomes 3, 4, 5, 6, 7, 8.
imagerie des cellules vivantes évite les effets potentiels de la fixation sur le volume cellulaire et la perte / gradation / redistribution des récepteurs de la GFP chimère. Des études antérieures se sont appuyés sur des cellules fixées afin de déterminer la colocalisation ou de co-occurrence du récepteur avec les lysosomes ou en utilisant des cellules vivantes marquées avec des mères porteuses de liaison aux récepteurs tels que le β-arrestine 1, 2, 3, 4, 5, 6. imagerie des cellules vivantes d'autres GPCR utilisant confocale à disque tournant ou balayage laser point confmicroscopes vecinales équipés de Gaasp ou HYD détecteurs ont permis aux enquêteurs d'observer l'internalisation et la traite des récepteurs dans des cellules individuelles imagées en z-piles à 30 s intervalles 9, 10. Cependant , même lorsque la cellule z-piles vivantes sont rapidement collectées, l' analyse ne peut se produire après la sélection d'un seul plan dans chaque pile, soit en 2D 10. Bien que cela puisse être suffisant pour l' étude du récepteur de kinase GPCR ou tyrosine intériorisé en question, les AT 1a Rs accumule dans des vésicules qui changent la taille et la position au fil du temps et sont donc par nature plus difficiles à échantillonner de manière adéquate à l' aide d' une tranche représentant unique à chaque point de temps. Pour déterminer soigneusement le tracé du étiqueté AT 1a R à travers la cellule et de détecter chaque sous - population de vésicules différentes en taille et position, nous avons mis au point une méthode pour l' imagerie 3D et l' analyse 3D pour suivre ces changements et d'être utilisé en conjonction avec l'étiquetage des différents compartiments intracellulaires tels que les lysosomes.
Les enquêteurs peuvent utiliser ce protocole pour l' imagerie des cellules vivantes pour visualiser directement le mouvement d'AT 1a R dans la cellule et son transfert à compartiments subcellulaires après stimulation Ang II. compartiments subcellulaires sont étiquetés avec des chimères de protéines fluorescentes ou d'autres marqueurs fluorescents. Ce protocole peut également être utilisé comme une première approche pour localiser les récepteurs dans les organites intracellulaires avec une résolution minimale de 200 nm afin de comparer muté par rapport à des récepteurs de type sauvage ou de détecter les changements suivants traitements pharmacologiques. La technique est accessible étant donné qu'il peut être réalisé sur un microscope confocal équipé pour l'imagerie des cellules vivantes. La facilité relative de cette approche contraste avec l' expertise et l' équipement nécessaires à la réalisation de FRET / FLIM / techniques BRET qui détectent les interactions moléculaires 6 accrue,"xref"> 11. Ces mesures définissent des interactions protéine-protéine avec une résolution élevée (~ 10 nm) et la localisation au sein d'organites subcellulaires est inférée. Ces techniques plus avancées sont utilisées pour suivre et mieux définir les interactions moléculaires d'intérêt, plutôt que le passage des récepteurs à travers des compartiments subcellulaires, et ils montrent directement les interactions protéine-protéine à des moments et des endroits spécifiques dans la cellule 11. FLIM, une technique de FRET indépendante de la concentration de l'accepteur, est le plus souvent effectué sur des échantillons fixes depuis l'acquisition d'images est plus lente. En revanche, le ratio FRET fournit l'imagerie rapide et haute résolution colocalisation des protéines interagissant. L'inconvénient de rapport FRET est que l' imagerie utilise épifluorescence Widefield pour gagner de la vitesse d'imagerie et d'inclure toute la cellule, ce qui réduit la résolution et le contraste des organites 12. transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) est un autretechnique avancée qui a été appliquée à des GPCR pour mesurer l'acquisition de la proximité moléculaire 11 au fil du temps. Dans cette technique, un fluorophore protéique est moléculairement divisée et chaque moitié liée à l'une des deux protéines en question. Lorsque les deux protéines d'intérêt se lient les uns des autres, les parties de l'étiquette chimérique ré-assembler pour acquérir la fluorescence et la fluorescence accrue quantifiée au fil du temps.
Ici, nous présentons une technique simple pour l' imagerie des cellules vivantes couplé avec l' image de quantification pour étudier le trafic d'AT 1a R dans la cellule sur Ang II stimulation et le changement potentiel de livraison de intériorisé AT 1a R à lysosomes après stimulation Ang II. L'utilisation finale de cette technique est de caractériser les différences dans le trafic membranaire comparant type sauvage et récepteurs mutés. Ces différences aideront à identifier le mécanisme (s) qui ont un impact des activités physiologiques de AT 1a R leading à la régulation de la pression artérielle.
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Protocol
Jour un
1. Cellule Semis
- Préparer Modified Eagle Medium complet de Dulbecco (DMEM). Ajouter 50 ml de sérum bovin foetal, 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5 ml de L-glutamine à 450 ml de DMEM pour faire 500 ml de DMEM complet additionné de sérum de veau foetal (10%), de la pénicilline / streptomycine (1%) et la L-glutamine (1%).
- cellules de semences humaines embryonnaires de rein (HEK), le numéro de passage 6-11 à 50.000 / puits dans un système 8 coverglass bien chambré en DMEM complet.
- Maintenir la lame chambré à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 24 heures.
Jour deux
2. liposome Transfection
- Fraîchement faire AT solutions plasmidiques et liposomes 1a R-GFP en utilisant des conditions stériles avec une armoire de biosécurité de niveau 2.
- Diluer 2 ul d'ADN plasmidique à 900 ng uL solution stock / dans 178 ul de milieu de sérum réduit pour obtenir un concentration d'ADN plasmidique d'environ 10 ng / ul.
- Diluer 4,5 pi de solution liposome mère dans 175,5 pi de milieu de sérum réduit pour créer une dilution 1:40 du stock.
- Ajouter la solution de liposomes à la solution de plasmide et mélanger à l'aide d'une pipette de 1 ml à la pipette vers le haut et vers le bas 20 fois pour mélanger la solution de transfection.
- Laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante (25-27 ° C).
- Bien que ce mélange est en phase d'incubation, retirez le support lentement avec un ml de pipetage 1 et ajouter lentement 400 pi de 1x tampon phosphate salin (PBS) qui est pré-chauffé à 37 ° C.
- Retirez délicatement le PBS et le remplacer par 200 ul / puits de milieu sérique réduit pré-chauffé à 37 ° C.
REMARQUE: Faites attention à toutes les étapes lors du lavage des cellules pour éviter le détachement des cellules de la lamelle en raison de contrainte de cisaillement induite par pipetage. - Maintenir les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 pendant 30 minutes.
- Une fois lapériode d'incubation est terminée, ajouter 80 ul de mélange de transfection à chaque puits et incuber les cellules pendant 4,0-4,5 heures , mais pas plus de 5 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2.
- Après la période transfection d'incubation est terminée, retirez lentement les médias des chambres en utilisant un mL de pipetage 1 et remplacer doucement avec 300 pl / puits de DMEM complet et incuber les cellules pendant 24 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 .
Jour trois
3. Sérum Starvation
- Retirez le support doucement à l'aide d'une pipette mL 1 et remplacer lentement avec 300 pi de DMEM sans sérum sans rouge de phénol.
- Maintenir la chambre à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 10 à 12 heures.
Quatrième journée
4. imagerie de cellules vivantes
- Compartiments intracellulaires Stain (lysosomes dans ce cas).
- About 30 min avant l'imagerie lysosomes dans les cellules, ajouter 22,5 ul d'une fluorescente solution 1 uM de colorant d'actions (0,5 pi de 1 mM colorant fluorescent dilué dans 499,5 pi de DMEM sans sérum sans rouge de phénol) à chaque puits pour une concentration de colorant finale de 75 nM.
- Incuber pendant 25-30 min à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2, puis retirez délicatement le colorant et ajouter lentement 300 pi de DMEM sans sérum frais sans rouge de phénol.
- Préparer le microscope pour l' imagerie.
- Réglez la scène vers le bas pour éviter d'endommager la lentille lors du démarrage d'un microscope automatisé.
- Allumez le microscope, la puissance du scanner, la puissance du laser et l'émission laser, et enfin la lampe aux halogénures métalliques pour l'observation visuelle (voir confocale instructions du fabricant de microscope).
- Ouvrir le logiciel d'imagerie et dans le tour du logiciel sur l'argon (488 nm), laser et la puissance jusqu'à 30 à 50%. Notez la puissance dépendâge du laser. Dans des expériences, il est crucial de maintenir les paramètres constants.
- Allumez laser émettant dans le rouge (par exemple 568 nm ou 594 nm).
- Régler le format d'image à une profondeur de 12 bits.
- Définir le trou d'épingle de la ligne de laser à l'argon de 488 nm et 568 nm pour le ou 594 nm laser à une unité de disque d'Airy. Si la GFP est très faible, utiliser un paramètre de 2 unités de disque d'Airy, mais correspondent aux canaux de manière appropriée.
- Lors de l'utilisation des jeux de filtres dichroïques, sélectionner les longueurs d'onde d'émission appropriés pour la GFP et le colorant fluorescent. Ou régler la longueur d'onde d'émission (Em) à 499-580 nm pour la GFP et Em 599-680 nm pour le colorant fluorescent émettant dans le rouge.
- Vérifiez que saigner et croisés ne se produisent pas. Éteignez chaque laser à son tour et vérifier les deux canaux d'émission pour chacun. Lorsque le laser Argon est éteint, l'émission verte doit être nulle. Lorsque le laser émettant dans le vert est éteint, le canal d'émission rouge doit être zéro.
NOTE: La méthode la plus sûre est de chaque image dans des pistes séparées (Sequtiel). - Inclure un canal de fond clair, si désiré. Éviter l'imagerie par contraste différentiel (DIC), car il peut fausser les mesures de colocalisation.
- Pour l'imagerie en direct, sélectionnez séquentielle de ligne plutôt que trame séquentielle.
- Sélectionnez les cellules pour l' imagerie.
- 1.4 Utiliser une ouverture numérique (NA) objectif, tel qu'un objectif 63X NA / 1,4 d'huile vers les cellules d'image (ou 40X / 1,4 AN). Centrer l'objectif et ajouter une goutte de haute viscosité, huile à faible autofluorescence d'immersion sur l'objectif.
- Transférer dans la chambre avec les cellules transfectées de l'incubateur à l'étage du microscope. Veillez à garder les lames plat et veiller à ce que la chambre est bien en place et empêché de mouvement.
- Déplacer l'objectif jusqu'à ce que la goutte d'huile touche le fond de la glissière; le plan focal droit est proche de cette position. En microscopes automatiques, enregistrer cette position ainsi que la position abaissée à utiliser pour le remainder de l'expérience d'imagerie pour faciliter le changement d'échantillons.
- Choisissez des cellules sombres. Des cellules surexprimant AT 1a R-GFP se détourner du récepteur dans la cellule et perturber le fonctionnement normal.
- Assurez-vous que le contour de la cellule, définie par la membrane plasmique, est visible, et de préférence ne se chevauchent pas avec d'autres cellules.
- Concentrez et centrer la cellule dans le champ de vision.
- Passez en mode confocal.
- Sélectionnez un mode d'imagerie rapide. Avec une main sur le contrôle de mise au point et l'autre sur le contrôle XY de la scène, se concentrer et centrer la cellule d'intérêt visualisé sur l'écran.
- Assurez-vous que la cellule d'intérêt est bien répartie et son côté inférieur ou ventral juxtaposée étroitement avec la lamelle en se concentrant de haut en bas à travers la cellule.
- Réglez les paramètres z-scène à l' image d' une cellule en 3D.
- Sélectionnez le bouton pour obtenir le haut Z-stack et le dialogue de fond (ou équivalent) et de se concentrer sur le fond du cell puis appuyez sur «commencer». Ensuite, se concentrer sur le haut de la cellule et appuyez sur «fin». Vérifier que la cellule entière est comprise dans la z pile.
- Définissez la taille Z-étape à 1,0 um.
- Définir les paramètres d'imagerie.
- Sélectionner Zoom 2, en fonction de la lentille, de telle sorte que la taille finale des pixels est d'environ 0,279 um x 0,279 um à 0,14 um x 0,14 pm dans la dimension XY.
- Pour les cellules HEK dans cette expérience, régler la vitesse de balayage d'environ 1 ms par voxel et sélectionnez 2 moyenne ou 2 accumulations par ligne, en fonction de la luminosité des cellules.
- Ajuster l'intensité du laser et de gagner pour l'imagerie GFP et le colorant fluorescent. En général, contre-colorants seront beaucoup plus lumineux et donc détecteur photomultiplicateur (PMT) et non Gallium arséniure phosphure (Gaasp) ou des détecteurs hybrides (HYD) doit être utilisé pour ce deuxième canal de couleur alors que GASP et HYD détecteurs sont nécessaires pour le canal de la GFP. Si le HYD ou Gaasp détectenteurs sont utilisés pour le colorant fluorescent, exercer la prudence et de commencer avec le laser à une puissance extrêmement faible.
- Régler la durée de balayage et la fréquence de balayage, par exemple, plus de 25 min de de chaque 30-60 ou plus pour voir le ciblage des AT 1a R-GFP vers les lysosomes.
- Réglez la mise au point automatique pour maintenir la stabilité focale plane au fil du temps.
- Commencez l'expérience d'imagerie.
- Préparez à l'avance 100x Ang II stock à 5 ug / ul (4,7793 mM) et ajouter 2,1 pi de ce à 998 ul de milieu (10 uM).
- Commencer la stimulation du ligand par addition de 3 ul d'une solution mère 100X du ligand (Ang II), le puits contenant 300 ul immédiatement avant la formation d'image (concentration finale 100 nM).
- Cliquez sur Démarrer et de l'image en 3D pour le temps et la fréquence souhaitée.
- Avant de terminer le travail au microscope, recueillir un z-pile pour une utilisation ultérieure dans la soustraction de fond lors de l'analyse. Dans le mode de comptage de photons, ce ne sont pasnécessaire puisque le fond est essentiellement 0. Avec un éclairage allumé et toutes les autres conditions d'imagerie de la même, mais avec aucun échantillon prendre une image de l'échantillon. Voir Contexte Soustraction (ci-dessous) en cours d'analyse.
Cinquième jour
5. Analyse de l'image
- Exporter des images au format TIFF.
- Faites un clic droit sur le nom du fichier image pour voir les menus et sélectionnez Exporter ou cliquez sur Fichier | Export | importer.
- Exporter au format TIFF pour les analyses ultérieures en veillant à exporter le RAW, les données 12 bits [pas le «Red Green Blue '(RGB) conversion utilisée pour des images de qualité de publication]. Ne pas exporter au format jpeg.
- Remarque X, Y, les dimensions des voxels Z et la taille z étape pour une utilisation ultérieure lors de l'analyse d'image. Par exemple, en utilisant un 40X / 1,4. NA un objectif de ces valeurs peuvent être 0,138 um x 0,138 um avec 1 um de taille z-étape (voir les données dans la section des résultats représentatifs).
- <strong> Créer une pile d'image pour l'analyse.
- Logiciel Quantification Ouvrir une image (Figure 2)
- Utilisez «Action | Créer un nouveau | Images de séquence sélectionnée" pour générer une image de fichier unique à partir de séquences importées simples (figure 2, flèche n ° 1).
- Entrez le nombre de canaux, le nombre de z-sections, et le nombre de points de temps.
- En fonction de la structure des fichiers * .tiff, sélectionnez, par exemple, des canaux, plan z, et des points de temps que l'ordre des plans d'image. Vérifiez que la pile de l'image finale représente correctement les canaux de couleur, z-stack, et des points de temps de l'image originale.
- Sélectionnez le nom de l' image (Figure 2, mis en évidence le nom de fichier à gauche, flèche n ° 2). Faites un clic droit sur l'image et / ou le champ d'image, et des options en bas de la liste, sélectionnez "Propriétés". Dans le pixel pm pour (X) (Y) et (Z) taille, entrez les propriétés d'image correctes indiquées ci-dessus.
- Soustraire fond avant l'analyse de l' image. La correction de fond peut être réalisé dans un logiciel d'analyse d'images. Soustraire fond en utilisant l' une des deux options.
- Option 1: Sélectionnez «Action | Créer un nouveau | Contexte Soustraction" (figure 2, flèche n ° 1). Utiliser l'image d'arrière-plan acquis obtenu à la fin de la session d'imagerie décrit ci-dessus comme "Dark Référence" Image sous "Outils | Soustraire Background".
- Option 2: Inspecter les zones les plus sombres dans les images où il n'y a pas d'échantillon, trouver le moyen ou maximum la luminosité de pixels dans cette région, sans tenir compte des pixels anormalement brillants qui pourraient être fluorophore parasite, un pixel au hasard lumineux, ou d'un autre phénomène. Sélectionnez "Actions | Créer un nouveau | Contexte Soustraction". Utilisez cette luminosité de pixel (fait négatif) que le décalage.
- Vérifiez l' enregistrement des couleurs et corriger si nécessaire.
- Générer une correction de l' enregistrement en sélectionnant "Actions | Créer Nouveau | Correction d'enregistrement" (figure 2, flèche n ° 1) et utiliser la boîte de dialogue pour faire des ajustements. À la fin d'un nouveau élément de dossier apparaîtra intitulé «Correction d'enregistrement".
- Appliquer l'inscription à un ou plusieurs des images d'intérêt en cliquant sur le nom de l' image (Figure 2, mis en évidence le nom de fichier à gauche, la flèche n ° 2), puis en sélectionnant «Outils | enregistrement correct" (bouton d'outil adjacent aux actions).
- Sélectionnez une image (Figure 2, mis en évidence le nom de fichier à gauche, la flèche n ° 2) et d'en tirer une région d'intérêt (ROI) autour d' une seule cellule en utilisant l'outil libre de la région (figure 2, flèche 3 #). Utilisez le mode de mise au point étendue (2D, menu déroulant en haut à gauche) pour observer la cellule comme l'outil de rognage ne fonctionne que dans la visualisation 2D.
- Cliquez droit sur l'image et sélectionnez "Découper la sélection" et une nouvelle image objet est généré.
- Sélectionnez la cellule recadrée en cliquant sur son nom, puis sélectionnez l'onglet "Mesure" ci - dessus (Figure 2, la flèche n ° 4).
- Pour définir et mesurer les vésicules intériorisées pour la GFP, faites glisser "Trouver des objets" sous "Finding" (figure 2, flèche 5 #) dans la boîte de séquence (figure 2, flèche 6 #).
- Set "Trouver des objets" Channel au canal de GFP.
- Ouvrir les paramètres (de l'icône de roue boîte de dialogue, flèche n ° 6) et réglez4; Seuil en utilisant: "SD et" limite inférieure "à 6. Réglez« taille minimale de l' objet "à 0 pm 3.
NOTE: La limite inférieure SD dépendra des expériences individuelles. La confirmation visuelle que les objets sont corrects seuillée est faite en examinant les différents points de temps (figure 2, la flèche 7 #). La "mesure | Feedback Options" boîte de dialogue permet de choisir la façon dont les objets sélectionnés seuillées sont visualisées (figure 2, flèche n ° 8). - Cliquez sur "Mesure" dans "Trouver des objets" boîte de dialogue (Figure 2 flèche n ° 6) et sélectionner les canaux et le type de mesures. En règle générale, sélectionnez "Tous les canaux" et "intensité et le volume des mesures».
- Pour définir le seuillage et des filtres pour l'identification de l'ensemble de la cellule et de mesurer l'intensité de la GFP totale, répétez les étapes précédentes (5.5.4 - 5.5.8) en utilisant les paramètres suivants: SD 0 et «taille minimum d'objet" à 2 μ; m 3 dans la seconde boîte de dialogue "Trouver des objets" pour identifier les cellules à l' aide de la GFP (Figure 2, flèche 9 #)
- Drag "Filtre Population" sous "filtrage" à la boîte de séquence dans la population 2 (la deuxième case "Trouver des objets", la figure 2, flèche n ° 9). Sélectionnez "Volume (pm 3> 100).
- assurer visuellement qu'un seul objet est identifié. La cellule entière devrait être seuillée et tous les autres objets filtré loin. Le paramètre "Filter" (s) peut nécessiter un ajustement si la cellule est faible, par exemple.
- Une fois que la mesure a été normalisé, sauf le protocole par un clic droit sur l'image et sélectionnez "Enregistrer Protocole" afin de réutiliser ( "Restore Protocol"). Le protocole peut également être exporté pour fournir un enregistrement dans le même sous-répertoire que l'image.
- Passer à la "Assurez - mesure" en sélectionnant "Mesures | Faire Point de mesure" (Figure 2
- Entrez le nom de la mesure correcte (copier coller à partir de l'image est pratique) et le code d'analyse ou la date (un ajout utile pour la tenue des dossiers) et sélectionnez "Tous les timepoints". Un nouvel élément de feuille de calcul sera créé sous l'image. Gardez les noms de fichiers concis.
- Cliquez sur le nom du fichier de feuille de calcul et sélectionnez l'onglet "Analyser". Déterminer si voxels saturés sont présents en sélectionnant d'abord "Restreindre l'analyse à:" sélectionner Population 2 (la cellule).
- clic droit sur le champ sous l'onglet "Analyser" et dans la boîte de dialogue sous "Analyser ces données:" sélectionner "Max ([canal de couleur de la GFP])"; sous la rubrique «Résumé par:" select "([canal de couleur de la GFP] moyenne", et sous la rubrique «Organiser les données par:" et "Row" select "timepoint" et click "OK".
NOTE: Si les données contient des pixels saturés (par exemple de 65.536 pour les 16 bits ou 4096 pour 12 bits), l'analyse ne sera pas précis (il sera sous - estimer le contenu vésiculaire). Ignorez cette cellule d'analyse. Si non saturé, passez à l'étape suivante. - Ensuite, sous l'onglet «Raw», puis sous l'onglet «Analyse» et un clic droit sur les données trouver "Restreindre l'analyse à:" puis sélectionnez Population 1 pour vésicules ou Population 2 pour toute la cellule.
- Sous "Analyser ces données:" sélectionnez "Somme" (canal de couleur de la GFP); sous "récapitulés par:" select "Sum"; et, sous la rubrique «Organiser les données par:" et "Row", sélectionnez "timepoint" ou "temps relatif" puis cliquez sur "OK". sélections d'analyse peuvent être sauvegardés et réutilisés.
- Sélectionner et copier / coller directement à partir du logiciel d'image de quantification à une feuille de calcul vierge ou d'exporter les données de feuille de calcul en cliquant droit sur l'datune sélection et enregistrer en tant que fichier .csv. L'ensemble de mesure de l'intensité de la cellule sera inclus avec les mesures de chaque vésicule dans la population alors assurez-vous d'identifier et de séparer des vésicules.
NOTE: Après avoir tracé les données, l'augmentation de la fluorescence de la GFP totale contenue dans les vésicules augmente rapidement. Photobleaching, si elle se produit, est détectée comme la perte de totale intensité de la GFP cellulaire au fil du temps.
- Dans les Trouver des objets (Population 1), réglez "Trouver des objets" Chaîne du canal rouge et icône de roue à l' intérieur de cette boîte de dialogue indiquée par la flèche n ° 6 (Figure 2) set "Seuil en utilisant:" SD et "limite inférieure" à 6. Réglez «taille minimale de l' objet" à 0,017 um 3.
NOTE: La limite inférieure SD dépendra des expériences individuelles. La confirmation visuelle que les objets sont correctes seuillés devrait être faite par examenINING différents points de temps. La "mesure | Feedback Options" boîte de dialogue permet de choisir la façon dont les objets sélectionnés seuillées sont visualisées (figure 2, flèche n ° 8). - Cliquez sur "Mesure" dans "Rechercher" Objets "boîte de dialogue (Figure 2 flèche n ° 6) et sélectionner les canaux et les types de mesures. En règle générale," Tous les canaux "et" intensité et le volume des mesures »sont sélectionnés.
- Pour la population 2, les paramètres d'utilisation identiques à celles utilisées pour identifier la cellule entière transfectées exprimant AT 1a R-GFP (5.5.9).
- Si plusieurs cellules (y compris des cellules non transfectées avec des vésicules de colorant fluorescent positif) sont présents, de culture de la cellule lors de la première étape de l'analyse est critique. En variante, l'utilisation de «Compartimenter» doit être utilisé pour limiter l' identification des lysosomes dans la cellule transfectée exprimant AT 1a R-GFP. Lysosomes ne doit être identifié dans la cellule de la GFP etpas de cellules voisines, non transfectées.
- Analyser et exporter des données comme ci-dessus.
REMARQUE: Un exemple de cellules et vésicules seuillée est représenté sur la figure 4.
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Representative Results
Dans cet ensemble représentatif d'expériences, les cellules HEK ont été transfectées avec le récepteur de l' angiotensine de type 1a (AT 1a R-GFP) construire (E1,2,3-AT 1a R) cloné dans le plasmide pEGFP-N2 13. Images Time-lapse de HEK ont été acquises et joué comme un film (Voir imagerie de cellules vivantes 1 et imagerie de cellules vivantes 2 films). Les films et les images fixes montrent que , après stimulation de ligand, AT 1a R-EGFPs sont localisés principalement dans la membrane plasmique, mais avec l'ajout d'Ang II ces récepteurs deviennent intériorisé à moins de 2,5 min pour former des vésicules claires et parfois plus tard se regroupent dans les grandes vésicules une zone périnucléaire (figures 4B, 5 et 6A, imagerie de cellules vivantes 2).
La quantification de l' intensité totale de la GFP de cellules et l' intensité totale des vésicules de GFP pour la cellule de la figure 5 pournir une illustration des complications inhérentes lorsque Ang II induit ébouriffant et les changements de forme de la cellule immédiatement après stimulation (figure 5A, la flèche à 0 min post-Ang II, rangée supérieure, orange indique les objets seuillées). Parfois plus tard, la localisation des vésicules contenant la GFP dans un cluster périnucléaire interfère également (figure 5A, flèche rouge à 29,5 min). Bien que tous les objets doivent être inclus dans la mesure de l' intensité totale de la GFP de cellules, les ondulations doivent être exclus des mesures de vésicules , car elles représentent la membrane plasmique AT 1a R-GFP. En revanche, les vésicules périnucléaires cluster ne doivent pas être exclues de la mesure de la vésicule (celle - ci sont vus dans une zone de la cellule fermée dans les cercles rouges dans la figure 5A, flèche à 29,5 min post-Ang II, rangée inférieure). Les tentatives d'accomplir ceci par filtrage de taille (plus ou moins de 7 pm 3) n'a pas été utile , car elle ne pouvait pas discriminer des volants et des clusters vesicles (figures 5A et 5B, comparer Filtre> 7, Filtre <7, et pas de filtre). Une alternative possible serait de dessiner une régions d'intérêt (ROI) qui englobe la partie cytoplasmique de la cellule, mais à l'exclusion du bord ébouriffant et le périmètre de la cellule. En fin de compte, cette cellule ne serait pas inclus dans les résultats quantitatifs, car il était saturé de pixels GFP présente.
Un autre exemple représentatif est montré sur la figure 6A qui illustre un décours temporel dans lequel la mise au point n'a pas été utilisé. GFP internalisé est représenté en pour cent au total GFP cellulaire (figure 6B). Les points de temps avant la flèche rouge à 3 min sont trompeurs, car seule une partie de la cellule était dans le volume d'imagerie, mais 3 minutes après l'addition Ang II, le plan focal restabilisé. GFP totale à l' intérieur de la cellule indique que cette cellule ne photoblanchiment sensiblement au cours du temps (figure 6C ). Entre 3 et environ 12 minutes, l' intensité pour cent de la GFP dans des vésicules augmente alors se stabilise (figure 6B). Ensuite, les lysosomes identifiés par un colorant fluorescent ont été utilisés pour identifier les ROIs au sein d' une cellule transfectée qui ont ensuite été quantifiée pour la somme de l' intensité de la GFP (Figure 6D). Après trois minutes, l'intensité de AT 1a R-GFP dans les lysosomes rouges identifiés ne varie pas au fil du temps (Figure 3D, n = 5, moyenne ± écart - type de la moyenne). Il n'y a donc pas d' augmentation détectable dans la livraison d'AT 1a R-GFP vers les lysosomes jusqu'à 24 minutes après l' administration Ang II.
Figure 1: Saturated Pixels identifiés dans une table de recherche (LUT). La flèche rouge indique pixels saturés indiqués en bleu.t = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Présentation du logiciel Image Quantification. Les points clés sont indiqués par des numéros et discutés dans le texte des méthodes. 1) Mesure à prendre, image 2) sélectionnée, 3) outil de ROI main libre, 4) onglet Mesures, 5) Trouvez des objets, 6) Population 1 Trouvez des objets boîte de dialogue, 7) Flèche activant film laps de temps, 8) Mesures article, 9) boîte de dialogue contenant une commande Filtre de la population un second Recherche d'objets. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Correction des couleurs d'enregistrement. Images avec et sans correctionEnregistrement de pixel corrigées sont présentées conjointement avec empiècements de plusieurs vésicules contenant AT 1a co - localisant R-GFP. Les pixels rouges sont décalés de 1 pixel vers la gauche dans le plan XY de l'image non corrigée. Insets montrent zones encadrées au plus fort grossissement. Barre d' échelle = 3,3 um, les dimensions de voxel = 0,138 x 0,138 x 1 um 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Illustration de seuillage pour identifier GFP et Fluorescent Dye contenant des vésicules et des GFP-cellules entières. (A) Identification des cellules entières en utilisant AT 1a R-GFP (GFP, rangée du haut) et seuillée GFP pour l'ensemble de la cellule (ID Cell, rangée du bas) sont présentés à 0 et 2,5 min après addition Ang II. boîtes blanches indiquent insET zones indiquées dans (B) et (C). (B) AT 1a R-GFP sont comparés à 0 et 2. 5 min après addition Ang II dans les images d' une seule couleur (rangée du haut). Vésicules identifiés par seuillage sont présentés dans la rangée du bas (ID Ves, violet). (C) des images à deux couleurs (AT 1a R-GFP / colorant fluorescent) sont présentées à 0 et 2,5 min après Ang addition II. Les lysosomes identifiés par seuillage sont représentées par des lignes rouges. Barre d' échelle = 7,0 um, les dimensions de voxel = 0,114 x 0,114 x 1,4 um 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Illustration des effets des Ruches et Clusterises Vésicules sur Mesure de intériorisé GFP Receptors. (A) T 1a R-GFP dans Ang II cellules traitées à 0 (rangée du haut) et 2,5 min (rangée du bas) sont présentés dans trois expériences de filtrage où dans la première colonne d' un filtre a été appliqué pour sélectionner uniquement les objets supérieur à 7 pm 3, dans le la seconde colonne pour sélectionner des objets moins 7 pm 3, et dans la troisième colonne aucun filtre n'a été utilisé. niveau de Thresholding était constante dans tous les trois. Les flèches indiquent les objets de grande taille seuillés, les cercles indiquent une zone de vésicules contenant cytoplasme périnucléaire aux points temporels ultérieurs. zones seuillée sont orange. (B) Quantification de la GFP intensité totale dans des vésicules est indiquée pour les zones seuillées avec ou sans filtrage de taille (par colonne A) en deux points de temps (par ligne en A). Dimensions Voxel étaient 0,138 x 0,138 x 1 um 3. Barre d'échelle = 5,6 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Suivi AT1 un R- GFP Internalisation et localisation potentielle dans lysosomes. (A) Cinq points de temps choisis de AT 1a R-GFP avec Lysotracker Rouge sont présentés dans le film d' accompagnement (imagerie cellulaire en direct 1 film) à 0, 3, 6, 9, et 12 min après Ang II. La grille représente une échelle unitaire de 6,56 um 3, les dimensions de voxels étaient 0,297 x 0,297 x 1,2 pm 3 et le z-step = 1,2 um. (B) Une parcelle de la GFP pour cent au total dans des vésicules au fil du temps illustre l'internalisation rapide de AT 1a R-GFP. (C) Une parcelle de la GFP totale dans la cellule au fil du temps montre que relativement peu photoblanchiment a eu lieu pendant 24 min de l' imagerie. (D) lysosomes ont été identifiés par l' identification des vésicules rouges positifs Lysotracker. L'intensité totale de la GFP dans les fluorescent vésiculaire de colorant positif ROIs a été mesurée à chaque point de temps (Normalized au premier point de temps avec aucune compensation pour photoblanchiment qui n'a pas été mesuré indépendamment). (C - D) Avant la flèche, les mesures ne sont pas valides puisque l'accent a changé. N = 5, moyenne ± écart-type de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1: Live Cell Imaging 1: (clic droit pour télécharger) cellules HEK transfectées avec AT 1a R-GFP a été imagé toutes les 1 min pendant 24 min (25 images) après l'addition de 100 nM Ang II. Film a été acquise à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser avec un plan-Apochromà 63X / 1.4 NA objectif d'huile, les dimensions de voxel de 0,279 x 0,279 x 1,2 um 3; et 5 tranches pour un total d'épaisseur 4,794 um imager à 3,20 ps / pixel. Le taux de film est de 2 images / s. Unité = 6,56 um.
Film 2: Live Cell Imaging 2: (clic droit pour télécharger) cellules HEK transfectées avec AT 1a R-GFP a été imagé toutes les 30 s pendant 25 min (51 cadres) après l'addition de 100 nM Ang II. Le film a été acquise en utilisant un microscope confocal à balayage laser avec un 40X / 1,4 NA objectif d'huile Plan-Apochromatiques. Dimensions Voxel 0,11 x 0,11 x 1,4 um 3. 7 tranches pour un total de 8,4 um d'épaisseur ont été imagées à 3,72 s / frame. Le taux de film est de 3 images / s. Barre d'échelle = 7 pm.
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Discussion
Des expériences préliminaires présentées ici montrent que sur un parcours de temps assez court de 24 minutes, pas de changement notable dans la livraison d'AT 1a R-GFP aux lysosomes a eu lieu. En général, la livraison des récepteurs internalisés aux lysosomes pourrait se produire dès 15-20 min. Cette expérience est en accord avec l'hypothèse selon laquelle la majeure partie du internalisé AT 1a R est destinée aux grands endosomes périnucléaire. La preuve que certains au moins de R 1a AT arrive dans les lysosomes a été démontrée par Li et al. , Qui a comparé les cellules à 5 min et 30 min après le traitement Ang II et trouvé colocalisation significative de LAMP1 avec AT 1a R à 30 mais pas 5 min 6.
Ce document fournit une description détaillée de la préparation cellulaire, imagerie, et les étapes d'analyse et discute les nombreux pièges inhérents à cette technique d'imagerie avancée. Cette méthode dépend des étapes critiques décrites ci-dessous.
Étant donné que la bonne santé des cellules est essentielle pour toute expérience d'imagerie des cellules vivantes, il est important d'éviter d'utiliser des cellules au-delà de passage 11 en raison des variations des taux de croissance et l'efficacité de transfection à des passages supérieurs. Pour maintenir les cellules saines tout au long de l'expérience, la période d'incubation de mélange de transfection avec des cellules ne doit pas excéder 5 heures depuis la solution de liposome est toxique pour les cellules en évidence par une augmentation de bourgeonnement de la membrane. Température, humidité et CO 2 commande est importante aussi bien avant que pendant l' imagerie. Dérives de température pendant l'imagerie peuvent causer relativement grandes dérives z-section et la perte de la stabilité focale plane. Par conséquent, des précautions supplémentaires est recommandée lors de l'addition de l'angiotensine II dans les cellules lors de l'imagerie pour faire en sorte que le plan focal est maintenu avec précision.
Imaging
Un avantage de l'imagerie des cellules vivantes sur immunocoloration en utilisant des cellules fixes estque les conditions in vivo peuvent être étroitement contrôlées et des artefacts associés à des cellules fixées peuvent être évités. Cependant, l'imagerie des cellules vivantes peut être difficile à optimiser pour les processus cellulaires qui sont extrêmement rapides, comme l'internalisation du récepteur. la vitesse de l'instrument et la nécessité d'éviter photoblanchiment limite le choix des événements qui peuvent être étudiés. Chaque expérience d'imagerie pourrait exiger certains choix à faire dans certains paramètres et des compromis dans d'autres; exemples sont des choix de la taille des pixels, l'accumulation de la ligne, le facteur de zoom, et la vitesse de balayage pour obtenir des données de bonne qualité pour l'analyse et éviter suréchantillonnage dans le même temps. Des décisions cruciales de ces facteurs dépendent équilibre entre la nécessité pour l'obtention d'une taille de pixel suffisante pour distinguer les vésicules individuelles et la nécessité d'obtenir une résolution temporelle suffisante des événements qui se produisent. Ainsi, certains compromis doivent être faits afin d'obtenir des informations assez rapidement que la cellule commence à internaliser récepteur GFP marqué. Dans notrecas, même si le logiciel confocal moderne peut indiquer la taille optimale des pixels, nos expériences a utilisé une valeur inférieure à la taille de pixel optimale en fonction de l'équation 14 de Nyquist. choix optimaux de paramètres pour d'autres expériences dépendra aussi de la façon dont les cellules sont lumineuses depuis plus grande taille de pixel permettra une accumulation plus rapide de photons permettant un compromis avec plus de temps voxel de séjour pour collecter plus de photons.
Pour l'analyse soit réussie, l'imagerie des cellules vivantes exige également critique la stabilisation focale précise lors de l'imagerie time-lapse. changements focaux ainsi que l'échec à l'image de la cellule entière peuvent avoir un impact profond sur la quantification de l'internalisation du récepteur ainsi que le total de l'intensité GFP cellulaire. La solution à ce problème de changements au cours des points focaux premiers temps de l'imagerie suite à l'ajout d'Ang II a été fournie par les fabricants confocale sous la forme de solutions de mise au point automatique par lequel lamelle interferometry avec un laser infrarouge couplé avec rétroaction au contrôle de mise au point automatique est utilisé pour maintenir la distance par rapport à l'objectif à la surface de lamelle identifié par la réflexion IR (Focus par exemple Definite ou Adaptive Control Focus). Le problème reste de la microscopist est alors d'identifier la plage correcte z de telle sorte que malgré les modifications de la forme, l'ensemble de la cellule reste dans le volume d'imagerie. La température est un autre facteur essentiel pour maintenir la position mise au point / Z pendant points de temps initiaux après l'addition d'Ang II. La température de l'objectif ainsi que la chambre d'imagerie des cellules vivantes doivent être maintenues à 37 ° C pendant toute l'expérience.
Un autre élément essentiel de l'imagerie, acquiert des images quantitativement. Si un détecteur Hyd est utilisé dans le mode de comptage de photons, les paramètres d'image doivent être réglés de telle sorte que des photons carambolage ne se produit pas. Pour les photomultiplicateurs et autres détecteurs, les images ne doivent pas contenir de pixels saturés (voxels). Dans les deux cas, une spelisées table de consultation (LUT) peut être utilisé pour visualiser la présence de pixels saturés et bien sûr, si elles sont présentes, le microscopiste devrait réduire l'intensité et / ou de gain laser.
Une analyse
Bien que l'approche décrite ici est appliquée sur le récepteur AT 1a R et son co - localisation avec les lysosomes, elle est applicable à des expériences dans lesquelles la quantité relative du récepteur dans des compartiments sub - cellulaires marqués avec différents marqueurs fluorescents est en question. Si l'objectif est de mesurer si oui ou non le récepteur se déplace vers l'organite, puis en utilisant le coefficient de colocalisation de Pearson avec un marqueur pour l'organite est problématique. Chaque pixel où l'organite est identifié aura une grande quantité de marqueur de telle sorte que l'un des coefficients sera toujours proche de 100%. Ainsi, les mesures de colocalisation pourraient induire en erreur. D'autre part, la mesure du pour cent du récepteur sur l'organite par rapport à quantité totale de récepteur est beaucoup plus informatif et plus clair à interpréter. Une affaire dans laquelle la protéine colocalisation pourrait être décrit en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson serait AT récepteur R 1a et LAMP1 dont l' interaction a été documentée, mais par une approche de colocalisation plus sophistiquée, à savoir FLIM / FRET 6.
L'utilisation de l' imagerie 3D est plus précis que d' utiliser des tranches représentatives de cellules avec une analyse en 2D en raison de mouvements cellulaires qui sont inévitables au cours du temps (Imaging Live 2 de film). Il est clair à partir des images en direct de cellules représentées dans les figures 3, 4B et 5A que le récepteur est principalement localisée au niveau de la membrane plasmique, cependant, à quelques minutes d'exposition à Ang II , il se localise dans des points lumineux sur la membrane et petite vésicules adjacentes à la membrane, des puits enduits et probablement endosomes précoces (figures 4B 4C). Avec la progression continue du temps, les vésicules se déplacent à travers la cellule d' accumulation dans les grandes vésicules adjacentes au noyau qui ont été décrits comme les endosomes multivésiculaires (MVES, les figures 1, 5A) 3, 15. Une tranche unique à travers la cellule au fil du temps fausserait le processus d'internalisation et de déformer les faits réels en particulier si la tranche ne comprend pas la surface cellulaire au début des temps, et les MVES parfois plus tard.
Dans cette étude, deux approches d'analyse d'images peuvent minimiser les effets de photoblanchiment de la GFP ainsi que le colorant fluorescent sur le résultat quantitatif. Comme les cellules de photoblanchiment (quoique dans une moindre mesure), la luminosité relative des vésicules internalisées par rapport à l'intensité de la cellule entière est maintenue, en supposant que le photoblanchiment se produit de façon uniforme. vésicules de colorants fluorescents positifs sont également facilement identifiés en sélectionnant le deviatio normen de l'option d'intensité de fluorescence moyenne des vésicules seuillage internalisées vives. Cela les distingue des arrière-plan même que l'ensemble du niveau de déclin de fluorescence. Ainsi, les mesures ne sont pas sensibles aux effets de la faible photoblanchiment. Toutefois, la forte photoblanchiment, comme 50% de perte d'intensité cellulaire au fil du temps pourrait avoir un impact plus important sur les résultats quantitatifs. En variante, les effets de photoblanchiment peuvent être mesurés de manière autonome dans des expériences témoins absents angiotensine II dans le cas de l' AT-R 1a ou GFP dans les cellules non transfectées adjacentes dans le cas des colorants fluorescents. Les effets de photoblanchiment pourraient alors être pris en compte lors de l'analyse.
autres préoccupations
Récemment, les biologistes cellulaires ont effectué une évaluation critique et la modification des protéines fluorescentes pour surveiller le trafic membranaire dans les cellules pour éviter les artefacts générés par la protéine fluorescente elle-même, indépendamment de la protéine being étiqueté. Diverses protéines fluorescentes sont sensibles aux interactions avec le microenvironnement local conduisant à la précipitation des protéines ou de réticulation en fonction de leur pKa et la présence de la cystéine d'acides aminés, respectivement 16. Un autre résultat de ces interactions peut inclure la perte de la fluorescence 16. Tous ces artefacts affectent des mesures quantitatives de la traite. Constantini et al. ont généré des protéines fluorescentes pour l' imagerie monomères dépourvus cystéine pour éliminer les artefacts potentiels 16. Ainsi, en fonction de l'objectif des expériences d'imagerie, le passage de la EGFP (non monomère) à une forme monomère, sans cysteine serait avantageux pour l'étude des micro-environnements vésiculaires acides et / ou réductrices. Un autre exemple serait leur utilité améliorée pour FRAP ou FRET expériences où multimérisation et réticulation auraient un impact sur les interactions de diffusion de la protéine et protéine-protéine.
Un autre artefact potentiel à considérer lors de l' imagerie lysosomes utilisant Lysotracker Rouge conjointement avec les protéines GFP de fusion est que Lysotracker rouge a été montré pour être capable de photoconversion au vert 17. Les auteurs recommandent que l'utilisation de l'éclairage à épifluorescence être minimisée, discuter les occurrences de cet artefact, et se référer à des cas réussis de colocalisation en utilisant ce réactif. En outre, d' autres marqueurs de lysosomes peuvent également être utilisés pour vérifier les résultats de colocalisation, par exemple, les tags LAMPE1 6.
A l' avenir, la sensibilité et la spécificité de ce dosage peuvent être examinés pour le récepteur de ciblage vers les lysosomes, ainsi que d' autres compartiments sous - cellulaires en utilisant des inhibiteurs de transport et / ou la fusion des vésicules, en inhibant lysosome l' acidification à l' aide bafilomycine pour bloquer la dégradation , mais pas d' accumulation 7, 18 en utilisant la chloroquine pour bloquer la fusion avec les lysosomes bloquant par conséquent , la co-localisation du récepteur avec les lysosomes 2, 5, 6, 7, 18, en utilisant des contrôles positifs tels que le ciblage de l' Ang II marquée aux lysosomes 2, et par comparaison à d' autres bien des systèmes de récepteurs et de ligands -described tels que le facteur de croissance épidermique ou de la transferrine et de leurs récepteurs cognats 3. Un contrôle positif intéressant, unartefactuelle lbeit, dans nos expériences a été le résultat observé dans adjacent, non transfectées, AT cellules 1a R-GFP négatives. Ces cellules ont apparemment jusqu'à la GFP libérée par les cellules transfectées et ciblés vers les lysosomes où colocalisation avec le colorant fluorescent a été très importante (non représenté). Cette colocalisation, cependant, n'a pas été sensible à Ang II comme prévu.
En conclusion, les méthodes pour la transfection, l'imagerie et l'analyse d'images présentées ici fournissent un moyen par lequel le récepteur intériorisation à divers compartiments subcellulaires peut être quantitativement tracée dans les cellules vivantes au fil du temps. comparaisons relatives entre les différents récepteurs ou récepteurs mutés sélectivement sont possibles en ce qui concerne la cinétique et la localisation subcellulaire à des compartiments spécifiques. Les éventuelles difficultés et artefacts associés à cette technologie sont discutées. Néanmoins, live-imagerie rapide en 3D couplée à l'analyse de l'image peut être utilisée pour mesurer l'absorption du récepteur et rapidetransitions à travers le cytoplasme vers Moléculairement compartiments définissables. Ceci ouvre la voie pour la mesure des différences résultant d'une mutation du récepteur ou de l'application des agonistes, des antagonistes et des inhibiteurs.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les travaux de recherche présentés dans ce manuscrit a été soutenu par la subvention R01 HL121456-01A1 à Kathryn Sandberg. Ce travail a été soutenu en plus par la disponibilité d'un Leica SP8 AOBS dans le Microscopy and Imaging Shared Resource (MISR) à Georgetown University Medical Center, qui est partiellement financé par P30-CA051008 des National Institutes of Health des États-Unis d'Amérique. Nous tenons à remercier Leica aide d'imagerie SP8 par Peter Johnson, et l'utilisation du Zeiss LSM880 dans le laboratoire de Thomas Coate, Département de biologie de l'Université de Georgetown avec l'aide de l'imagerie fournie par Alma Arnold de Carl Zeiss Microscopie LLC. Le contenu de ce manuscrit est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
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