Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

تحليل الأمثل ل doi: 10.3791/55178 Published: March 11, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

السمنة مشكلة صحية المزدهرة في البلدان المتقدمة والنامية. تم الإبلاغ عن أن تكون واحدة من شروط التعايش كثيرا ما يرتبط مع غير الكحولي مرض الكبد الدهني (NAFLD)، مع انتشار تتراوح بين 30 و 100 في المئة في المرضى الذين يعانون NAFLD 1. ويرجع ذلك إلى ارتباط قوي بين الكبد الدهني والسمنة، وتستخدم يعانون من السمنة المفرطة (ديو) نماذج الماوس التي يسببها النظام الغذائي على نطاق واسع لدراسة الآليات الجزيئية المعقدة المرتبطة تطوير NAFLD 6. تشحم الكبد هو أول مرحلة من NAFLD، وأنها يمكن أن تتطور إلى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (ناش)، تليف الكبد، وفي نهاية المطاف، سرطان الكبد 7. ولذلك، فإن الهدف العام من هذه الطريقة لتوليد الحيوانات والخلايا نماذج من الظروف steatotic الكبدية والعلاقات العامةبروتوكولات وإجراءات تفصيلية أوفيد لقياس الدهون كفاءة ودقة. هذه النماذج والقياسات هي مفيدة أيضا للتحقيق في الاضطرابات الأيضية الأخرى، مثل مقاومة الأنسولين وداء السكري من النوع 2.

كما تم تحديد السمنة لتكون واحدة من عوامل الخطر الرئيسية للNAFLD، ونسبة عالية من الدهون، ويستخدم عالية السكروز النظام الغذائي (HFHS) أن يقلد على النمط الغربي عالية من الدهون نظام غذائي للحث على السمنة في الفئران. وفي وقت لاحق، ودرجة تشحم الكبد يمكن تقييم باستخدام أساليب مختلفة. أولا، ووزن الجسم وتحليلها وتكوين هيئة من الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تظهر تراكم الدهون خلال فترة الرضاعة. كتلة الدهون والكتلة الخالية من الدهن يمكن قياسها بطريقة غير الغازية وفي الوقت الحقيقي.

وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لإظهار كل من الجسم كله، وتوزيع الكبد من الدهون. إشارة الرمادي لتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن تحويلها إلى مقروءا الصورة الزائفة اللون، وشدةوالرمادي واللون هو-نصفي للقياس الكمي. توفر هذه التقنية مزايا فريدة لقياس تراكم الدهون في الحيوانات الحية. ثانيا، التحليل النسيجي للكبد هو الأسلوب الأكثر شيوعا لتحديد تشحم الكبد. يوفر الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ المعلومات النسيجية، مثل التشكل الكبدية وتسلل بلعم، في حين يظهر النفط الأحمر يا تلطيخ حجم وموضع من قطرات الدهون في خلايا الكبد. ثالثا، تحليل محتوى الدهون باستخدام استخراج الكلوروفورم / الميثانول هو القياس الدقيق وكمية من الدهون الكبدية. ويمكن قياس مجموع مستويات الدهون الثلاثية والكوليسترول مع أساليب الكيمياء الحيوية. الأهم من ذلك، تحليل استخلاص الدهون والزيوت الأحمر يا تلطيخ يمكن أن تستخدم أيضا في معالجة جينيا أو صيدلانيا تعامل خلايا الكبد.

وميزة هذا الأسلوب هو استخدامه من النهج الأمثل متعددة لتوليد نماذج steatotic الكبديةولتوصيف شامل الظواهر سواء في المجراة في المختبر. يمكن للنماذج DIO الماوس ألخص في علم الأمراض والتمثيل الغذائي الظواهر من مرض الكبد الدهني البشري. المعلمات الأيضية الأخرى في البشر يمكن تكرارها في هذا النموذج، وكذلك 8. توليد نموذج الكبدية steatotic ردا على ارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين هو فعالة ومفيدة، ويتغلب على الحد من عمل الماوس مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. معا، وهذه الأساليب هي كافية وضرورية لدراسة الخلل الدهون الكبدية ومقاومة الأنسولين خلال الحمولة الزائدة من المغذيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية الحيوان من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية في معهد علوم التغذية والمعاهد شنغهاي للعلوم البيولوجية، الأكاديمية الصينية للعلوم (شنغهاي، الصين).

1. DIO ماوس نموذج

  1. التغذية HFHS
    1. تغذية الذكور البالغ من العمر ثمانية أسابيع C57BL / 6 الفئران مع HFHS التي تحتوي على 40 سعرة حرارية٪ من الدهون و 40 سعر حراري٪ سكروز. إيوائهم في 12 ساعة الظروف دورة الظلام الخفيفة.
    2. الحفاظ على الفئران في HFHS حالة اتباع نظام غذائي الرضاعة لمدة أربعة إلى ستة عشر أسبوعا. تحقق الأسبوعية وزن الجسم.
  2. تحليل تكوين الجسم وتحليل الصور الزائفة اللون
    1. تعرض الفئران لتحليل الجسم تكوين محلل.
      1. تأمين واعية، والفئران لا تخدير في أنبوب بلاستيكي في. قياس الدهون في الجسم كتلة، كتلة العجاف، والسوائل باستخدام نظام الرنين المغناطيسي النووي، كما هو موضح سابقا (2).
    2. مسح الجسم كله من كل فأر باستخدام نظام التصوير بالرنين المغناطيسي.
      1. تخدير الفئران مع 1٪ آفيرتين عن طريق الحقن داخل الصفاق (25 ميكرولتر / ز) وإجراء تحليل التصوير في أنابيب زجاجية المتخصصة.
        ملاحظة: عملية التصوير يستمر لمدة ما يقرب من 0.5 ساعة لكل الماوس. عندما يتم الانتهاء من قياس، وعودة الفئران إلى قفص.
    3. مسح أجسام كاملة من الفئران في ظهري، والمتوسطة، والطبقات البطنية. فحص الكبد في الاتجاه الرأسي. استخدام 0.55 T المغناطيس والمعلمات فعال التالية: K مساحة = 192 × 256 ميكرون، سمك الباب = 3 مم، TE = 14.8 مللي، TR = 400 مللي ثانية، FOVRead = 100 ملم، FOVPhase = 100 مم، وعدد من مسح = 8. المسح الضوئي باستخدام حالة المغناطيسية نفسها لجميع الفئات من الفئران.
    4. خريطة صورة رمادية على صورة شبه لون وفقا لشدة إشارة 9.
  3. القتل الرحيم الماوس
    1. تعقيم dissectiأدوات نانوغرام، مثل ملقط ومقص.
    2. صب الأيزوفلورين كافية على منشفة ورقية، والسماح للالأيزوفلورين تتطاير في وعاء زجاجي. تأكد من أن الفئران يصرح باستخدامها من قبل الأيزوفلورين.
    3. إصلاح الفئران على طاولة العمليات. رش كل البطن مع 75٪ من الإيثانول، وجعل شق في الأدمة من عملية الخنجري باستخدام مقص، وتمزق الأدمة بالطول من خلال خط الوسط مع يد لفضح الصفاق.
    4. المشبك عملية الخنجري مع ملقط وقطع breadthwise البريتوني من خلال الجزء السفلي من الأضلاع لفضح الأحشاء.
    5. جمع الدم في أنابيب المغلفة EDTA من ثقب في القلب.
    6. قطع الحجاب الحاجز على طول الكبد وإزالة بعناية الكبد من enterocoelia باستخدام مقص غرامة. قطع ثلاث قطع من أنسجة الكبد للقياسات الدهون التالية: أ) 6 × 3 × 3 مم ل H & E تلطيخ، ب) 6 × 3 × 3 مم للنفط الأحمر يا تلطيخ، وج) 20-40 ملغ من الكبد لالكلوروفورم / استخراج الميثانول.
  4. H & E تلطيخ
    1. إصلاح الكبد في 4٪ مخزنة الفوسفات الفورمالين خلات عند 4 درجات مئوية خلال الليل ثم تضمين ذلك في شمع البارافين.
    2. قطع أقسام البارافين (5 ميكرون)، وجبل لهم على الشرائح الزجاجية لH & E تلطيخ، كما هو موضح سابقا 10.
  5. النفط الأحمر يا تلطيخ
    1. إعداد ريجنت
      1. يعد حل العاملة النفط الأحمر O مع 10٪ من الفورمالين، 60٪ الأيزوبروبانول، الهيماتوكسيلين، والجلسرين هلام. حل 0.5 غرام من زيت أحمر يا مسحوق مع 100 مل من الأيزوبروبانول وتسخينها في C حمام 60 درجة لجعل 0.5٪ محلول المخزون.
      2. المخفف بالماء المقطر مزدوجة ([ده 2 O) في نسبة 3: 2 (3 مل من محلول المخزون و 2 مل من ده 2 O). تصفية حل العاملة واسمحوا الوقوف لمدة 10 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    2. تضمين الكبد في درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) مركب في ا ف بlastic مربع التضمين. تجميده عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قطع عليه إلى أقسام 8 ميكرومتر في مشراح التجميد، تركيب الأنسجة على شريحة، ووضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    3. ضع منشفة ورقية في الجزء السفلي من حوض استحمام في تلطيخ وصب كمية صغيرة من 10٪ من الفورمالين لتبلل منشفة ورقية. ضع الشريحة في حوض تلطيخ وإصلاح الأجزاء المجمدة في أبخرة الفورمالدهايد لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. تراجع الشرائح في 60٪ الأيزوبروبانول في حوض تلطيخ لمدة 3 ق. التكرار مرة واحدة.
    5. إضافة بضع قطرات من محلول تعمل النفط الأحمر O إلى الشريحة لتغطية جميع الأنسجة واحتضان لمدة 15 دقيقة. حماية الأنسجة من الضوء في درجة حرارة الغرفة.
    6. شطف الشريحة في الجديد 60٪ الأيزوبروبانول في حوض تلطيخ لمدة 3 ق. كرر مرتين.
    7. شطف بلطف الشريحة من خلال الماء المقطر مرتين وإزالة المياه في جميع أنحاء الأنسجة. تأكد من عدم تجفيف الأنسجة.
    8. ضع الشريحة في الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة وشطف بلطف بماء الصنبور لمدة 5-10دقيقة. شطف بلطف الشريحة في الماء المقطر مرتين والحفاظ على ذلك في الماء المقطر حتى على استعداد لوضع على ساترة.
    9. تسخين هلام الجلسرين في الميكروويف ووضع عدة قطرات على رأس الأنسجة. وضع بلطف ساترة على رأس والحرص على عدم تشكيل فقاعات.
    10. مراقبة وصمة عار تحت المجهر والتقاط الصور المميزة باستخدام 20X 40X والأهداف.
  6. قياس نسبة الدهون في الكبد
    1. وضع أنسجة الكبد تشريح في أنبوب جديد للطرد المركزي 2-مل البلاستيك. التجانس في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع الخالط ونقل المحللة إلى أنبوب جديد زجاج 15 مل.
    2. إضافة 5 مل من الكلوروفورم / الميثانول (2: 1، ت / ت) حل، دوامة الخليط بقوة لمدة 1 دقيقة، واسمحوا الوقوف لمدة 2 ساعة على الجليد.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 1650 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. يجب فصل الخليط إلى 3 طبقات: الطبقة العليا والميثانول، والقرص البروتين المتوسطة، والكلوروفورم السفلي والدهون.
    4. تران SFER مرحلة القاع في أنبوبة زجاجية جديدة باستخدام الزجاج باستور الماصة. ليست هناك حاجة للحصول على كل قطرة من جزء السفلي. تعيين أنبوب جانبا على الجليد.
    5. إضافة 600 ميكرولتر من 4 مم MgCl 2 و 1.5 مل من الكلوروفورم إلى جزء طاف المتبقية في الأنبوب السابق ودوامة بقوة. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 1650 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    6. الجمع بين مرحلة القاع مع أول أنبوب مرحلة القاع باستخدام الماصة باستور. تجاهل الطبقات العليا والمتوسطة.
    7. تتبخر الكلوروفورم تحت غاز النيتروجين في C حمام 37 درجة. غسل الجانبين من أنابيب الزجاج بدقة مع 200 ميكرولتر من 1٪ تريتون X-100 / الكلوروفورم (ت / ت). تتبخر تحت غاز النيتروجين. حل الدهون مع 200 ميكرولتر من ده 2 O ودوامة جيدا لجعل مستحلب النهائي.
    8. قياس إجمالي الدهون الثلاثية (TG) والكولسترول (TC) مستويات باستخدام الدهون الثلاثية أو الكوليسترول عدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعةXREF "> 3.
      ملاحظة: القيم الدهون هي طبيعية لتلك التي تركيزات البروتين في جناسة الأولي، على النحو الذي يحدده البروتين الكمي 3.

2. الابتدائية ماوس الكبدية نموذج

  1. عزل خلايا الكبد الأولية الماوس
    1. تخدير كل فأر مع هيدرات كلورال 6٪ (10 ميكرولتر / ز البريتونى).
    2. عزل خلايا الكبد الأولية، كما هو موضح سابقا (10). تنمو الخلايا على coverslips الزجاج المغلفة الكولاجين في لوحة 6 جيدا للنفط الأحمر يا تلطيخ. لاستخراج الدهن، البذور الخلايا على 10 سم صحن الثقافة خلية 10.
  2. العلاج بالخلايا والنفط الأحمر يا تلطيخ
    1. استبدال المتوسطة مع 2 مل من المتوسط ​​الجوع واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. علاج مع 30 ملي الجلوكوز والأنسولين 100 نانومتر. احتضان في 37 درجة مئوية حاضنة الثقافة لمدة 24 ساعة.
    2. نضح في المتوسط. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني ودوامة بلطف لشطف المتوسطة. التكرار مرة واحدة.
    3. إصلاح ساترة إلى الشريحة مع الشريط المطاطي. كشف الخلايا الملتصقة على السطح الخارجي. أداء تلطيخ النفط الأحمر يا كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.5).
      ملاحظة: مستويات القاعدية من تراكم الدهون وحفز مع ارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى العلاج الأنسولين بعد التجويع المصل. وتصور قطرات الدهن بالزيت الأحمر يا تلطيخ.
  3. قياس نسبة الدهون
    1. علاج خلايا الكبد مع ارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين في نفسه شرط (الخطوة 2.2.1). إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني على كل طبق خلية ثقافة 10 سم. كشط الخلايا وحصادها في أنابيب الزجاج 15 مل الجديدة، والتي يتم نقل aliquots من 100 ميكرولتر إلى الطازج أنابيب 1.5 مل لتقدير البروتين.
    2. إضافة 4 مل من الكلوروفورم / ميثانول (2: 1، ت / ت) إلى 900 ميكرولتر المتبقية من الخلايا. يصوتن لالتقريبية 20 الصفافير ثم دوامة بقوة على إطلاق سراحالدهون في الخلايا. احتضان الخليط على الجليد لمدة 2 ساعة. تنفيذ عملية الاستخراج الدهون (الخطوة 1.6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كما هو مبين في الشكل 1A، تم زيادة وزن جسم الفأر إلى 45 ± 1.2 غرام بعد 16 أسبوعا من HFHS التغذية، وهو ما يقرب من 1.5 أضعاف أعلى من مجموعة التغذية الحمية تشاو. تكوين هيئة NMR تحليلات تظهر كتلة الدهون والكتلة الخالية من الدهن من الفئران يشار إلى (الشكل 1B). تم تحديد توزيعات الدهون في الجسم كله ومن الكبد عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي، وأظهرت الصور التمثيلية الزائفة اللون في العيش، والفئران واعية في الشكل 1C-D. تم قياس وزن الجسم والجسم تكوينها وتصور أثناء عملية التغذية الحمية HFHS.

لمزيد من تشريح الظواهر steatotic، تمت التضحية الفئران ويقوم على التحليل النسيجي الكبد. وترد تلطيخ H & E وزيت الأحمر يا للكبد في الشكل 2A-B، التي قطرات الدهون تنمو أكبر وتحتل المساحات في معظمخلايا الكبد بعد 4 أشهر من HFHS التغذية الحمية. هو تصور درجة تشحم الكبد من HFHS النظام الغذائي بتغذية الفئران بسهولة عن طريق مقارنة مع تشاو الفئران التي تتغذى على النظام الغذائي. تم قياس المكونات الرئيسية من الدهون، مثل الدهون الثلاثية والكوليسترول، مع استخراج الكلوروفورم / الميثانول (الشكل 2C). في الفئران DIO، تسبب الزائد المغذيات الزائدة تراكم الدهون الثلاثية غير طبيعي في الكبد. مع بيانات من الرنين المغناطيسي، التصوير بالرنين المغناطيسي، والتحليل النسيجي، ودرجة ترسب الدهون يمكن تحديد بكفاءة ودقة.

كما هو مبين في الشكل (3)، وقد يتسبب في مستويات الدهون في خلايا الكبد الأولية من خلال ارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين لمدة 24 ساعة. تم تحديد قطرات الدهون التي تراكمت النفط الأحمر يا تلطيخ (الشكل 3A)، وكان يستخدم في تحليل الدهون الكمي في وقت لاحق لقياس مستويات الدهون الثلاثية والكولسترول في خلايا الكبد (الشكل 3B). بناء على هذاالنموذج، وآثار التعديل الوراثي أو العلاج الدوائى على توازن الدهون في خلايا الكبد يمكن أن يتم التحقيق بطريقة فعالة وسريعة.

الشكل 2
الشكل 1. عالية من الدهون، واتباع نظام غذائي عالية السكروز (HFHS) يزيد السمنة وتشحم الكبد في الفئران. C57BL الذكور من العمر ثمانية أسابيع / غذيت 6 الفئران على طعام أو HFHS النظام الغذائي لمدة 8 أسابيع و 16 أسبوعا، على التوالي. الوزن (A) الجسم من الفئران. تكوين (ب) الجسم من الفئران. (C - D) صورة الممثل الرنين المغناطيسي من الفأرة والكبد. المنطقة البيضاء في الصورة على نطاق والرمادي وتشير الدهون، في حين أن المنطقة الحمراء في الصورة الزائفة اللون تدل على الدهون. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري (SEM)، ن = 5-8. * ف <0.05 مقابل طعام تتغذى غذاء الفئران. تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة. STATISTICAأجري تحليل ل باستخدام اختبار (ت) لأونبايريد، ثنائي الطرف الطالب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل تشحم الكبد في الفئران التي تغذت على نظام غذائي HFHS. C57BL الذكور من العمر ثمانية أسابيع / غذيت 6 الفئران على طعام أو HFHS النظام الغذائي لمدة 8 أسابيع و 16 أسبوعا، على التوالي. (أ) التشكل الإجمالي الممثل من enterocoelia والكبد. (ب) الممثل H & E وزيت الأحمر يا تلطيخ (الحانات نطاق و: 50 ميكرون). النفط الأحمر يا بقع الدهون والدهون محايد، ونقاط حمراء تشير إلى قطرات الدهون المتراكمة في خلايا الكبد. (C) مجموع الدهون الثلاثية والكوليسترول مستويات الاستخراج الدهون في الكبد باستخدام طريقة الكلوروفورم / الميثانول. تم تطبيع البيانات إلى tكان وزن الكبد، وتتمثل كمتوسط ​​± الخطأ المعياري (SEM)، ن = 5-8. * ف <0.05 مقابل الفئران التي أطعمت غذاء طعام. تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار (ت) لأونبايريد، ثنائي الطرف الطالب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
هو فعل الشكل 3. كبدي تنكس دهني في خلايا الكبد الماوس الابتدائية تتعرض لارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين. (A) زيت الأحمر يا تلطيخ للخلايا الكبد الأولية مثقف علاجها بدون أو مع الجلوكوز والأنسولين، كما هو مبين (الحانات نطاق و: 50 ميكرون). وقد تم قياس (ب) مستوى الدهون الثلاثية في خلايا الكبد الأولية وتطبيع تركيز البروتين. يتم تمثيل البيانات مثل ± متوسطالخطأ المعياري (SEM). * ف <0.05 مقابل السيطرة على المجموعة. تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار (ت) لأونبايريد، ثنائي الطرف الطالب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NAFLD هو عبارة عن سلسلة من أمراض الكبد التقدمية التي ترتبط مع متلازمة التمثيل الغذائي، والسمنة، ومقاومة الأنسولين، أو من النوع 2 من مرض السكري (T2DM) 11. السمة المميزة لNAFLD هو تنكس دهني، وتراكم الدهون في خلايا الكبد. هنا، يتم تقديم مجموعة متنوعة من الأساليب لتوصيف الظواهر والمعلمات من تشحم الكبد باستخدام الفئران ديو وخلايا الكبد الماوس الابتدائي. هذا الإجراء يمكن أن تكون مفيدة لتوضيح الآليات الجزيئية للNAFLD وغيرها من الأمراض الاستقلابية ذات الصلة.

الجمع بين المجراة في المقايسات المختبر، وتوفر هذه الأساليب التحليلات والتقييمات من تشحم الكبد شاملة. حاليا، نماذج حيوانية من NAFLD تتكون أساسا من النماذج الوراثية والغذائية. ويهدف النظام الغذائي HFHS المستخدمة هنا لتقليد النمط الغذائي الحديث وغير كافية لإحداث السمنة وتشحم الكبد في الفئران. ومع ذلك، لدراسة الآليات الجزيئية في development من رفع القيود الدهون، وفحص خلية القاعدة يحتوي على مزايا واضحة على دراسة أجريت على الحيوانات، بما في ذلك التلاعب بسهولة عن طريق طفرة جينية أو العلاج الدوائي، وكذلك تكاليف منخفضة نسبيا والالتزامات الوقت. لتوليد تشحم الكبد في خلايا الكبد الأولية الماوس، يتم استخدام تركيزات عالية من الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين للحث على تراكم الدهون، وهو رواية وكفاءة في نموذج المختبر لتقليد في الجسم الحي ارتفاع السكر في الدم الناجم عن النظام الغذائي وفرط. وهذا العلاج هو أيضا تنطبق على خطوط الخلايا الكبدية الأخرى، مثل الخلايا HepG2. وبالنظر إلى أن خلايا الكبد المعدلة وراثيا يمكن الوصول إلى مجموعة متنوعة من العلاجات الدوائية، في المختبر نموذج steatotic الموصوفة هنا يتغلب على الحد منها، والخطوات تستغرق وقتا طويلا لتوليد نماذج حيوانية باستخدام gain- والنهج الخسارة من وظيفة.

يحلل تكوين الجسم، بما في ذلك الرنين المغناطيسي والتصوير بالرنين المغناطيسي، وتوفير البيانات غير الغازية وفي الوقت الحقيقي علىالدهون في الجسم كله والكبد. ومن غير الغازية، وتوفير الوقت، visualizable، وقياس شبه النوعي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن دقة التحليلات تكوين الجسم يمكن أن تحسن كثيرا من خلال الجمع بين القياسات النسيجية والكيميائية الحيوية الأخرى. فمن الأهمية بمكان وضروري لتحديد تشحم الكبد في الجسم الحي في المختبر باستخدام H & E تلطيخ، النفط الأحمر يا تلطيخ، وقياس الدهون، وكلها قياسات الذهب القياسية لتشخيص وتصنيف تشحم الكبد.

واحد من أوجه القصور في المنهج الحالي هو عدم قدرتها على قياس الالتهاب وترسب الكولاجين عندما تقدم تنكس دهني بسيط لالتهاب الكبد، تليف، وفي نهاية المطاف، تليف الكبد وسرطان الكبد. وبالنظر إلى أن الفئران السمينة التي يسببها النظام الغذائي لديها منخفضة المخاطر لتطوير ناش، البروتوكول الحالي يكفي لتقييم تشحم الكبد في الفئران DIO. ومع ذلك، في حالة ناش، وغيرها من القياسات البيوكيميائية، مثل ALANI البلازماالألانين شمال شرق (ALT) ومستويات الألانين اسبارتاتي (AST)، وينبغي أن تستخدم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

التمويل: وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81270930، 31471129، 31671224 و) ومئة وزنة البرنامج التابع للأكاديمية الصينية للعلوم (2013OHTP04) إلى YL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound SAKURA 4583
Oil Red O Sigma O0625-25G
Infinity Triglycerides kit Fisher Scientific TR22421
Infinity Cholesterol kit Fisher Scientific TR13421
Collagen type I, Rat tail Millipore 08-115
DMEM (low glucose) Invitrogen 11885-092
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 10099141
PBS cellgro R21-040-CVR
HBSS cellgro 20-021-CV
Insulin TOCRIS Bioscience 3435 dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose Sigma G8270-100G
Microscope Olympus BX53
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
10 cm cell culture dish Corning 420167
6-well-plate Corning 3516
BCA assay Beyotime P0010
Nuclear Magnetic Resonance Niumag technology MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS) Research Diets D12327

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angulo, P. Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346, (16), 1221-1231 (2002).
  2. Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65, (7), 1904-1915 (2016).
  3. Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13, (4), 376-388 (2011).
  4. Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146, (2), 539-549 (2014).
  5. Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3, (2), 87-98 (2006).
  6. Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116, (6), 1494-1505 (2006).
  7. Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332, (6037), 1519-1523 (2011).
  8. Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8, (1), 35-44 (2011).
  9. Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35, (38), 10058-10069 (2014).
  10. Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64, (2), 425-438 (2016).
  11. Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (6), 330-344 (2013).
تحليل الأمثل ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; كبدي تشحم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).More

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter