Introduction
L'obesità è un problema di salute in rapida crescita nei paesi sviluppati e in via di sviluppo. E 'stato segnalato per essere una delle condizioni coesistenti frequentemente associati con steatosi epatica non alcolica (NAFLD), con una prevalenza che varia tra il 30 e il 100 per cento in pazienti con NAFLD 1. A causa della forte correlazione tra il fegato grasso e l'obesità, obesi (DIO) modelli murini di dieta-indotta sono ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi molecolari complessi associati con lo sviluppo di NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Steatosi epatica è il primo stadio della NAFLD, e può progredire a steatoepatite non alcolica (NASH), cirrosi, e in ultima analisi, il cancro del fegato 7. Pertanto, l'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare modelli animali e cellulari di condizioni steatosico epatiche e al PrOvide protocolli dettagliati per la misurazione dei lipidi efficiente ed accurato. Questi modelli e misure sono utili anche per la ricerca di altri disordini metabolici, come la resistenza all'insulina e diabete di tipo 2.
Come l'obesità è identificato come uno dei principali fattori di rischio per la NAFLD, un alto contenuto di grassi, ad alto saccarosio dieta (HFHS) che imita la dieta ricca di grassi di tipo occidentale è usato per indurre l'obesità nei topi. Successivamente, il grado di steatosi epatica può essere valutata con metodi diversi. In primo luogo, il peso corporeo e analisi della composizione corporea con risonanza magnetica nucleare (NMR) mostrano l'accumulo di lipidi durante il tempo di alimentazione. La massa grassa e massa magra possono essere quantificati in modo non invasivo e in tempo reale.
Inoltre, la risonanza magnetica (MRI) viene utilizzata sia per il corpo intero e la distribuzione fegato grasso. Il segnale scala di grigi dell'analisi MRI può essere convertito un'immagine pseudo-colori leggibile in, e l'intensità dellala scala di grigi e colore è emi-quantificabile. Questa tecnologia offre vantaggi unici per la misurazione di accumulo di lipidi di animali vivi. In secondo luogo, l'analisi istologica del fegato è il metodo più comunemente utilizzato per determinare steatosi epatica. Ematossilina ed eosina (H & E) colorazione istologica fornisce informazioni, quali epatociti morfologia e infiltrazione di macrofagi, mentre Oil Red O colorazione mostra la dimensione e la posizione delle goccioline lipidiche in epatociti. In terzo luogo, l'analisi del contenuto di lipidi utilizzando estrazione con cloroformio / metanolo è una misurazione accurata e quantitativa dei lipidi epatici. Totale livelli di trigliceridi e di colesterolo possono essere misurati con metodi biochimici. È importante sottolineare che l'analisi estrazione dei lipidi e Oil Red O colorazione possono essere utilizzati anche in geneticamente manipolato o trattato farmaceuticamente epatociti.
Il vantaggio del presente metodo è la sua utilizzazione di approcci multipli ottimizzati per generare modelli steatosico epatichee caratterizzare completo fenotipi sia in vivo che in vitro. I modelli DIO mouse possono ricapitolare i patologia e metaboliche fenotipi di malattia del fegato grasso umano. Altri parametri metabolici negli esseri umani possono essere replicati in questo modello, come pure 8. La generazione del modello epatociti steatosico in risposta ad alta glucosio più insulina è efficiente, utile, e supera la limitazione del lavoro costoso e richiede tempo mouse. Nel loro insieme, questi metodi sono sufficienti ed essenziali per lo studio della disfunzione epatica lipidi e insulino-resistenza durante sovraccarico di nutrienti.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali su animali sono stati approvati dal comitato di cura degli animali e uso istituzionale presso l'Istituto di Scienze dell'Alimentazione, Istituti di Shanghai per Scienze Biologiche, Accademia Cinese delle Scienze (Shanghai, Cina).
1. DIO modello murino
- alimentazione HFHS
- Feed the otto settimane di età maschile C57BL / 6 topi con una HFHS che contiene 40 kcal% di grassi e 40 kcal% di saccarosio. loro casa a 12 h Condizioni ciclo dark-light.
- Mantenere i topi in HFHS condizione di dieta al seno per quattro a sedici settimane. Controllare il settimanale del peso corporeo.
- Analisi della composizione corporea e analisi delle immagini pseudo-color
- Sottoporre i topi a una analisi della composizione corporea analizzatore.
- Fissare cosciente, topi non anestetizzati in un tubo di plastica nel. Misurare la massa grassa, massa magra, e fluidi che utilizzano un sistema di NMR, come descritto in precedenza 2.
- Eseguire la scansione di tutto il corpo di ogni mouse utilizzando un sistema di risonanza magnetica.
- Anestetizzare i topi con 1% avertin tramite iniezione intraperitoneale (25 ml / g) ed eseguire l'analisi di imaging in tubi di vetro specializzati.
NOTA: Il processo di formazione immagine ha una durata di circa 0,5 ore per ogni mouse. Quando la misurazione è completata, restituire i topi per gabbia.
- Anestetizzare i topi con 1% avertin tramite iniezione intraperitoneale (25 ml / g) ed eseguire l'analisi di imaging in tubi di vetro specializzati.
- Eseguire la scansione l'intero corpo dei topi in dorsale centrale, e gli strati ventrale; scandire il fegato in direzione verticale. Utilizzare un magnete 0,55 T e dei seguenti parametri strumentali: spazio K = 192 x 256 micron, lo spessore della sezione = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, e il numero di scansioni = 8. scansione utilizzando la stessa condizione magnetica per i tutti i gruppi di topi.
- Mappa scala di grigio dell'immagine una pseudo-colore sul secondo l'intensità del segnale 9.
- Sottoporre i topi a una analisi della composizione corporea analizzatore.
- l'eutanasia del mouse
- sterilizzare dissectistrumenti NG, come pinze e forbici.
- Versare isoflurano sufficienti su un tovagliolo di carta e lasciare che il isoflurano volatilizza in un barattolo di vetro. Assicurarsi che i topi sono eutanasia dal isoflurano.
- Fissare i topi su un tavolo operatorio. Spruzzare ogni addome con 75% etanolo, fare un'incisione nel derma del processo xifoideo con le forbici, e strappare il derma longitudinalmente attraverso la linea mediana con le mani per esporre il peritoneo.
- Bloccare il processo xifoideo con una pinza e tagliare il peritoneo in larghezza attraverso il fondo delle nervature per esporre le viscere.
- Prelevare il sangue in provette EDTA rivestite mediante puntura cardiaca.
- Tagliare il diaframma lungo il fegato e rimuovere con attenzione il fegato dai enterocoelia con le forbici sottili. Tagliare tre pezzi di tessuto epatico per le seguenti misure lipidi: a) 6 x 3 x 3 mm per H & E colorazione, b) 6 x 3 x 3 mm per Oil Red O colorazione, e c) 20-40 mg di fegato per il cloroformio / l'estrazione metanolo.
- Colorazione H & E
- Fissare il fegato in 4% tampone fosfato di formalina acetato a 4 ° C durante la notte e poi incorporare in paraffina.
- Tagliare sezioni di paraffina (5 micron) e montare su vetrini per colorazione H & E, come precedentemente descritto 3, 10.
- Oil Red O colorazione
- preparazione Regent
- Preparare la soluzione di lavoro Oil Red O con formalina al 10%, il 60% di isopropanolo, ematossilina, e gelatina glicerolo. Sciogliere 0.5 g di Oil Red O polvere con 100 ml di isopropanolo e riscaldare in un bagno a 60 ° C per ottenere una soluzione stock di 0,5%.
- Diluire con acqua bidistillata (DDH 2 O) in un rapporto 3: 2 (3 ml di soluzione madre e 2 ml di DDH 2 O). Filtrare la soluzione di lavoro e lasciate riposare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente.
- Incorpora il fegato di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto in apscatola incasso lastic. Congelarlo a -20 ° C per 30 min. Tagliare in sezioni di 8 micron di un microtomo di congelamento, montare il tessuto su un vetrino, e metterlo a temperatura ambiente per 30 min.
- Posizionare un tovagliolo di carta sul fondo di una vasca di colorazione e versare una piccola quantità di formalina al 10% di bagnare l'asciugamano di carta. Posizionare il vetrino nella colorazione vasca e fissare le sezioni congelate in vapori di formaldeide per 5 minuti a 4 ° C.
- Immergere il vetrino nel 60% isopropanolo nella vasca colorazione per 3 s; ripetere una volta.
- Aggiungere poche gocce di soluzione di lavoro Oil Red O alla diapositiva per coprire tutto il tessuto e incubare per 15 min. Proteggere i tessuti dalla luce a temperatura ambiente.
- Lavare il vetrino in nuova isopropanolo 60% nella vasca colorazione per 3 s; ripetere due volte.
- Lavare delicatamente il vetrino con acqua distillata due volte e rimuovere l'acqua in tutto il tessuto. Assicurarsi di non asciugare il tessuto.
- Posizionare il vetrino in ematossilina per 1 min e risciacquare delicatamente con acqua corrente per 5-10min. Lavare delicatamente il vetrino in acqua distillata due volte e mantenere l'in acqua distillata fino al momento di mettere sul vetrino.
- Riscaldare la gelatina glicerolo nel microonde e mettere alcune gocce sulla parte superiore del tessuto. Posizionare delicatamente il coprioggetto sulla parte superiore e fare attenzione a non formare bolle.
- Osservare la macchia sotto un microscopio e catturare immagini caratteristici utilizzando 20X e 40X obiettivi.
- preparazione Regent
- Dosaggio dei lipidi del fegato
- Posizionare il tessuto epatico sezionato in una nuova provetta da centrifuga 2 mL di plastica. Omogeneizzare in 1 mL di PBS con un omogeneizzatore e trasferire il lisato in un tubo di vetro da 15 ml.
- Aggiungere 5 ml di cloroformio / metanolo (2: 1, v / v), vortex la miscela vigorosamente per 1 minuto, e lasciate riposare per 2 ore sul ghiaccio.
- Centrifugare a 1.650 xg per 10 min a 4 ° C; la miscela deve separare in 3 strati: lo strato superiore metanolo, il disco proteine centrale, e il cloroformio inferiore e lipidi.
- Tran SFER la fase di fondo in un nuovo tubo di vetro con una lente di Pasteur pipetta; non vi è alcuna necessità di ottenere ogni goccia della frazione inferiore. Impostare il tubo da parte su ghiaccio.
- Aggiungere 600 ml di 4 mM MgCl 2 e 1,5 mL di cloroformio alla frazione supernatante sinistra nel tubo precedente e agitare vigorosamente. Incubare in ghiaccio per 30 minuti e centrifugare a 1.650 xg per 10 min a 4 ° C.
- Unire la fase di fondo con il primo tubo fase di fondo utilizzando Pasteur pipetta. Eliminare gli strati superiori e medie.
- Si evapora il cloroformio sotto azoto in un bagno a 37 ° C. Lavare i lati dei tubi di vetro a fondo con 200 ml di 1% Triton X-100 / cloroformio (v / v). Far evaporare sotto azoto. Sciogliere il lipidico con 200 ml di DDH 2 O e vortice bene a fare l'emulsione finale.
- Misurare la trigliceridi totali (TG) e colesterolo (TC) livelli utilizzando un trigliceride o colesterolo kit secondo il protocollo del produttorexref "> 3.
NOTA: I valori lipidici sono normalizzati a quelli delle concentrazioni di proteine in omogenato iniziale, come determinato dalla proteina quantificazione 3.
Modello 2. principale del mouse epatociti
- L'isolamento di epatociti primari di topo
- Anestetizzare ogni mouse con il 6% cloralio idrato (10 ml / g per via intraperitoneale).
- Isolare epatociti primari, come descritto in precedenza 10. Crescere le cellule su vetrini collagene rivestite in un 6-pozzetti per Oil Red O colorazione. Per l'estrazione dei lipidi, seminare le cellule su un 10-cm coltura cellulare piatto 10.
- Trattamento con cellule e Oil Red O colorazione
- Sostituire il mezzo con 2 mL di terreno fame e incubare a 37 ° C per 24 h. Trattare con 30 mM glucosio e di insulina 100 nM. Incubare a 37 ° C cultura incubatore per 24 h.
- Aspirare il mezzo. Aggiungere 2 ml di PBS e miscelare delicatamente per sciacquare il medium; ripetere una volta.
- Fissare il vetrino alla slitta con un elastico. Esporre le cellule aderenti alla superficie esterna. Eseguire la colorazione Oil Red O come descritto sopra (punto 1.5).
NOTA: I livelli basali di accumulo di lipidi vengono stimolati con un elevato glucosio più trattamento insulina dopo deprivazione di siero. Le gocce lipidiche vengono visualizzati con Oil Red O colorazione.
- Dosaggio dei lipidi
- Trattare gli epatociti con alte concentrazioni di glucosio più insulina nella stessa condizione (punto 2.2.1). Aggiungere 1 ml di soluzione salina in ogni 10 cm piatto di coltura cellulare. Raschiare le cellule e li raccolgono in nuovi tubi di vetro da 15 ml, da cui aliquote di 100 microlitri vengono trasferiti ai tubi freschi 1.5 mL per la quantificazione delle proteine.
- Aggiungere 4 mL di cloroformio / metanolo (2: 1, v / v) al residuo 900 ml di cellule. Con ultrasuoni per circa il 20 emette un segnale acustico e poi vortice vigorosamente per liberarei lipidi nelle cellule. Incubare la miscela in ghiaccio per 2 ore. Eseguire l'estrazione dei lipidi (passo 1,6).
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Representative Results
Come mostrato in figura 1A, il peso del corpo del mouse è stato aumentato a 45 ± 1,2 g dopo 16 settimane di HFHS alimentazione, che è circa 1,5 volte superiore rispetto al gruppo di alimentazione dieta chow. La composizione corporea NMR analisi mostra la massa grassa e massa magra di topi sono indicati (Figura 1B). Le distribuzioni di grasso del corpo e del fegato sono state determinate mediante MRI, e immagini rappresentative pseudo-colori in vivo, topi coscienti sono mostrati nella Figura 1C-D. La composizione del peso corporeo e il corpo sono stati misurati e visualizzati durante il processo di alimentazione dieta HFHS.
Per sezionare ulteriormente i fenotipi steatosico, i topi sono stati sacrificati ed è stata effettuata una analisi istologica del fegato. La colorazione H & E e Oil Red O dei fegati sono mostrati in Figura 2A-B, in cui goccioline lipidiche sviluppano più grandi e occupano gli spazi in piùepatociti dopo 4 mesi di alimentazione dieta HFHS. Il grado di steatosi epatica di topi nutriti con dieta HFHS è facilmente visualizzabile attraverso il confronto con i topi nutriti dieta-chow. I componenti principali del lipide, quali trigliceridi e colesterolo, sono stati misurati con estrazione con cloroformio / metanolo (Figura 2C). Nei topi DIO, il sovraccarico di nutrienti in eccesso causato accumulo anomalo di trigliceridi nel fegato. Con i dati di NMR, MRI e analisi istologica, il grado di deposizione di lipidi può essere determinato in modo efficiente e preciso.
Come mostrato in figura 3, i livelli di lipidi in epatociti primari sono stati indotti da glucosio più insulina per 24 h. Le goccioline lipidiche accumulati sono stati determinati Oil Red O colorazione (Figura 3A), e l'analisi quantitativa dei lipidi è stato utilizzato successivamente per misurare i livelli di colesterolo e trigliceridi in epatociti (Figura 3B). Basato su questomodello, gli effetti di modificazione genetica o trattamento farmaceutico omeostasi lipidica in epatociti può essere studiata in modo efficiente e rapido.
Figura 1.-alto contenuto di grassi, dieta ad alto contenuto di saccarosio (HFHS) aumenta l'obesità e steatosi epatica nei topi. Otto settimane di età C57BL maschio / 6 topi sono stati nutriti con un chow o dieta HFHS per 8 settimane e 16 settimane, rispettivamente. Peso (A) del corpo dei topi. Composizione (B) del corpo dei topi. (C - D) immagine a risonanza magnetica Rappresentante del mouse e del fegato. L'area di immagine in bianco il grigio in scala indica il grasso, mentre l'area rossa dell'immagine pseudo-colore indica il grasso. I dati sono rappresentati come media ± errore standard (SEM), n = 5-8. * P <0.05 rispetto ai topi nutriti dieta-chow. Le barre di errore rappresentano SEM. StatisticaL 'analisi è stata effettuata utilizzando il test t di spaiati, di Student a due code. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Analisi di steatosi epatica nei topi alimentati con una dieta HFHS. Otto settimane di età C57BL maschio / 6 topi sono stati nutriti con un chow o dieta HFHS per 8 settimane e 16 settimane, rispettivamente. (A) Rappresentante morfologia lordo di enterocoelia e del fegato. (B) Rappresentante H & E e olio rosso O colorazione (barre di scala: 50 micron). Oil Red O macchia il grasso e grasso neutro, e puntini rossi indicano gocce lipidiche accumulati negli epatociti. (C) di colesterolo e trigliceridi totali livelli delle estrazioni lipidi fegato utilizzando il metodo cloroformio / metanolo. I dati sono stati normalizzati a tegli peso del fegato, e sono rappresentati come media ± errore standard (SEM), n = 5-8. * P <0.05 rispetto ai topi nutriti con la dieta chow. Le barre di errore rappresentano SEM. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il test t di spaiati, di Student a due code. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. La steatosi epatica è indotta negli epatociti principale del mouse esposti ad alti livelli di glucosio più insulina. (A) Oil Red O colorazione di epatociti primari in coltura trattati senza o con glucosio e di insulina, come indicato (barre di scala: 50 micron). (B) livello di trigliceridi negli epatociti primari è stato misurato e normalizzati alla concentrazione di proteine. I dati sono rappresentati come media ±l'errore standard (SEM). * P <0,05 rispetto al gruppo di controllo. Le barre di errore rappresentano SEM. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il test t di spaiati, di Student a due code. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
NAFLD è una serie di malattie epatiche progressive che è associato con la sindrome metabolica, l'obesità, insulino-resistenza, o diabete mellito tipo 2 (DM2) 11. Il segno distintivo di NAFLD è steatosi, l'accumulo di lipidi negli epatociti. Qui, uno spettro di metodi è presentata per caratterizzare i fenotipi e parametri di steatosi epatica utilizzando topi DIO e epatociti del mouse primarie. Questa procedura potrebbe essere utile per chiarire i meccanismi molecolari di NAFLD e altre malattie metaboliche correlate.
Combinando in vivo e in vitro, questi metodi forniscono analisi complete e valutazioni di steatosi epatica. Attualmente, modelli animali di NAFLD sono costituiti principalmente da modelli genetici e nutrizionali. La dieta HFHS usato qui ha lo scopo di imitare lo stile moderno dieta ed è sufficiente per indurre l'obesità e steatosi epatica nei topi. Tuttavia, per studiare i meccanismi molecolari del svipment della deregolamentazione dei lipidi, il saggio basato su cellule contiene evidenti vantaggi oltre studio su animali, tra cui una facile manipolazione da una mutazione genetica o trattamento farmacologico, così come i costi relativamente bassi e impegni di tempo. Per generare steatosi epatica in epatociti primari di topo, alte concentrazioni di glucosio più insulina vengono utilizzati per indurre accumulo di lipidi, che è un nuovo ed efficiente modello in vitro per imitare in vivo iperglicemia e l'iperinsulinemia indotta dalla dieta. Questo trattamento è anche applicabile ad altre linee cellulari epatiche, quali cellule HepG2. Dato che epatociti geneticamente modificati sono accessibili ad una varietà di trattamenti farmaceutici, il modello di vitro steatosico in qui descritto supera la limitazione e gradini in termini di tempo per la generazione di modelli animali usando GAIN- e approcci perdita di funzione.
La composizione corporea analizza, tra cui NMR e MRI, fornire i dati non invasive e in tempo reale sulipidi in tutto il corpo e nel fegato. Si tratta di un non-invasiva, risparmio di tempo, visualizzabili, e la misurazione semi-qualitativa. Inoltre, la precisione di analisi della composizione corporea può essere notevolmente migliorata combinando altre misurazioni istologiche e biochimiche. È critico e necessario determinare steatosi epatica in vivo e in vitro usando colorazione H & E, Oil Red O colorazione, e la misurazione dei lipidi, che sono tutti misurazioni gold standard per la diagnosi e la classificazione steatosi epatica.
Uno dei limiti del presente metodo è la sua incapacità di misurare l'infiammazione e il collagene deposizione quando semplice steatosi progredisce per l'epatite, fibrosi, e in ultima analisi, la cirrosi e cancro del fegato. Dato che la dieta-indotta topi obesi hanno un basso rischio per lo sviluppo della NASH, il protocollo attuale è sufficiente per valutare steatosi epatica nei topi DIO. Tuttavia, nella condizione di NASH, altre misurazioni biochimiche, come Alani plasmaNE aminotransferasi (ALT) e livelli di aspartato aminotransferasi (AST), dovrebbero essere utilizzati.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation naturale della Cina (n ° 81.270.930, 31.471.129, e 31.671.224) e le cento talenti del programma della Accademia Cinese delle Scienze (2013OHTP04) a YL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1 mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet (HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
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