Introduction
비만은 선진국과 개발 도상국의 급성장 건강 문제입니다. NAFLD 환자 (1) 30 % 내지 100 범위의 유병률 자주 알코올성 지방 간 질환 (NAFLD)와 연관된 공존하는 조건 중 하나 인 것으로보고되었다. 인해 지방간, 비만의 강한 상관 관계,식이 유도 비만 (DIO) 마우스 모델은 광범위 NAFLD 2, 3, 4, 5, 6의 개발과 관련된 복잡한 분자 메커니즘을 연구하는데 사용된다. 간 지방증은 NAFLD의 초기 단계이며, 비 알코올성 지방 간염 (NASH), 간경변, 궁극적으로 간암 7 진행할 수있다. 따라서,이 방법의 전반적인 목표는 간 steatotic 조건의 동물 및 세포 모델을 생성하고 홍보하는 것입니다효율적이고 정확한 지질 측정 ovide 상세한 프로토콜. 이 모델과 측정은 또한 인슐린 저항성과 제 2 형 당뇨병 등의 대사 질환의 연구에 유용하다.
비만 NAFLD, 고지방위한 중요한 위험 인자 중 하나 인 것으로 확인 된 바와 같이, 높은 크로스 다이어트 서양식 고지방식이를 모방 (HFHS)는 마우스에서 비만을 유도하기 위해 사용된다. 이어서, 간 지방증의 정도는 다양한 방법을 사용하여 평가 될 수있다. 먼저, 체중 및 핵 자기 공명 (NMR)와 신체 조성 분석 시간 동안 먹이 지질 축적을 나타낸다. 지방 질량과 근육량은 비 침습적 실시간 방식으로 정량화 할 수있다.
또한, 자기 공명 영상 (MRI)는 전신 및 지방 간 분포 모두를 표시하기 위해 사용된다. 자기 공명 영상의 분석의 계조 신호는 명료 한 의사 컬러 화상으로 변환하고, 강도 수그레이 스케일과 컬러는 헤미 - 정량화이다. 이 기술은 살아있는 동물에서 지방 축적의 측정에 독특한 이점을 제공한다. 둘째, 간의 조직 학적 분석 간 지방증을 결정하기 위해 가장 많이 사용되는 방법이다. 오일 레드 O 염색은 간세포에서 지질 소적의 크기와 위치를 나타내고있다 Hematoxylin & Eosin 염색 얼룩, 예컨대 간세포 형태와 같은 식세포 침윤 학적 정보를 제공한다. 셋째, 클로로포름 / 메탄올을 사용하여 추출 지질 함량 분석 간 지질의 정확한 정량적 측정이다. 총 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준은 생화학 적 방법으로 측정 할 수있다. 중요한 지질 추출 분석 및 오일 레드 O 염색은 또한 유전자 조작 또는 약학 간세포 치료에 사용될 수있다.
본 방법의 장점은 간 steatotic 모델을 생성하는 여러 최적화 방법의 사용이다 그종합적 생체 내 및 시험관 내에서 모두 표현형을 특성화. DIO 마우스 모델은 인간 지방간 질환의 병리 및 대사 표현형 요점을 되풀이 할 수있다. 인간의 다른 대사 매개 변수가 아니라 8로이 모델에 복제 할 수 있습니다. 높은 포도당 플러스 인슐린에 응답 steatotic 간세포 모델의 생성에 유용하고 효율적이며, 많은 비용과 시간이 소요 마우스 연구의 한계를 극복한다. 함께 찍은, 이러한 방법은 영양 과부하시 간 지질 장애와 인슐린 저항성의 연구에 대한 충분하고 필수적이다.
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Protocol
모든 동물 실험 프로토콜은 생물 과학에 대한 영양 과학 연구소, 상하이 연구소, 중국 과학 아카데미 (중국 상하이)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. DIO 마우스 모델
- HFHS 공급
- 40 킬로 칼로리 %의 지방과 40 킬로 칼로리 %의 자당을 포함하는 HFHS으로 8 주 된 수컷 C57BL / 6 마우스 피드. 12 시간 어두운 조명주기 조건을 수용.
- 네 여섯 주 동안 HFHS 다이어트 수유 상태에서 마우스를 유지합니다. 체중 매주을 확인합니다.
- 신체 조성 분석 및 의사 컬러 화상 해석
- 신체 조성 분석기 분석 생쥐 대상.
- 의 플라스틱 튜브에 의식하지 마취 마우스를 고정합니다. 이전이 설명 된 바와 같이, 본체 체지방량, 근육량 및 NMR 시스템을 이용하여 유체를 측정한다.
- MRI를 시스템을 사용하여 각 마우스의 몸 전체를 스캔합니다.
- 복강 내 주사 (25 μL / g)을 통해 1 % AVERTIN 가진 쥐를 마취 전문 유리관에서 촬상 분석을 수행한다.
참고 : 이미지의 과정은 각 마우스에 대한 약 0.5 시간 동안 지속됩니다. 측정이 완료되면, 그 케이지에 마우스를 반환한다.
- 복강 내 주사 (25 μL / g)을 통해 1 % AVERTIN 가진 쥐를 마취 전문 유리관에서 촬상 분석을 수행한다.
- 지느러미, 중간, 복부 층에서 마우스의 전체 몸을 스캔; 수직 방향 간 스캔. 0.55 T 자석과 같은 수단이 매개 변수를 사용하여 스캔 K 공간 = 192 X 256 μm의 섹션 두께 = 3mm, TE = 14.8 MS, TR = 400 밀리, FOVRead = 100mm, FOVPhase = 100mm, 그리고 수를 = 마우스의 모든 그룹에 대해 동일한 자성 조건을 사용하여 제 스캔.
- 신호 강도 9 항에있어서, 의사 컬러 화상에 계조 화상 약도.
- 신체 조성 분석기 분석 생쥐 대상.
- 마우스 안락사
- dissecti 소독이러한 집게와 가위로 NG 도구.
- 종이 타월에 충분한 이소 플루 란을 붓고 및 이소 플루 란은 유리 항아리에 휘발 할 수 있습니다. 쥐가 이소 플루 란에 의해 안락사되어 있는지 확인합니다.
- 운영 테이블에 마우스를 고정합니다. 75 % 에탄올로 각각 복부 스프레이 가위를 사용하여 칼 모양 프로세스 진피에 절개를하고, 복막을 노출시키기 위해 손으로 중앙선을 통해 길이 진피 찢어.
- 집게와 칼 모양의 과정을 클램프와 내장을 노출 리브의 바닥을 통해 복막 가로를 잘라.
- 심장 천자에 의해 EDTA 코팅 튜브에 혈액을 수집합니다.
- 간을 따라 다이어프램을 잘라 조심스럽게 좋은 가위를 사용하여 enterocoelia에서 간을 제거합니다. 다음과 같은 지질 측정 간 조직의 세 가지를 잘라 : H & E 염색을위한) 6 × 3 × 3mm, b)는 오일 레드 O 염색을위한 6 × 3 × 3mm, 클로로포름에 대한 간 C) 20 ~ 40 밀리그램 / 메탄올 추출.
- H & E 염색
- 밤새 4 ° C에서 4 % 인산 완충 포르말린 아세테이트 간을 수정 한 후 파라핀 왁스를 포함.
- 이전에 3, 10 설명한 바와 같이, 파라핀 섹션 (5 μm의)를 잘라 H & E 염색 용 유리 슬라이드에 그들을 탑재합니다.
- 오일 레드 O 염색법
- 리젠트 준비
- 10 % 포르말린, 60 % 이소프로판올, 헤 마톡 실린 및 글리세롤 젤리 오일 레드 O 작업 솔루션을 준비합니다. 이소프로판올 100 mL로 오일 레드 O 분말 0.5 g을 용해시키고, 그 0.5 % 스톡 용액을 만들기 위해 60 ° C의 욕에서 가열한다.
- 2 비율 (DDH 2 O 3 원액의 용액 2 ㎖) : 3에서 두 번 증류수 (DDH 2 O)로 희석. 작업 용액을 여과하고, 실온에서 적어도 10 분 동안 정치하자.
- AP 통신에 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물의 간을 포함lastic 삽입 상자. 30 분 동안 -20 ℃로 동결. , 동결 마이크로톰 8 μm의 섹션으로 잘라 슬라이드에 조직을 탑재하고, 실온에서 30 분 동안 배치.
- 염색 욕조의 바닥에 종이 타월을 놓고, 종이 타월 습윤 10 % 포르말린 소량 붓는다. 염색 욕조에 슬라이드를 넣고 4 ℃에서 5 분 동안 포름 알데히드 증기에 고정 된 부분을 수정합니다.
- 3 초 동안 염색 욕조에 60 % 이소프로판올에 슬라이드를 찍어; 한 번 반복합니다.
- 모든 조직을 커버하고 15 분 동안 배양 슬라이드에 오일 레드 O 작업 용액 몇 방울을 추가합니다. 실온에서 빛으로부터 조직을 보호합니다.
- 3 초 동안 염색 욕조에 새 60 % 이소프로판올에 슬라이드를 씻어; 두 번 반복합니다.
- 조심스럽게 두 번 증류 물을 통해 슬라이드를 씻어 조직 주위에 물을 제거합니다. 조직을 건조하지 않도록해야합니다.
- 1 분 동안 헤 마톡 실린에서 슬라이드를 놓고 5-10에 대한 수돗물로 부드럽게 씻어분. 조심스럽게 두 번 증류수에 슬라이드를 씻어하고 coverslip에 넣어 준비가 될 때까지 증류수에 보관하십시오.
- 전자 레인지에서 글리세롤 젤리를 가열하고, 조직의 상단에 몇 방울을 배치합니다. 조심스럽게 상단에 커버 슬립을 배치하고 거품을 형성하기 위해주의 바랍니다.
- 현미경으로 얼룩을 관찰하고 20X 및 40X 목표를 사용하여 특성 사진을 캡처합니다.
- 리젠트 준비
- 간 지질의 측정
- 새로운 2 mL의 플라스틱 원심 관의 해부 간 조직을 놓습니다. 균질화와 PBS의 1 mL에 균질화하고 새로운 15 mL 유리 튜브 해물 옮긴다.
- 적극적으로 1 분 동안 (1, v / V를 2) 솔루션, 소용돌이 혼합물 및 얼음에 2 시간 동안 서 있도록 클로로포름 / 메탄올 5 mL를 추가합니다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 1,650 XG에 원심 분리기; 상부 메탄올 층 중간 단백질 디스크 및 하부 클로로포름 지질 : 혼합물을 3 층으로 분리한다.
- 트란 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 새 유리관에 바닥 sfer 단계; 바닥 분획의 방울을받을 필요가 없다. 얼음에 옆으로 튜브를 설정합니다.
- 적극적으로 이전 튜브와 소용돌이에 남아있는 상층 부분에 클로로포름 4 밀리미터의 MgCl 2, 1.5 mL를 600 μL를 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 1,650 XG에 30 분 동안 얼음과 원심 분리기에 품어.
- 파스퇴르 피펫을 이용하여 제 1 바닥 상 관 바닥 상을 결합한다. 상부 및 중간 계층을 폐기하십시오.
- 37 °의 C 조에서 질소 가스 하에서 클로로포름을 증발. 1 % 트리톤 X-100 / 클로로포름 200 μL 충분히 유리관의 측면 워시 (V / V). 질소 기체 하에서 증발시켰다. 최종 에멀젼을 잘 200 DDH 2 O의 μL와 소용돌이와 지질을 용해.
- 제조사의 프로토콜에 따라 중성 지방 또는 콜레스테롤 키트를 사용하여 총 중성 지방 (TG) 및 콜레스테롤 (TC) 수준을 측정외부 참조 "> 3.
주 : 단백질 정량 (3)에 의해 측정 된 지질 값은 초기 파쇄 액의 단백질 농도들로 정규화한다.
2. 기본 마우스 간세포 모델
- 마우스 차 간세포의 분리
- 6 % 클로 랄 하이드레이트 (복강 10 μL / g)와 각 마우스를 마취.
- 이전 10 설명 된대로 기본 간세포를 분리합니다. 오일 레드 O 염색을위한 6 웰 플레이트에 콜라겐 코팅 커버 글라스에 세포를 성장. 지질 추출, 10 cm 세포 배양 접시 (10)에 세포를 시드.
- 세포 치료 및 오일 레드 O 염색법
- 기아 매체의 2 mL를 매체를 교체하고 24 시간 동안 37 ° C에서 품어. 30 mM의 포도당과 100 nM의 인슐린으로 치료. 24 시간 동안 37 ° C 형 문화 인큐베이터에서 그것을 품어.
- 매체를 기음. 2 mL의 PBS의 추가 매체를 씻어 부드럽게 소용돌이 친다; 한 번 반복합니다.
- 고무 밴드와 슬라이드에 커버 슬립을 수정합니다. 외부 표면에 부착 세포를 노출. (단계 150) 전술 한 바와 같이 오일 레드 O 염색을 수행한다.
참고 : 지질 축적의 기초 수준은 혈청 기아 후 높은 포도당 플러스 인슐린 치료를 자극한다. 지질 방울 오일 레드 O 염색으로 가시화된다.
- 지질의 측정
- 동일한 조건에서 높은 포도당 플러스 인슐린 (단계 2.2.1)와 간세포 치료. 각 10 cm 세포 배양 접시에 PBS 1 ML을 추가합니다. 세포를 긁어하고 100 μL의 분취 단백질 정량 신선한 1.5mL 용량 튜브에 전송되는 새로운 15 mL 유리 튜브로 수확.
- 세포의 나머지 900 μL에 (1, v / V를 2 개) 4 mL의 클로로포름 / 메탄올을 추가합니다. 대략 20 비프 음에 대한 초음파 처리 한 다음 소용돌이 적극적 출시세포의 지질. 2 시간 동안 얼음 혼합물을 품어. 지질 추출 (단계 1.6)을 수행합니다.
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Representative Results
도 1a에 도시 된 바와 같이, 마우스의 체중은 약 차우 다이어트 공급 군보다 1.5 배이다 HFHS 공급, 16 주 후에 45 ± 1.2 g으로 증가시켰다. 핵 자기 공명 신체 조성은 지방 질량과 쥐의 근육량을 보여주는 분석하면 (그림 1B) 표시됩니다. 몸 전체와 간장의 지방 분포는 MRI에 의해 결정하고, 라이브, 의식 생쥐의 대표적인 의사 컬러 이미지는 그림 1C-D에 표시됩니다. 체중 및 신체 조성 측정하고 HFHS 다이어트 공급 과정에서 가시화 하였다.
상기 steatotic 표현형 해부, 생쥐는 희생시키고 간 조직 학적 분석을 수행 하였다. 간을의 H & E와 오일 레드 O 염색, 그림 2A-B에 표시되는 지질 방울은 더 큰 성장과 대부분의 공간을 점유HFHS 다이어트 공급 4 개월 간세포. HFHS 다이어트 먹인 쥐의 간 지방증의 정도는 쉽게 차우 다이어트 먹인 쥐와 비교하여 시각화한다. 이러한 중성 지방 및 콜레스테롤과 같은 지질의 주요 구성 요소는, 클로로포름 / 메탄올 추출 (도 2C)로 측정 하였다. DIO 마우스에서 과잉 영양소 과부하 간에서 비정상적인 트리글리세리드 축적을 야기. NMR, MRI, 조직 학적 분석 데이터와 지질 침착 정도를 정확하고 효율적으로 측정 할 수있다.
도 3에 도시 된 바와 같이, 일차 간세포의 지질 농도를 24 시간 동안 높은 포도당 플러스 인슐린에 의해 유도 하였다. 축적 된 지질 방울 오일 레드 O 염색법 (도 3a)에 의해 결정하고, 지질 정량 분석은 간세포의 중성 지방 및 콜레스테롤 수준 (도 3b)을 측정하기 위해 계속해서 사용 하였다. 이를 바탕으로모델, 유전 적 변형 또는 간세포 지질 항상성에서 치료 약제의 효과는 효율적이고 신속하게 조사 할 수있다.
그림 1. 높은 지방, 높은 설탕 다이어트 (HFHS)은 생쥐에서 비만과 간 지방증을 증가시킨다. 8 주 된 수컷 C57BL가 / 6 마우스는 각각 팔주 16 주에 대한 우 또는 HFHS 다이어트에 공급 하였다. 쥐의 (A) 체중. 쥐의 (B) 바디 조성물. (C - D) 마우스와 간 대표 자기 공명 이미지입니다. 의사 - 컬러 화상의 적색 영역은 지방을 나타내는 동안 그레이 스케일 이미지에서 백색 영역은 지방을 나타낸다. 데이터는 N = 5-8, 표준 오차 (SEM) 평균 ±로 표시됩니다. * P <우 다이어트 먹인 쥐에 비해 0.05. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. STATISTICA리터 분석 부대, 두 꼬리 학생의 t-test를 이용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HFHS 다이어트가 공급 생쥐의 간 지방증 그림 2. 분석. 8 주 된 수컷 C57BL가 / 6 마우스는 각각 팔주 16 주에 대한 우 또는 HFHS 다이어트에 공급 하였다. (A) enterocoelia 간 대표 심한 형태. (B) 대표 H & E와 오일 레드 O 염색 (스케일 바 : 50 μm의). 오일 레드 O는 지방과 중성 지방을 얼룩, 그리고 빨간색 점은 간세포에 축적 된 지질 방울을 나타냅니다. (C) 클로로포름 / 메탄올 방법을 사용하여 간 지질 추출 총 중성 지방 및 콜레스테롤 수준. 데이터는 T로 정규화 된그는 간 무게, 표준 오차 (SEM) 평균 ±로 표시됩니다, N = 5-8. * P <우 다이어트를 먹이 쥐에 비해 0.05. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 통계 분석은 부대, 두 꼬리 학생의 t-test를 이용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 간장의 지방 축적은 높은 혈당 플러스 인슐린에 노출 된 마우스 차 간세포에서 유도된다. 없이 또는 포도당과 인슐린 치료를 배양 차 간세포의 (A) 오일 레드 O 염색, 표시 등 (스케일 바 : 50 μm의). (B) 일차 간세포의 트리글리 세라이드 수준을 측정하여 단백질 농도로 표준화되었다. 데이터는 평균 ±로 표현되는표준 오차 (SEM). * 대조군 대비 p <0.05. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 통계 분석은 부대, 두 꼬리 학생의 t-test를 이용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
NAFLD 대사 증후군, 비만, 인슐린 내성이나 2 형 당뇨병 (T2DM) 11와 연관된 프로그레시브 간 질환의 시리즈이다. NAFLD의 특징은 지방간, 간세포에 지방의 축적이다. 여기서, 방법의 스펙트럼은 표현형 및 DIO 마우스 및 마우스 차 간세포를 사용하여 간 지방증의 파라미터를 특성화하기 위해 제공된다. 이 절차는 비 알코올성 지방간 질환 및 기타 관련 대사 질환의 분자 메커니즘을 규명하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
생체 내 및 생체 외 분석에서 결합,이 방법은 종합적인 분석과 간 지방증의 평가를 제공합니다. 현재 NAFLD의 동물 모델은 주로 유전과 영양 모델로 구성되어 있습니다. 여기에 사용 된 HFHS 다이어트는 현대의 다이어트 스타일을 모방하도록 구성 및 쥐에서 비만과 간 지방증을 유발하기에 충분하다. 그러나, develo의의 분자 메커니즘을 연구하는지방 규제 완화의 pment은 세포 기반 분석은 유전자 돌연변이 나 약물 치료로 쉽게 조작뿐만 아니라 상대적으로 낮은 비용과 시간 약속을 포함하여 동물 실험을 통해 확실한 장점을 포함하고 있습니다. 마우스 차 간세포에서 간 지방증을 생성하려면, 포도당 플러스 인슐린의 높은 농도는 소설과 생체 규정에 의한 고혈당 및 고 인슐린 혈증을 모방하는 체외 모델의 효율적인 지질 축적을 유도하는 데 사용됩니다. 이러한 처리는 또한 인 HepG2 세포 간 다른 세포주에 적용 할 수있다. 유 전적으로 변형 된 간세포는 약제 처리의 다양한 접근임을 감안할 때, 여기에 설명 된 시험 관내 steatotic 모델 제한 및 이득 - 및 기능 상실 방법을 이용하여 동물 모델의 생성에 시간이 걸리는 단계를 극복한다.
신체 조성은, NMR 분석 및 MRI을 포함에서 비 침습적 실시간 데이터를 제공 할몸 전체 및 간 지질. 이것은 비 침습성, 시간 절약, visualizable, 반 정량적 측정이다. 또한, 신체 조성 분석의 정확도는 상당히 다른 조직 학적 및 생화학 적 측정을 결합하여 개선 될 수있다. 이는 생체 내 및 진단 및 간 지방증 그레이딩 골드 표준 측정은 모두 H & E 염색, 오일 레드 O 염색법, 및 지질의 측정을 이용하여 시험 관내에서 간 지방증을 결정하는데 중요하고 필요하다.
본 발명의 방법의 한계 중 하나는 단순 지방증 간염, 섬유증, 결국 간경화와 간암으로 이행 될 때 염증 콜라겐 침착을 측정 할 수 없다는 점이다. 식이 유도 된 비만 마우스 NASH의 발전을위한 낮은 위험을 감안할 때, 현재 프로토콜 DIO 마우스에서 간 지방증을 평가하기에 충분하다. 그러나, NASH의 상태, 플라즈마 ALANI 다른 생화학 적 측정에북동 아미노 전이 효소 (ALT)와 아스 파르 테이트 아미노 전이 효소 (AST) 수치가 이용되어야한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
자금 조달 :이 작품은 중국 국가 자연 과학 재단 (제 81270930, 31471129 및 31671224)와 백 재능 중국 과학 아카데미의 프로그램 (2013OHTP04) YL에 대한 보조금에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1 mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet (HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
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