Introduction
Fedme er et voksende sundhedsproblem i de udviklede lande og udviklingslande. Det er blevet rapporteret at være en af de samtidige tilstande ofte forbundet med alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD), med en prævalens på mellem 30 og 100 procent i NAFLD patient 1. På grund af den tætte sammenhæng mellem fedtlever og fedme, er diæt-induceret fede (DIO) musemodeller almindeligt anvendt til at undersøge de komplekse molekylære mekanismer, der er forbundet med udviklingen af NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Leversteatose er den tidligste fase af NAFLD, og det kan udvikle sig til ikke-alkoholiske steatohepatitis (NASH), skrumpelever, og i sidste ende, leverkræft 7. Derfor det overordnede mål med denne metode er at generere dyre- og celle modeller af hepatiske steatotic betingelser og PRovide detaljerede protokoller for effektiv og præcis lipid måling. Disse modeller og målinger er også nyttige til undersøgelse af andre metaboliske lidelser, såsom insulinresistens og type 2-diabetes.
Som fedme er identificeret til at være en af de vigtigste risikofaktorer for NAFLD, en højt fedtindhold, er høj-sucrose kost (HFHS), der efterligner vestlig fedtrig kost anvendes til at fremkalde fedme hos mus. Efterfølgende kan vurderes graden af hepatisk steatose hjælp af forskellige metoder. Første, kropsvægt og kropssammensætning analyse med kernemagnetisk resonans (NMR) viser lipidakkumulering under fodring tid. Fedtmassen og lean masse kan kvantificeres på en ikke-invasiv og tidstro måde.
Desuden er magnetisk resonans (MRI) anvendes til at vise både hele kroppen og leveren fordeling af fedt. Den gråtoner signal af MRI-analyse kan omdannes til en læselig pseudo-farve, og intensiteten afgråtoner og farve er hemi-kvantificerbare. Denne teknologi giver enestående fordele ved måling af lipid akkumulering i levende dyr. For det andet, histologisk analyse af leveren er den mest anvendte metode til bestemmelse leversteatose. Hematoxylin og eosin (H & E) -farvning giver histologisk information, såsom hepatocyt morfologi og makrofaginfiltration, mens Oil Red O-farvning viser størrelsen og placeringen af lipiddråber i hepatocytter. Tredje, lipidindholdet analyse under anvendelse af chloroform / methanol-ekstraktion er en nøjagtig og kvantitativ måling af hepatiske lipider. Total triglycerid og kolesterol kan måles med biokemiske metoder. Vigtigt er det, kan lipidekstraktion analyse og Oil Red O-farvning også anvendes i genetisk manipuleret eller farmaceutisk behandlet hepatocytter.
Fordelen ved den foreliggende fremgangsmåde er dens udnyttelse af flere optimerede fremgangsmåder til at generere hepatiske steatotic modellerog at omfattende karakterisere de fænotyper både in vivo og in vitro. DIO musemodeller kan rekapitulere patologien og metaboliske fænotyper af human fedtlever sygdom. Andre metaboliske parametre hos mennesker kan replikeres i denne model samt 8. Frembringelsen af den steatotic hepatocyt model som reaktion på højt glucoseindhold plus insulin er effektiv, nyttig og overvinder begrænsningen af dyre og tidskrævende muse arbejde. Alle disse metoder er tilstrækkelige og afgørende for studiet af hepatisk lipid dysfunktion og insulinresistens under næringsstof overbelastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr eksperimentelle protokoller blev godkendt af den institutionelle dyr pleje og brug udvalg ved Institut for Nutritional Sciences, Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina).
1. DIO musemodel
- HFHS fodring
- Feed otte uger gammel mand C57BL / 6 mus med en HFHS der indeholder 40 kcal% fedt og 40 kcal% sucrose. Huse dem i 12 h mørke-lyscyklus betingelser.
- Hold musene i HFHS kost-fodring betingelse for fire til seksten uger. Kontroller legemsvægt ugentligt.
- Kropssammensætning analyse og pseudo-farve billedanalyse
- Emne mus til en kropssammensætning analysator analyse.
- Sikker bevidst, ikke bedøvet mus i et plastrør i. Mål kropsfedtmasse, lean masse, og væsker, der anvender et NMR-system, som tidligere 2 beskrevne.
- Scan hele kroppen af hver mus ved hjælp af et MRI-system.
- Bedøver musene med 1% avertin via intraperitoneal injektion (25 uL / g) og udfører billedbehandling analyse i specialiserede glasrør.
BEMÆRK: Processen med billeddannelse varer næsten 0,5 timer for hver mus. Når målingen er afsluttet, returnerer musene til deres bur.
- Bedøver musene med 1% avertin via intraperitoneal injektion (25 uL / g) og udfører billedbehandling analyse i specialiserede glasrør.
- Scan hele kroppe af musene i dorsal, midten, og ventrale lag; scanne leveren i lodret retning. Brug en 0,55 T magnet og de følgende instrumentale parametre: K plads = 192 x 256 um, afsnit tykkelse = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, og antallet af scanninger = 8. Scan ved hjælp af den samme magnetiske tilstand for alle grupper af mus.
- Kort gråtonebilledet på en pseudo-farvebillede i overensstemmelse med signalet intensitet 9.
- Emne mus til en kropssammensætning analysator analyse.
- mus dødshjælp
- sterilisere dissecting værktøjer, såsom pincet og saks.
- Hæld tilstrækkelig isofluran på et stykke køkkenrulle og lad isofluran fordampe i en glaskrukke. Sørg for, at musene aflives af isofluran.
- Fix de mus på et operationsbord. Spray hver abdomen med 75% ethanol, lave et snit i dermis formet som et sværd proces med en saks, og rive dermis længderetningen gennem midterlinjen med hænderne for at blotlægge peritoneum.
- Klemme xiphoid proces med pincet og skære peritoneum bredden gennem bunden af ribberne for at blotlægge de indre organer.
- Indsamle blod i EDTA-coatede rør ved hjertepunktur.
- Skær mellemgulvet langs leveren og fjern forsigtigt leveren fra enterocoelia hjælp fine saks. Skær tre stykker af levervæv for følgende lipidmålinger: a) 6 x 3 x 3 mm for H & E-farvning, b) 6 x 3 x 3 mm for Oil Red O-farvning, og c) 20-40 mg leveren til chloroform / methanol ekstraktion.
- H & E-farvning
- Fix leveren i 4% phosphatpufret formalin acetat ved 4 ° C natten over og derefter integrere det i paraffinvoks.
- Skær paraffinsnit (5 um) og montere dem på objektglas for H & E-farvning, som tidligere beskrevet 3, 10.
- Oil Red O-farvning
- Regent forberedelse
- Forbered Oil Red O arbejdsopløsning med 10% formalin, 60% isopropanol, Hematoxylin og glycerol gelé. Opløs 0,5 g af Oil Red O pulver med 100 ml isopropanol og opvarm den i en 60 ° C bad for at lave en 0,5% stamopløsning.
- Fortynd med dobbelt destilleret vand (Hedeselskabet 2 O) ved en 3: 2-forhold (3 ml stamopløsning og 2 ml Hedeselskabet 2 O). Filtreres arbejdsopløsning og lad stå i mindst 10 minutter ved stuetemperatur.
- Integrer leveren i optimal skæring temperatur (OLT) sammensatte i apLastic indlejring kassen. Fryse den ved -20 ° C i 30 min. Skær den i 8-um snit i en indefrysning mikrotom, montere væv på et dias, og placere den ved stuetemperatur i 30 min.
- Placer en papirserviet i bunden af en farvning karbad og hæld en lille mængde af 10% formalin at befugte papirserviet. Placer dias i farvningen karbad og fastsætte de frosne snit i formaldehyd dampe i 5 minutter ved 4 ° C.
- Dyp dias i 60% isopropanol i farvningen karbad for 3 s; Gentag en gang.
- Tilføj et par dråber Oil Red O arbejder løsning på dias for at dække alle væv og inkuberes i 15 min. Beskytte vævet mod lys ved stuetemperatur.
- Skyl dias i nye 60% isopropanol i farvningen karbad for 3 s; Gentag to gange.
- Skyl forsigtigt glide gennem destilleret vand to gange og fjerne vandet omkring vævet. Sørg for ikke at tørre vævet.
- Placer dias i Hematoxylin i 1 min og skyl forsigtigt med postevand i 5-10min. Skyl forsigtigt dias i destilleret vand to gange og holde det i destilleret vand indtil den er klar til at sætte på dækglasset.
- Opvarm glycerol jelly i mikrobølgeovn og placere flere dråber oven på vævet. Anbring forsigtigt dækglasset på toppen og passe på ikke at danne bobler.
- Overhold pletten under et mikroskop og fange karakteristiske billeder med 20X og 40X mål.
- Regent forberedelse
- Måling af leverlipider
- Placer dissekerede levervæv i et nyt 2 ml centrifugerør af plastic. Homogeniseres i 1 ml PBS med en homogenisator og overføre lysat til en ny 15 ml reagensglas.
- Tilsæt 5 ml chloroform / methanol (2: 1, vol / vol) opløsning, vortex blandingen kraftigt i 1 min, og lad stå i 2 timer på is.
- Centrifuger ved 1.650 xg i 10 minutter ved 4 ° C; blandingen skal adskilles i 3 lag: den øverste methanol lag, den midterste protein disk, og den nederste chloroform og lipider.
- Tran Sfer bundfasen i et nyt glasrør under anvendelse af en glas Pasteur-pipette; der ikke er behov for at få hver dråbe af den nederste fraktion. Sæt røret til side på is.
- Tilføj 600 pi 4 mM MgCl2 og 1,5 ml chloroform til supernatantfraktionen venstre i det foregående rør og vortexes kraftigt. Der inkuberes på is i 30 minutter og centrifugeres ved 1.650 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Kombiner bundfasen med den første nederste fase rør under anvendelse Pasteur-pipette. Kassér de øvre og mellemste lag.
- Inddamp chloroform under nitrogengas i et 37 ° C bad. Vask siderne af glasrørene grundigt med 200 pi 1% Triton X-100 / chloroform (rumfang / rumfang). Inddamp under nitrogengas. Opløs lipid med 200 gi Hedeselskabet 2 O og vortex godt at foretage den endelige emulsion.
- Mål den totale triglycerid (TG) og cholesterol (TC) niveauer ved hjælp af et triglycerid eller cholesterol kit ifølge producentens protokolxref "> 3.
BEMÆRK: lipidværdier normaliseres til de af koncentrationerne protein i den indledende homogenatet, som bestemt ved protein kvantificering 3.
2. Primær Mouse Hepatocyt Model
- Isolering af muse primære hepatocytter
- Bedøver hver mus med 6% chloralhydrat (10 uL / g intraperitonealt).
- Isoler primære hepatocytter, som tidligere beskrevet 10. Dyrk celler på collagen-coatede dækglas i en 6-brønds plade til Oil Red O-farvning. Til fedtekstraktion, frø cellerne på en 10 cm cellekultur fad 10.
- Celle behandling og Oil Red O-farvning
- Erstatte mediet med 2 ml af sult medium og inkuberes ved 37 ° C i 24 timer. Behandle det med 30 mM glucose og 100 nM insulin. Inkuber det i et 37 ° C kultur inkubator i 24 timer.
- Sug mediet. Tilsæt 2 mL PBS og bland forsigtigt at skylle mediet; Gentag en gang.
- Fastgør dækglasset på objektglasset med en elastik. Eksponere cellerne klæbende til den ydre overflade. Udfør Oil Red O-farvning som beskrevet ovenfor (trin 1.5).
BEMÆRK: De basale niveauer af lipid akkumulering stimuleres med en høj glucose plus insulin behandling efter serum sult. Lipid dråber gøres synlige ved Oil Red O-farvning.
- Måling af lipider
- Behandl hepatocytterne med høj glukose plus insulin i samme stand (trin 2.2.1). Tilsæt 1 ml PBS i hvert 10 cm cellekultur parabol. Skrabes cellerne og høste dem i nye 15-ml rør, hvorfra portioner på 100 pi overføres til friske 1,5-ml rør for protein kvantificering.
- Tilsæt 4 ml chloroform / methanol (2: 1, v / v) til den resterende 900 pi celler. Sonikeres for omtrentlige 20 bip og derefter vortex kraftigt at frigivelipidet i cellerne. Inkuber blandingen på is i 2 timer. Udfør lipid ekstraktion (trin 1.6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 1A blev musen legemsvægt steget til 45 ± 1,2 g efter 16 ugers HFHS fodring, der er ca. 1,5 gange højere end foderdiæt fodring gruppe. NMR kropssammensætning analyser viser fedtmasse og mager masse af mus er vist (figur 1B). De fede fordelinger af hele kroppen og i leveren blev bestemt ved MRI, og repræsentative pseudo-farvebilleder i levende, bevidste mus er vist i figur 1C-D. Det kropsvægt og kropssammensætning blev målt og visualiseret under HFHS kost fodring proces.
For yderligere at dissekere de steatotic fænotyper blev musene aflivet, og blev udført en lever histologisk analyse. H & E og Oil Red O-farvning af leverne er vist i figur 2A-B, i hvilket lipiddråber vokse sig større og optager mellemrummene i de flestehepatocytter efter 4 måneders HFHS kost fodring. Graden af leversteatose af HFHS kost-fed mus let visualiseres ved at sammenligne med chow kost-fodret mus. De vigtigste komponenter i lipidet, såsom triglycerid og cholesterol, blev målt med chloroform / methanol-ekstraktion (figur 2C). I DIO mus, den overskydende næringsstof overbelastning forårsaget unormal triglycerid akkumulering i leveren. Med data fra NMR, MRI, og histologisk analyse, kan bestemmes effektivt og nøjagtigt graden af lipid deposition.
Som vist i figur 3, blev lipidniveauer i primære hepatocytter induceret af høj glucose plus insulin i 24 timer. De akkumulerede lipiddråber blev bestemt ved Oil Red O-farvning (figur 3A), og den kvantitative lipid analyse blev efterfølgende anvendt til at måle det triglycerid og cholesterol i hepatocytter (figur 3B). Baseret på dennemodel, kan virkningerne af genetisk modificering eller medicinsk behandling på lipid homeostase i hepatocytter undersøges på en effektiv og hurtig måde.
Figur 1. højt fedtindhold, højt saccharose diæt (HFHS) forøger fedme og leversteatose i mus. Otte uger gamle C57BL / 6-mus blev fodret med en chow eller HFHS diæt i 8 uger og 16 uger hhv. (A) Kropsvægt af mus. (B) Kropssammensætningen af musene. (C - D) repræsentant magnetisk resonans-billede af musen og leveren. Det hvide område i gråskalabilledet angiver fedt, mens det røde område i pseudo-farve indikerer fedt. Dataene er vist som middelværdien ± standardfejlen (SEM), n = 5-8. * P <0,05 versus foderdiæt-fodret mus. Fejlsøjlerne repræsenterer SEM. Statistical-analyse blev udført under anvendelse af en uparret, to-halet t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Analyse af leversteatose i mus fodret med en HFHS kost. Otte uger gamle C57BL / 6-mus blev fodret med en chow eller HFHS diæt i 8 uger og 16 uger hhv. (A) repræsentative grov morfologi enterocoelia og leveren. (B) Repræsentant H & E og Oil Red O-farvning (skala søjler: 50 pm). Oil Red O pletter fedt og neutralt fedt, og røde punkter angiver lipiddråber akkumuleret i hepatocytter. (C) Total triglycerid og kolesterol i leveren lipid ekstraktioner under anvendelse af chloroform / methanol metode. Dataene blev normaliseret til than levervægt, og er repræsenteret som gennemsnittet ± standardfejlen (SEM), n = 5-8. * P <0,05 versus musene fodret med chow kost. Fejlsøjlerne repræsenterer SEM. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af en uparret, to-halet t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. leversteatose induceres i mus primære hepatocytter udsat for høj glucose plus insulin. (A) Oil Red O-farvning af dyrkede primære hepatocytter behandlet uden eller med glucose og insulin, som angivet (skala stænger: 50 um). (B) Triglycerid niveau i de primære hepatocytter blev målt og normaliseret til koncentrationen protein. Dataene er repræsenteret som gennemsnittet ±standardfejlen (SEM). * P <0,05 versus kontrolgruppen. Fejlsøjlerne repræsenterer SEM. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af en uparret, to-halet t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NAFLD er en serie af progressive leversygdomme, der er forbundet med metaboliske syndrom, fedme, insulinresistens, eller type 2-diabetes mellitus (T2DM) 11. Kendetegnende for NAFLD er steatosis, ophobning af lipid i hepatocytter. Her er et spektrum af metoder præsenteret for karakterisere fænotyper og parametre for leversteatose hjælp DIO mus og mus primære hepatocytter. Denne procedure kunne være nyttigt at belyse de molekylære mekanismer i NAFLD og andre relaterede stofskiftesygdomme.
Kombinere in vivo og in vitro-analyser, disse metoder giver omfattende analyser og vurderinger af leversteatose. I øjeblikket dyremodeller af NAFLD består hovedsageligt af genetiske og ernæringsmæssige modeller. Den HFHS kost anvendt her er beregnet til at efterligne den moderne kost stil og er tilstrækkelig til at inducere fedme og hepatisk steatose hos mus. Men for at undersøge de molekylære mekanismer i udvikpment af lipid deregulering, celle-baserede assay indeholder indlysende fordele i forhold til dyr undersøgelse, herunder let manipulation ved genetisk mutation eller farmakologisk behandling, samt relativt lave omkostninger og tid forpligtelser. For at generere leversteatose i muse primære hepatocytter, er høje koncentrationer af glucose plus insulin anvendes til induktion lipidakkumulering, som er en hidtil ukendt og effektiv in vitro model til efterligning in vivo kost-induceret hyperglykæmi og hyperinsulinæmi. Denne behandling er også anvendelig til andre hepatiske cellelinjer, såsom HepG2-celler. Eftersom genetisk modificerede hepatocytter er tilgængelige for en række farmaceutiske behandlinger, in vitro steatotic model beskrives her overvinder begrænsningen og tidskrævende trin til generering af dyremodeller under anvendelse GAIN- og tab-af-funktion tilgange.
Kropssammensætning analyser, herunder NMR og MRI, giver de ikke-invasive og realtidsdata omlipid i hele kroppen og leveren. Det er en non-invasiv, tidsbesparende, visualiserbar, og semi-kvalitativ måling. Desuden kan nøjagtigheden af kropssammensætningen analyser blive kraftigt forbedret ved at kombinere andre histologiske og biokemiske målinger. Det er kritisk og nødvendigt at bestemme leversteatose in vivo og in vitro under anvendelse H & E-farvning, Oil Red O-farvning, og lipid måling, som alle er guld-standard målinger til diagnosticering og klassificering leversteatose.
En af begrænsningerne ved den foreliggende metode er dens manglende evne til at måle inflammation og kollagendeponering når simple steatosis udvikler sig til hepatitis, fibrose, og i sidste ende, skrumpelever og leverkræft. Eftersom kost-induceret fede mus har en lav risiko for udvikling af NASH, den nuværende protokol er tilstrækkeligt at vurdere leversteatose i DIO mus. Men i tilstanden af NASH, andre biokemiske målinger, såsom plasma alanine aminotransferase (ALT) og aspartat aminotransferase (AST) niveauer, bør udnyttes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.270.930, 31.471.129, og 31.671.224), og de hundrede talenter Program af det kinesiske Academy of Sciences (2013OHTP04) til YL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1 mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet (HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
