Introduction
Ожирение является растущей проблемой здравоохранения в развитых и развивающихся странах. Было сообщено, что одним из условий сосуществующих часто связанных с неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), с преобладанием в диапазоне от 30 до 100 процентов в НАЖБП больных 1. Из - за сильной корреляции между жирной печени и ожирением, диеты , вызванной ожирением (DIO) мышиные модели широко используются для изучения сложных молекулярных механизмов , связанных с развитием НАЖБП 2, 3, 4, 5, 6. Стеатоз печени является самой ранней стадии НАЖБП, и он может прогрессировать до неалкогольного стеатогепатита (NASH), цирроз печени, и в конечном счете, рак печени 7. Таким образом, общая цель этого метода заключается в создании модели на животных и клеточных печеночных steatotic условий и ргOvide подробные протоколы для эффективного и точного измерения липидов. Эти модели и измерения также полезны при исследовании других метаболических расстройств, таких как резистентность к инсулину и диабета 2 типа.
Как ожирение определяется одним из ключевых факторов риска НАЖБП, с высоким содержанием жиров, высоким сахарозу диета (HFHS), имитирующее в западном стиле с высоким содержанием жиров используется, чтобы вызвать ожирение у мышей. Впоследствии, степень стеатоза печени может быть оценено с использованием различных методов. Во-первых, масса тела и анализ состава тела с ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) показывают, накопление липидов во время кормления. Жировой массы и мышечной массы может быть определена количественно в неинвазивной и в режиме реального времени способом.
Кроме того, магнитно-резонансная томография (МРТ) используется, чтобы показать, как всего тела и распределение жира в печени. Полутоновой сигнал анализа МРТ может быть преобразован в читаемом псевдо-цветного изображения, и интенсивностьшкала серого и цвет Hemi-количественному определению. Эта технология обеспечивает уникальные преимущества для измерения накопления липидов в организме живых животных. Во-вторых, гистологический анализ печени является наиболее часто используемым методом определения стеатоза печени. Гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивание дает гистологическое информацию, такую как гепатоцитов морфологии и инфильтрацию макрофагов, в то время как окрашивание масляным красным O показывает размер и положение липидных капель в гепатоцитах. В-третьих, анализ содержание липидов с использованием экстракции хлороформ / метанол, является точным и количественное измерение печеночных липидов. Общие уровни триглицеридов и холестерина может быть измерена с биохимическими методами. Важно отметить, что липидный анализ экстракции и окрашивание масляным красным O также могут быть использованы в генетически трансформировано таким образом, или их фармацевтически лечение гепатоцитов.
Преимуществом данного способа является его использование нескольких оптимизированных подходов для создания печеночные моделей steatoticи всесторонне характеризуют фенотипов как в естественных условиях и в пробирке. Модели DIO мыши могут резюмировать патологии и метаболические фенотипы человека жировой болезни печени. Другие метаболические параметры у человека могут быть воспроизведены в этой модели и в 8. Поколение steatotic гепатоцитов модели в ответ на высокий уровень глюкозы плюс инсулина является эффективным, полезным и преодолевает ограничение дорогостоящим и трудоемким работы мыши. Взятые вместе, эти методы являются достаточными и необходимыми для изучения печеночной дисфункции липидов и резистентности к инсулину во время питательного перегрузкой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы животных были утверждены институциональной уходу и использованию животных комитета в Институте наук о питании, Шанхай институтом биологических наук, Китайской академии наук (Шанхай, Китай).
1. DIO Модель мыши
- кормление HFHS
- Кормите восемь недельных самцов мышей C57BL / 6 с HFHS, который содержит 40 ккал% жира и 40% сахарозы ккал. Дом их в 12 ч темно освещенности цикла.
- Держите мышей в состоянии HFHS диеты вскармливание в течение четырех до шестнадцати недель. Проверьте вес тела еженедельно.
- Анализ состава тела и анализа изображений псевдо-цвет
- Тема мышей к анализу тела анализатор состава.
- Закрепить сознательное, а не под наркозом мышей в пластиковой трубке в. Измеряют массу жира тела, мышечную массу, и жидкостей с помощью системы ЯМР, как это описано ранее 2.
- Сканирование всего тела каждой мыши с использованием системы МРТ.
- Обезболить мышей с 1% Avertin через внутрибрюшинной инъекции (25 мкл / г) и выполнять анализ изображений в специализированных стеклянных трубок.
Примечание: Процесс визуализации длится около 0,5 ч для каждой мыши. Когда измерение будет завершено, возвращают мышей в их клетки.
- Обезболить мышей с 1% Avertin через внутрибрюшинной инъекции (25 мкл / г) и выполнять анализ изображений в специализированных стеклянных трубок.
- Сканирование целые тела мышей в спинном, средней и вентральной слоев; сканирование печени в вертикальном направлении. Используйте 0,55 T магнита и следующие инструментальные параметры: K пространство = 192 х 256 мкм, толщина секции = 3 мм, TE = 14.8 мс, TR = 400 мс, FOVRead = 100 мм, FOVPhase = 100 мм, а число сканирований = 8. сканирование с использованием того же магнитного состояния для всех групп мышей.
- Карта полутонового изображения на псевдо-цветное изображение в соответствии с интенсивностью сигнала 9.
- Тема мышей к анализу тела анализатор состава.
- эвтаназии мышь
- Стерилизовать вскрытия трубонг инструменты, такие как щипцы и ножницы.
- Налейте достаточное количество изофлуран на бумажное полотенце и дайте изофлуран улетучиться в стеклянной банке. Убедитесь в том, что мыши усыпляют с помощью изофлуран.
- Закрепить мышей на операционном столе. Спрей каждый живот с 75% -ным этанолом, надрезать в дерме мечевидного отростка с помощью ножниц, и разрыв дермы в продольном направлении через среднюю линию с рук, чтобы выставить брюшины.
- Зажим мечевидного отростка с пинцетом и разрезать брюшину в ширину через нижнюю часть ребер, чтобы выставить внутренностей.
- Сбор крови в ЭДТА покрытием труб с помощью пункции сердца.
- Вырезать диафрагму вдоль печени и тщательно удалить печень от enterocoelia с помощью тонких ножниц. Вырезать три куска ткани печени для следующих измерений липидных: а) 6 х 3 х 3 мм для H & E окрашивания, б) 6 х 3 х 3 мм для окрашивания масляным красным O, и в) в дозе 20-40 мг печени для хлороформа / экстракции метанолом.
- H & E окрашивание
- Закрепить печень в 4% фосфатно-буферном растворе формалина ацетата при температуре 4 ° С в течение ночи, а затем вставлять его в парафин.
- Вырезать парафиновые срезы (5 мкм) и смонтировать их на предметные стекла для H & E окрашивания, как описано ранее , 3, 10.
- Окрашивание масло Red O
- Regent подготовка
- Подготовка нефти Красный O рабочий раствор с 10% -ным формалином, 60% изопропанола, гематоксилином и глицерина желе. Растворить 0,5 г порошка масла Красный O с 100 мл изопропанола и нагревают его в бане с температурой 60 ° для получения 0,5% маточного раствора.
- Развести с бидистиллированной водой (DDH 2 O) в соотношении 3: 2 (3 мл исходного раствора и 2 мл DDH 2 O). Фильтр рабочего раствора и дайте постоять в течение по крайней мере 10 минут при комнатной температуре.
- Вставить в печень Оптимальная температура резания (ОКТ) соединения в арLastic вложение коробка. Замораживание его при -20 ° С в течение 30 мин. Порезать на 8 мкм секций в морозильную микротома, крепление ткани на слайде, и поместить его при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Поместите бумажное полотенце в нижней части окрашивающего ванны и налить небольшое количество 10% -ного формалина, чтобы смочить бумажное полотенце. Поместите слайд в ванне окрашивания и фиксации замороженных срезов в присутствии паров формальдегида в течение 5 мин при 4 ° С.
- Погрузите слайд в 60% изопропанола в окрашивании ванне в течение 3 с; повторить один раз.
- Добавьте несколько капель рабочего раствора масла Red O на слайд, чтобы покрыть все ткани и инкубировать в течение 15 мин. Защита ткани от света месте при комнатной температуре.
- Промыть слайд в новой 60% изопропилового спирта в окрашивании ванне в течение 3 с; повторить дважды.
- Осторожно промыть слайд через дистиллированную воду в два раза и удалить воду вокруг ткани. Убедитесь, что не высушить ткань.
- Поместите слайд в гематоксилином в течение 1 мин и осторожно промыть проточной водой в течение 5-10минимум Осторожно промойте слайд в дистиллированной воде дважды и не держать его в дистиллированной воде до готовности положить на покровное.
- Нагреть глицерин желе в микроволновой печи и поместите несколько капель на верхней части ткани. Аккуратно поместите покровное сверху и заботиться, чтобы не образовывать пузырьки.
- Обратите внимание на пятно под микроскопом и захватить характерные снимки с помощью 20х и 40х.
- Regent подготовка
- Измерение липидов печени
- Поместите расчлененный ткани печени в новом 2-мл пластиковой центрифужной пробирки. Перемешать в 1 мл PBS с использованием гомогенизатора и передачи лизат в новую стеклянную трубку объемом 15 мл.
- Добавьте 5 мл смеси хлороформ / метанол (2: 1, об / об) раствора, вихревую смесь энергично в течение 1 мин, и выдержать в течение 2 ч на льду.
- Центрифуга при 1,650 мкг в течение 10 мин при 4 ° С; смесь должна разделиться на 3-х слоев: верхний слой метанола, средний белок диска, а нижний хлороформа и липиды.
- Tran SFER нижней фазы в новую стеклянную трубку с помощью стеклянной пастеровской пипеткой; нет необходимости, чтобы получить каждую каплю нижней фракции. Установите трубу в сторону на льду.
- Добавить 600 мкл 4 мМ MgCl 2 и 1,5 мл хлороформа в надосадочной фракции , оставшегося в предыдущей трубке и на вортексе. Инкубируют на льду в течение 30 мин и центрифугируют при 1,650 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Объединить нижнюю фазу с первой нижней фазы трубки с помощью пастеровской пипеткой. Выбросить верхний и средний слои.
- Упаривают хлороформа в атмосфере азотного газа в бане с температурой 37 °. Промыть бокам стеклянных трубок тщательно с 200 мкл 1% Тритона Х-100 / хлороформ (об / об). Выпаривают в атмосфере азотного газа. Растворить липида с 200 мкл DDH 2 O и вихря хорошо сделать конечной эмульсии.
- Измерьте общую триглицеридов (ТГ) и холестерина (ТС) уровни с использованием набора триглицерида или холестерина в соответствии с протоколом производителяXref "> 3.
Примечание: Липидные значения нормализуют по отношению к тем из концентраций белка в исходном гомогенате, как определено Количественную оценку белка 3.
2. Первичная мышь гепатоцитов Модель
- Выделение первичных гепатоцитов мыши
- Обезболить каждую мышь с 6% хлоралгидрата (10 мкл / г внутрибрюшинно).
- Изолировать первичных гепатоцитов, как было описано выше 10. Рост клеток на коллаген покрытием покровные стекла в 6-луночный планшет для окрашивания масляным красным O. Для экстракции липидов, семян клеток на 10 см для культивирования клеток блюдо 10 с.
- Лечение клеток и окрашивание масляным красным O
- Заменить среду с 2 мл голодной среды и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 24 ч. Относитесь к нему с 30 мМ глюкозы и 100 нМ инсулина. Выдержите его в 37 ° C культуре инкубаторе в течение 24 ч.
- Аспирируйте среды. Добавить 2 мл PBS и вихрем осторожно прополоскать среду; повторить один раз.
- Закрепить покровное к слайду с резинкой. Защиту клетки прилипшие к наружной поверхности. Выполните окрашивание масляным красным O, как описано выше (этап 1.5).
ПРИМЕЧАНИЕ: базальные уровни накопления липидов стимулируются с высоким содержанием глюкозы плюс лечение инсулином после сывороточного голодания. Липидные капли визуализировали окрашиванием масляным красным O.
- Измерение липидов
- Лечить гепатоциты с высоким содержанием глюкозы плюс инсулина в том же состоянии (этап 2.2.1). Добавить 1 мл PBS в каждую 10-сантиметровом клеточной культуральной чашке. Соскабливают клетки и собирать их в новые стеклянные пробирки объемом 15 мл, из которых аликвоты 100 мкл переносят на свежую 1,5 мл пробирки для белка количественной оценки.
- Добавить 4 мл смеси хлороформ / метанол (2: 1, об / об) в оставшихся 900 мкл клеток. Разрушать ультразвуком для приближенных 20 звуковых сигналов, а затем вихрь энергично, чтобы освободитьлипид в клетках. Выдержите смесь на льду в течение 2 ч. Выполните извлечение липидов (шаг 1.6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 1А, масса тела мышей была увеличена до 45 ± 1,2 г через 16 недель HFHS кормления, что примерно в 1,5 раза выше , чем чау группы рацион питания. Состав тела ЯМР анализ , показывающий массу жира и мышечную массу мышей показаны (рис 1B). Жировые распределения всего тела и печени определяли с помощью МРТ, и представительные псевдо-цветных изображений в живом, сознательному мышей показаны на рисунке 1C-D. Вес тела и состава тела были измерены и визуализированы в процессе кормления диеты HFHS.
Для дальнейшего рассекать steatotic фенотипы, мыши были пожертвованы, и анализ гистологические печени была выполнена. Окрашивание H & E и масло Красный O из печени показаны на рисунке 2А-В, в которой липидные капли растут больше и занимают места в большинствегепатоцитов после 4 месяцев кормления диеты HFHS. Степень печеночной стеатоза HFHS диеты кормили мышей легко визуализируется путем сравнения с чау диеты кормили мышей. Основными компонентами липидов, таких , как триглицеридов и холестерина, были измерены с экстракцией хлороформ / метанол (фиг.2с). У мышей DIO, перегрузка избыток питательных веществ вызвано аномальное накопление триглицеридов в печени. С данным ЯМР, МРТ и гистологического анализа, степень липидных отложений может быть определено точно и эффективно.
Как показано на рисунке 3, уровни липидов в первичных гепатоцитов индуцировали высоким содержанием глюкозы плюс инсулина в течение 24 ч. Накопленные липидные капли определяли путем окрашивания масляным красным O (фиг.3А), и количественный анализ липидов использовали впоследствии для измерения уровней триглицеридов и холестерина в гепатоцитах (рис 3б). Основываясь на этоммодель, эффекты генетической модификации или медикаментозного лечения на гомеостаз липидов в гепатоцитах могут быть исследованы в эффективным и быстрым способом.
Рисунок 1. Высоким содержанием жира, высокой сахарозы диета (HFHS) увеличивает ожирения и стеатоз печени у мышей. Восемь-недельных самцов мышей C57BL / 6 мышей кормили на Chow или HFHS диеты в течение 8 недель и 16 недель, соответственно. Вес (А) Тело мышей. Композиция (В) Тело мышей. (С - D) , представитель изображение магнитного резонанса мыши и печени. Белая область в полутонового изображения указывает на жир, в то время как красная область в псевдо-цветное изображение указывает на жир. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (SEM), п = 5-8. * Р <0,05 по сравнению с Чоу диеты кормили мышей. Столбики ошибок обозначают SEM. Statisticaл анализ проводился с использованием Т-тест непарный, два Стьюдента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Анализ жировая дистрофия печени у мышей , получавших диету HFHS. Восемь-недельных самцов мышей C57BL / 6 мышей кормили на Chow или HFHS диеты в течение 8 недель и 16 недель, соответственно. (А) представитель полная морфология enterocoelia и печени. (B) , представитель Н & Е и окрашивание масляным красным O (шкала баров: 50 мкм). Нефть Красный O пятна жира и нейтральный жир, и красные точки указывают на липидные капли накапливаются в гепатоцитах. (C) Всего триглицеридов и холестерина уровни липидов печени извлечений с использованием метода хлороформ / метанол. Данные были нормализованы к тон вес печени, и представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка (SEM), п = 5-8. * Р <0,05 по сравнению с мышами, которых кормили чау диеты. Столбики ошибок обозначают SEM. Статистический анализ проводился с использованием Т-тест непарный, два Стьюдента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Стеатоз печени индуцируется в первичных гепатоцитов мышей , подвергшихся воздействию высоких концентраций глюкозы плюс инсулина. (A) , масло Красный O окрашивание культивируемых первичных гепатоцитов , обработанных без или с глюкозы и инсулина, как указано (шкала баров: 50 мкм). (B) , уровень триглицеридов в первичных гепатоцитов измеряли и нормализованы к концентрации белка. Данные представлены как среднее ±стандартная ошибка (СЭМ). * Р <0,05 по сравнению с контрольной группой. Столбики ошибок обозначают SEM. Статистический анализ проводился с использованием Т-тест непарный, два Стьюдента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
НЖБП представляет собой ряд прогрессирующих заболеваний печени , что связано с метаболическим синдромом, ожирение, резистентность к инсулину или сахарным диабетом 2 типа (СД2) 11. Отличительной чертой НАЖБП является стеатоз, накопление липидов в гепатоцитах. Здесь спектр методов представлен для характеристики фенотипа и параметры жировая дистрофия печени с помощью DIO мышей и первичные гепатоциты мыши. Эта процедура может быть полезным для выяснения молекулярных механизмов НАЖБП и других связанных с ними метаболических заболеваний.
Объединение в естественных условиях и в пробирке анализов, эти методы обеспечивают всесторонний анализ и оценку жировая дистрофия печени. В настоящее время животные модели НАЖБП в основном состоят из генетических и пищевых моделей. Диета HFHS используется здесь, предназначен для имитации современный стиль диеты и достаточно, чтобы вызвать ожирение и стеатоз печени у мышей. Тем не менее, изучение молекулярных механизмов в Develoлипидного мат ветствующую защитную эк дерегулирования, анализ на основе клеток содержит очевидные преимущества по сравнению с исследования на животных, в том числе легкой манипуляции генетической мутации или медикаментозного лечения, а также относительно низких затрат и обязательств по времени. Для создания стеатоз печени в первичных гепатоцитов мышей, высокие концентрации глюкозы плюс инсулина используются для индукции накопления липидов, который является новым и эффективным в модели пробирке , чтобы имитировать в естественных условиях диеты индуцированной гипергликемии и гиперинсулинемии. Эта обработка также применима и к другим печеночных клеточных линий, таких как клетки HepG2. Принимая во внимание , что генетически модифицированные гепатоциты доступны для различных фармацевтических обработок, в пробирке steatotic модель , описанная здесь , преодолевает ограничения и отнимающих много времени шаги для генерации животных моделей с использованием амплитудно и с потерей функции подходов.
Состава тела анализа, включая ЯМР и МРТ, обеспечивают неинвазивные и в режиме реального времени данные олипида во всем теле и печени. Это неинвазивный, экономия времени, наглядных и полу-качественное измерение. Кроме того, точность анализа состава тела может быть значительно улучшена путем комбинирования других гистологических и биохимических показателей. Крайне важно и необходимо , чтобы определить , стеатоз печени в естественных условиях и в пробирке , используя H & E окрашивание, окрашивание масляным красным O и измерение липидов, все из которых являются золотым стандартом измерения для диагностики и классификации стеатоз печени.
Одним из недостатков данного способа является невозможность измерить воспаление и коллагена осаждения, когда простой стеатоз прогрессирует в гепатит, фиброз, и в конечном счете, цирроз и рак печени. Учитывая, что диета индуцированных у мышей с ожирением имеют низкую степень риска для развития НАСГ, текущий протокол является достаточным для оценки стеатоз печени у мышей DIO. Тем не менее, в условиях NASH, других биохимических показателей, таких как плазменные аланпе (АЛТ) и уровни аспартатаминотрансферазы (AST), следует использовать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Финансирование: Эта работа была поддержана грантами от Национального фонда естественных наук Китая (№ 81270930, 31471129 и 31671224) и Сто талантов Программа Китайской академии наук (2013OHTP04) до Ю.Л.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1 mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet (HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
